Stafülokokkide biokile kasvatamise ja eraldamise protokoll

Standardiseeritud meetodid on usaldusväärsete uurimistulemuste jaoks hädavajalikud. Siit leiate stafülokokkide biokilede kasvatamise ja eraldamise protokolli. See protokoll keskendub sujuvamaks muudetud suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamisele, kasutades mitme süvendiga plaatide sonikaatorit UIP400MTP biokilede tõhusaks ja suure läbilaskevõimega eraldamiseks 96-süvendilistel plaatidel. Protokoll sisaldab ka biokile kasvatamise, pesemise ja visualiseerimise põhietappe, keskendudes varieeruvuse minimeerimisele ja korratavuse tagamisele.

Stafülokokkide biokile ja antibiootikumide uuringud

Stafülokokkide biokiled mängivad püsivate infektsioonide puhul kriitilist rolli, kuna need on vastupidavad antibiootikumidele ja immuunvastustele. Biokile teke loob bakteritele kaitsva keskkonna, mistõttu on infektsioone raske ravida. Biokilede uuringud keskenduvad sageli nende tekke, käitumise ja mikroobivastaste ainete suhtes tundlikkuse mõistmisele, rõhuasetusega suure läbilaskevõimega meetoditel, mis muudavad katsetöövood sujuvamaks.
Mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP pakub biokilede uurimisel olulist eelist, võimaldades biokilesid 96-süvendilistelt plaatidelt kiiresti ja tõhusalt eraldada. See seade annab kõigile süvenditele ühtlast ultraheli energiat, tagades püsivad tulemused ja minimeerides samal ajal varieeruvuse.

Stafülokokkide biokile kasvatamise ja eraldamise protokoll

Allpool juhendame teid samm-sammult stafülokokkide biokile kasvatamise ja eraldamise protsessis. Näitliku analüütilise etapina näitame, kuidas kasvatatud biomassi kristallvioletiga värvimise abil spektrofotomeetriliselt kvantifitseerida.

Stafülokokkide biokile kasvatamine

Vajalikud materjalid:

• Steriilsed lameda põhjaga 96-süvendilised polüstüreenist koekultuuriks töödeldud mikrotiiterplaadid kaantega
• Trüptiline sojapuljong (TSB) 0,25% glükoosiga
• Bioohutuskapp

Sammud:

1. Looge bioohutuskapis steriilne töökeskkond, et saastumist minimeerida.
2. Lisage mikrotiiterplaadi süvenditesse TSB-d, mis sisaldab 0,25% glükoosi. Glükoosita TSB üldjuhul biokile teket ei toeta ja seda tuleks kasutada ainult kontrollina, kui see on vajalik.
3. Inokuleerige süvendid bakteritüvedega, mis on ette valmistatud allpool kirjeldatud viisil:
4. Valmistage ette bakterisuspensioonid, tagades, et olemasolevaid rakuklastreid ei ole, homogeniseerides suspensioonid ultraheli töötlusega või lõhkudes klastrid 23-gabariidise nõela ja lühikese vortexiga segamise abil.
5. Sulgege plaat selle kaanega ja inkubeerige biokile tekkeks optimaalsetes tingimustes (nt 37°C juures 24 tundi).
6. Usaldusväärsuse tagamiseks tehke katse iga bakteritüve kohta kolmes korduses (kolm süvendit tüve kohta).
7. Eraldage plaadi kohta kuus süvendit negatiivsete kontrollide jaoks. Ühel 96-süvendilisel plaadil saab testida kuni 30 tüve.

Biokile visualiseerimine ja pesemine

1. Pärast inkubeerimist eemaldage sööde ettevaatlikult, et biokilet mitte häirida.
2. Pesege iga süvendit neli korda füsioloogilise lahusega, et eemaldada planktonilised bakterid.
3. Kontrollige süvendite põhja valgete laikude suhtes, mis viitavad biokile olemasolule.

Biokile eraldamine mitme süvendiga plaatide sonikaatoriga UIP400MTP

Seadme seadistus ja parameetrid:

• Mitme süvendiga plaatide sonikaator UIP400MTP
• Töösätted: amplituud 60%, tsükliline režiim 60 sekundit SEES / 30 sekundit VÄLJAS

Sammud:

1. Asetage pestud mikrotiiterplaat UIP400MTP platvormile.
2. Sonikeerige proove soovitatud sätetega (amplituud 60%, 60 sekundit SEES, 30 sekundit VÄLJAS). Kohandage sätteid vastavalt bakteritüvele.
3. Alustage sonikeerimist, et biokile eraldada. Ultrahelilained lõhuvad biokile maatriksi ja vabastavad adhesiivsed bakterid.
4. UIP400MTP tagab ühtlase kokkupuute kõigis süvendites, et eraldamistulemused oleksid püsivad.

Analüütiline etapp: eraldatud stafülokokkide biokile biomassi kvantifitseerimine kristallvioletiga (CV)

Vajalikud materjalid:

• 0,1% kristallvioletti (CV) lahus
• 95% etanool või 30% äädikhape (lahustamiseks)
• Mikroplaadilugeja, mis suudab lugeda lainepikkusel 570 nm
• Steriilsed mikrotiitrplaadid värvimiseks

Sammud:

1. Värvimisplaadi ettevalmistamine: Kandke 100 µL eraldatud biokile suspensiooni iga ultraheliga töödeldud plaadi süvendist vastavatesse puhta steriilse 96-süvendilise mikrotiitrplaadi süvenditesse. See tagab selge ja ühtlase keskkonna värvimiseks.
2. Eraldatud biokile värvimine: Lisage igasse eraldatud biokile suspensiooni sisaldavasse süvendisse 150 µL 0,1% kristallvioletti lahust. Pipeteerige õrnalt, et biokile suspensioon ja kristallviolett seguneksid ühtlaselt.
3. Inkubeerimine: Laske plaadil toatemperatuuril 15 minutit inkubeeruda, et kristallviolett värviks biomassi tõhusalt.
4. Pesemine: Pärast inkubeerimist valage kristallvioletti lahus süvenditest ettevaatlikult välja, biomassi häirimata. Peske iga süvendit kolm korda steriilse füsioloogilise lahusega, et eemaldada seondumata värv.
5. Kuivatamine: Laske plaadil toatemperatuuril või steriilse õhuvoolu kapis õhu käes kuivada. Vältige kuumutamist, kuna see võib tulemusi muuta.
6. Lahustamine: Lisage igasse süvendisse 200 µL 95% etanooli (või 30% äädikhapet, sõltuvalt labori standardsest praktikast), et lahustada seondunud kristallviolett. Segage õrnalt pipeteerides või plaati loksutades 10 minutit toatemperatuuril.
7. Mõõtmine: Mõõtke lahustatud kristallvioletti lahuse optiline tihedus (OD) lainepikkusel 570 nm mikroplaadilugejaga.
8. Andmeanalüüs: Lahutage katsesüvendite väärtustest negatiivsete kontrollide (süvendid, milles on TSB, kuid bakteriaalset inokulaati pole) keskmine OD570 väärtus, et arvestada taustavärvumisega. Salvestage ja analüüsige andmeid.

Märkus: Tehke katse iga tingimuse kohta kolmes korduses, et tagada reprodutseeritavus. Tagage kristallvioleti ja etanooli nõuetekohane käsitsemine, järgides ohutus- ja jäätmekäitlusprotokolle.

UIP400MTP peamised eelised lühidalt:

• Suure läbilaskevõimega töötlus: Mõeldud spetsiaalselt mitme süvendiga plaatidele, võimaldades töödelda korraga mitut proovi.
• Ühtlane ultrahelijaotus: Tagab võrdse ultraheli intensiivsuse kõigis süvendites ning annab järjepidevaid tulemusi kõigi proovide puhul.
• Kasutage mis tahes standardplaati: UIP400MTP sobib mis tahes standardsete mitme süvendiga plaatide, Petri tasside ja katsutiriiulitega. Kalleid patenteeritud plaate pole vaja!
• Kasutajasõbralik liides: Lihtne seadistada ja juhtida, mistõttu on see suurepärane vahend labori tootlikkuse suurendamiseks. Programmeeritavad seaded ja automatiseerimine hõlbustavad protsessi standardimist!