Εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς όγκων με τη βοήθεια του ηχοβολισμού – πρωτόκολλο
Αυτό το πρωτόκολλο περιγράφει μια μέθοδο εκχύλισης πρωτεϊνών για καρκινικό ιστό με τη βοήθεια ηχητικού καθαρισμού, η οποία εξελίσσει την τυπική ροή εργασίας της λύσης με ουρία CPTAC με την προσθήκη ενός ελεγχόμενου βήματος ηχητικού καθαρισμού κατά τη διάρκεια της διάσπασης του ιστού. Βασιζόμενη στην καθιερωμένη στρατηγική προετοιμασίας πρωτεώματος και φωσφοπρωτεώματος βαθιάς κλίμακας CPTAC, η τροποποίηση αυτή βελτιώνει τη διάσπαση των κυττάρων και των υποκυτταρικών δομών, μειώνει το ιξώδες του δείγματος και ενισχύει την απελευθέρωση πρωτεϊνών που είναι συνήθως πιο δύσκολο να ανακτηθούν μόνο με τη λύση με ουρία, ιδίως των πρωτεϊνών που συνδέονται με μεμβράνες και των πρωτεϊνών που δεσμεύουν το DNA ή τον πυρήνα. Στην υποκείμενη μελέτη, η ροή εργασίας με τη βοήθεια του ηχητικού καθαρισμού αύξησε την ανίχνευση τόσο των πρωτεϊνών όσο και των φωσφοπεπτιδίων, διατηρώντας παράλληλα τη συμβατότητα με την ακολουθούμενη πέψη τύπου CPTAC, τη σήμανση TMT, την κλασματοποίηση, τον εμπλουτισμό με φωσφοπεπτίδια και τον αγωγό ανάλυσης LC-MS/MS.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς όγκων με τη βοήθεια ηχητικού καθαρισμού για βαθιά πρωτεομική και φωσφοπρωτεομική ανάλυση
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
υπερηχητικός καθετήρας UP200St για την εκχύλιση πρωτεϊνών στην πρωτεομική
Περιοχή εφαρμογής του πρωτοκόλλου
Χρησιμοποιήστε αυτή τη διαδικασία για:
- φρέσκος κατεψυγμένος, κρυοπολυμερισμένος ιστός όγκου
- κυτταρικά σφαιρίδια ή άλλα βιολογικά δείγματα όπου η εκχύλιση με βάση την ουρία έχει ήδη καθιερωθεί
- συνολικές ροές εργασίας πρωτεομικής και φωσφοπρωτεομικής με χρήση τρυπτικής πέψης και προαιρετικής σήμανσης TMT
Η μελέτη των Li et al. (2025) αναφέρει ότι η ροή εργασίας είναι επίσης εφαρμόσιμη σε άλλους τύπους δειγμάτων, όπως κυτταρικές σειρές, αίμα και ούρα, ωστόσο μπορεί να απαιτείται βελτιστοποίηση ανάλογα με τον τύπο του δείγματος.
Βελτιστοποιημένη ροή εργασιών προετοιμασίας δειγμάτων με εφαρμογή του βήματος ηχητικού καθαρισμού. Η βελτιστοποιημένη ροή εργασίας και ο πειραματικός σχεδιασμός βασίζονται στο πρωτόκολλο προετοιμασίας δειγμάτων CPTAC για συνολική πρωτεομική και φωσφοπρωτεομική ανάλυση.
Μελέτη και σχήμα: ©Li et al., 2025
Αρχή λειτουργίας
Η αρχική μελέτη πρόσθεσε τον ηχητικό καθαρισμό στην τυπική ροή εργασίας της λύσης με ουρία CPTAC και διαπίστωσε βελτιωμένη ανίχνευση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις μεμβράνες και τους πυρήνες. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι οι παράμετροι του ηχητικού καθαρισμού πρέπει να ρυθμιστούν λεπτομερώς όσον αφορά το μέγεθος/συγκέντρωση του δείγματος – επιλέγοντας το μέγεθος του ηχοβολέα, την εισερχόμενη ενέργεια και το χρόνο των παλμών.
Για παράδειγμα, για τα Hielscher UP200Ht και UP200St, αυτό σημαίνει:
- χρησιμοποιεί το πλάτος και τον τρόπο παλμού ως κύριες μεταβλητές ελέγχου
- να διατηρείτε τα δείγματα κρύα καθ' όλη τη διάρκεια (π.χ. σε πάγο)
- ξεκινήστε με συντηρητικές ρυθμίσεις
- βελτιστοποίηση σε σχέση με τη σαφήνεια του δείγματος, τη θερμοκρασία, την απόδοση πρωτεϊνών και την ποιότητα των πεπτιδίων στα επόμενα στάδια
Και τα δύο μοντέλα ηχογεννητριών Hielscher 200 watts UP200Ht και UP200St έχουν σχεδιαστεί για μικρούς και μεσαίους όγκους δειγμάτων, με ρυθμιζόμενες ρυθμίσεις πλάτους και παλμών- και οι δύο ομογενοποιητές υπερήχων παρέχουν ψηφιακό έλεγχο με οθόνη αφής για ακριβή ρύθμιση των παραμέτρων, αυτόματη καταγραφή δεδομένων, συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας, τηλεχειρισμό, φωτισμό του δείγματος.
Αντιδραστήρια για την εκχύλιση πρωτεϊνών με τη βοήθεια του ηχοβολισμού
Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ουρίας
Προετοιμάστε το φρέσκο αμέσως πριν από τη χρήση:
- 8 M ουρία
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8,0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/mL απροτινίνη
- 10 µg/mL λευπεπτίνη
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 μΜ PUGNAc
- Κοκτέιλ αναστολέων φωσφατάσης 2, 1:100 (v/v)
- Κοκτέιλ αναστολέων φωσφατάσης 3, 1:100 (v/v)
Η ουρία πρέπει να είναι πλήρως διαλυμένη πριν από την προσθήκη πρόσθετων ουσιών- οι αναστολείς πρέπει να προστίθενται αμέσως πριν από τη χρήση- το ρυθμιστικό διάλυμα πρέπει να διατηρείται σε πάγο- και συνιστάται ανακάτεμα και όχι έντονη ανατάραξη μετά την προσθήκη πρόσθετων ουσιών.
Πρόσθετα αντιδραστήρια:
- Αντιδραστήρια ανάλυσης πρωτεϊνών BCA
- 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
- DTT
- Iodoacetamide
- LysC
- Τρυψίνη
- Μυρμηκικό οξύ
- Αντιδραστήρια TMT, εάν χρησιμοποιείται πολυπλεγμένη ποσοτική πρωτεομική
- Αντιδραστήρια IMAC, εάν πραγματοποιείται εμπλουτισμός φωσφοπεπτιδίων
Υπερηχητής UP200Ht με microtip S26d2 για την προετοιμασία του δείγματος
Εξοπλισμός για την εκχύλιση πρωτεϊνών με τη βοήθεια ηχοβολισμού
Απαιτούμενο
Συνιστώμενη επιλογή αισθητήρα
Για δείγματα γύρω στα 200-1000 μl, χρησιμοποιήστε μια ηχοβολέα μικρής διαμέτρου κατάλληλη για άμεση επεξεργασία μικρών όγκων υψηλής έντασης. Η Hielscher προσφέρει πολλαπλές διαμέτρους ηχοτροπών και οι μικρότερες διάμετροι άκρων παρέχουν μεγαλύτερη ένταση στο άκρο.
Πρακτική σημείωση: Χρησιμοποιήστε τον μικρότερο καθετήρα που παρέχει αποτελεσματική ανάμιξη χωρίς υπερβολικό αφρισμό ή επαφή με τα τοιχώματα του δοχείου.
Εάν εργάζεστε με πολλά δείγματα ταυτόχρονα, μπορείτε να εξετάσετε το ενδεχόμενο το VialTweeter Multi-Tube Sonicator VialTweeter ή τον ηχοβολέα μικροπλακών UIP400MTP!
Οδηγίες βήμα προς βήμα: Διαδικασία εκχύλισης πρωτεϊνών με υποβοήθηση από τον ήχο
A. Προ-ψύξη και προετοιμασία
- Ψύξτε τη φυγόκεντρο στους 4°C.
- Ετοιμάστε φρέσκο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ουρίας και διατηρήστε το στον πάγο.
- Τοποθετήστε το UP200Ht ή το UP200St σε μια βάση μέσα σε ένα ηχητικό περίβλημα.
- Προετοιμάστε ένα παγόλουτρο αρκετά μεγάλο ώστε να κρατάει τα σωληνάρια δείγματος όρθια και σταθερά.
Η προετοιμασία του φρέσκου ρυθμιστικού διαλύματος και ο χειρισμός στο κρύο είναι κρίσιμοι.
B. Αρχική εκχύλιση ουρίας
- Διατηρήστε τον κρυοπολυμερισμένο ιστό σε πάγο.
- Προσθέστε 200 µL ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ουρίας ανά 50 mg υγρού ιστού.
- Vortex 5-10 s σε υψηλή ταχύτητα.
- Επώαση 15 λεπτά στους 4°C.
- Επαναλάβετε το βήμα vortex συν επώαση άλλη μια φορά.
- Φυγοκεντρήστε στα 20.000g για 10 λεπτά στους 4°C.
- Μεταφέρετε το λυτικό/υπερκείμενο υγρό σε καθαρό σωληνάριο χαμηλής δέσμευσης.
C. Ηχοβολισμός με χρήση UP200Ht ή UP200St
Συνθήκες εκκίνησης για τον ηχητικό καθαρισμό
- Πλάτος: έναρξη στο 20-30%
- Μήκος παλμού: 5 s ON
- Ψύξη: 2 λεπτά σε πάγο μεταξύ των παλμών
- Αριθμός κύκλων: Αριθμός κύκλων: 4 κύκλοι
- Συνολικός ενεργός χρόνος ηχομόνωσης: 20 s
- Συνολικός χρόνος επεξεργασίας, συμπεριλαμβανομένης της ψύξης: περίπου 8-10 λεπτά
Βήματα ηχητικής επεξεργασίας
- Μεταφέρετε το λυτικό διάλυμα σε σωληνάριο κατάλληλο για ηχοβολισμό. Χρησιμοποιήστε ένα στενό, λεπτότοιχο σωληνάριο που επιτρέπει καλή ανταλλαγή θερμότητας και ασφαλή εμβάπτιση του καθετήρα.
- Τοποθετήστε το σωληνάριο σε παγόλουτρο. Το έγγραφο προσδιορίζει την ψύξη κατά τη διάρκεια του ηχοβολισμού ως κρίσιμη για την αποφυγή θερμικής βλάβης.
- Βυθίστε το άκρο του αισθητήρα στο δείγμα. Κρατήστε το άκρο βυθισμένο επαρκώς για σταθερή σπηλαίωση, αλλά μην το αφήσετε να αγγίξει το τοίχωμα ή τον πυθμένα του σωλήνα.
- Εκτελέστε έναν παλμό 5 δευτερολέπτων στο αρχικό πλάτος.
- Επιστρέψτε αμέσως το δείγμα πλήρως στον πάγο για 2 λεπτά.
- Επαναλάβετε μέχρι να ολοκληρωθούν 4 κύκλοι.
- Επιθεωρήστε το λυτικό διάλυμα μετά τον κύκλο.
- Συνεχίστε μόνο αν χρειάζεται, χρησιμοποιώντας έναν επιπλέον παλμό 5 δευτερολέπτων κάθε φορά, ακολουθούμενο πάντα από πλήρη ψύξη.
- Σταματήστε μόλις το λυτικό διάλυμα γίνει πιο ομοιόμορφο και λιγότερο ελαστικό/ιξώδες.
Το τελικό σημείο είναι ένα πιο ημιδιαφανές λυσάρι που σχηματίζει σταγόνες αντί για συνεχή ιξώδη ροή. - Φυγοκεντρήστε σε περίπου 16.000g για 15 λεπτά στους 4°C.
- Μεταφέρετε το διαυγασμένο υπερκείμενο σε νέο σωληνάριο και μετρήστε τη συγκέντρωση πρωτεΐνης.
Σύγκριση της συνολικής πρωτεομικής και της φωσφοπρωτεομικής μεταξύ ηχομονωμένων και μη ηχομονωμένων δειγμάτων.
a. Αριθμός ταυτοποιημένων πρωτεϊνών (σφαιρική πρωτεομική) σε όλους τους ιστούς όγκων PDX με ή χωρίς ηχοβολισμό. β. Αριθμός ταυτοποιημένων φωσφοπεπτιδίων (εμπλουτισμός IMAC) σε όλους τους ιστούς όγκων PDX με ή χωρίς ηχοβολισμό. Μετρήθηκαν μόνο οι πρωτεΐνες και τα φωσφοπεπτίδια με λόγο αφθονίας μεγαλύτερο ή ίσο με το 25ο εκατοστημόριο. Ο λόγος αφθονίας υπολογίστηκε μεταξύ των ίδιων τύπων δειγμάτων.
Μελέτη και γραφήματα: ©Li et al., 2025
Μεταγενέστερη πέψη και ανάλυση
Μετά τον ηχητικό καθαρισμό και τη διαύγαση, προχωρήστε όπως περιγράφεται στην αρχική ροή εργασίας τύπου CPTAC:
- Αραιώστε το λυτικό διάλυμα 1:3 (v/v) με 50 mM Tris-HCl pH 8,0 για να μειώσετε την ουρία σε <2 M.
- Προσθέστε LysC σε 1 mAU ανά 50 µg πρωτεΐνης και επωάστε 2 ώρες στους 25°C.
- Προσθέστε τρυψίνη σε αναλογία 1:49 ένζυμο:υπόστρωμα (κ.β.) και πέψη κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 25°C.
- Αποσβέστε με μυρμηκικό οξύ σε τελικό επίπεδο 1%.
- Συνεχίστε την αφαλάτωση, τη σήμανση TMT, την κλασματοποίηση, τον εμπλουτισμό με φωσφοπεπτίδια και την LC-MS/MS, όπως απαιτείται.
Διαφορική έκφραση φωσφοπεπτιδίων από ΜΣ που έχουν επισημανθεί με TMT.
a. Ο βασικός υπότυπος, επισημαίνοντας ορισμένα ανθρώπινα φωσφοπεπτίδια (αρχή και τέλος πρωτεϊνικής αλληλουχίας) που ρυθμίζονται ανοδικά σε ηχογραφημένα δείγματα σε σύγκριση με μη ηχογραφημένα δείγματα. β. Ο λομίνας υπότυπος, επισημαίνοντας ορισμένα ανθρώπινα φωσφοπεπτίδια (αρχή και τέλος πρωτεϊνικής αλληλουχίας) που ρυθμίζονται ανοδικά σε ηχογραφημένα δείγματα σε σύγκριση με μη ηχογραφημένα δείγματα. γ. Εμπλουτισμένα μονοπάτια KEGG με βάση τις πρωτεΐνες των ρυθμιζόμενων φωσφοπεπτιδίων στον ηχογραφημένο βασικό υπότυπο των όγκων. δ. Εμπλουτισμένα μονοπάτια KEGG με βάση τις πρωτεΐνες των ρυθμιζόμενων φωσφοπεπτιδίων στον ηχογραφημένο luminal υπότυπο των όγκων.
Μελέτη και γραφήματα: ©Li et al., 2025
Σχεδιασμός, Κατασκευή και Συμβουλευτική – Ποιότητα Made in Germany
Hielscher υπερήχων είναι γνωστή για την υψηλότερη ποιότητα και τα πρότυπα σχεδιασμού τους. Η ευρωστία και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι σκληρές συνθήκες και τα απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από τους υπερήχους Hielscher.
Hielscher Υπέρηχοι είναι μια πιστοποιημένη εταιρεία ISO και δίνουν ιδιαίτερη έμφαση σε υψηλής απόδοσης υπερήχων που διαθέτουν state-of-the-art τεχνολογία και φιλικότητα προς το χρήστη. Φυσικά, Hielscher υπερήχων είναι CE συμβατό και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.
Υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων UIP400MTP για εξαγωγή πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης από δείγματα
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
Συχνές Ερωτήσεις
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ της εκχύλισης πρωτεϊνών από φυτικούς ιστούς και ιστούς θηλαστικών;
Η εκχύλιση πρωτεϊνών από φυτικούς ιστούς είναι συνήθως πιο δύσκολη από ό,τι από ιστούς θηλαστικών, επειδή τα φυτικά κύτταρα έχουν άκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα πλούσιο σε κυτταρίνη, άφθονους πολυσακχαρίτες, φαινολικές ενώσεις, χρωστικές ουσίες και ενεργά ενδογενή ένζυμα που μπορούν να παρεμποδίσουν τη διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών, να μολύνουν τα εκχυλίσματα ή να προωθήσουν την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών. Αντίθετα, ο ιστός των θηλαστικών δεν διαθέτει κυτταρικό τοίχωμα και είναι γενικά ευκολότερο να διασπαστεί χημικά, αν και συχνά περιέχει περισσότερα λιπίδια, εξωκυτταρική μήτρα και πρωτεάσες που μπορούν ακόμη να περιπλέξουν την εκχύλιση. Ως αποτέλεσμα, τα φυτικά πρωτόκολλα απαιτούν συνήθως ισχυρότερη μηχανική διάσπαση, άλεση σε χαμηλή θερμοκρασία και πρόσθετα όπως PVPP, αναγωγικούς παράγοντες ή καθαρισμό με βάση τη φαινόλη, ενώ ο ιστός θηλαστικών αντιμετωπίζεται συχνότερα με επιτυχία με ρυθμιστικά διαλύματα με βάση τα απορρυπαντικά όπως το RIPA ή συστήματα λύσης με βάση την ουρία. Τόσο ο φυτικός ιστός όσο και ο ιστός θηλαστικών μπορούν να λυθούν αποτελεσματικά με ηχοβολισμό!
Πώς να βελτιώσετε την εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA;
Η εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA μπορεί να βελτιωθεί βελτιστοποιώντας τόσο τη διάσπαση όσο και την προστασία του δείγματος. Τα πιο σημαντικά μέτρα είναι να διατηρείται ο ιστός και το ρυθμιστικό διάλυμα κρύα, να χρησιμοποιούνται φρεσκοπαρασκευασμένοι αναστολείς πρωτεασών και φωσφατασών, να τεμαχίζεται ή να κονιορτοποιείται ο ιστός καλά πριν από την ανάλυση, να διατηρείται κατάλληλη αναλογία ρυθμιστικού διαλύματος προς ιστό και να προστίθεται ένα βήμα μηχανικής διάσπασης, όπως ομογενοποίηση ή σύντομος ηχοβολισμός με καθετήρα για να διασπαστεί ο πυκνός ιστός και να μειωθεί το ιξώδες. Η αποτελεσματικότητα της εκχύλισης βελτιώνεται επίσης όταν τα λυτικά επωάζονται σε πάγο με διαλείπουσα ανάμιξη, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση υψηλής ταχύτητας στο ψυγείο για την απομάκρυνση των αδιάλυτων υπολειμμάτων. Για ινώδεις, πλούσιους σε λιπίδια ή ιδιαίτερα δομημένους ιστούς, η επανάληψη της εκχύλισης μία φορά ή η αύξηση του χρόνου έκθεσης στο απορρυπαντικό μπορεί να βελτιώσει την ανάκτηση, αλλά πρέπει να αποφεύγεται ο υπερβολικός ηχητικός καθαρισμός ή ο παρατεταμένος χειρισμός σε θερμοκρασία δωματίου, διότι μπορεί να μετουσιώσουν τις πρωτεΐνες ή να αυξήσουν την πρωτεόλυση.
Ποιες απαιτήσεις ασφαλείας πρέπει να τηρούνται κατά την εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους;
Πραγματοποιήστε τον ηχοβολισμό του καθετήρα σε κουτί ηχοπροστασίας ή με κατάλληλη προστασία της ακοής. Το πρωτόκολλο της πηγής προειδοποιεί ρητά για τον επιβλαβή ακουστικό θόρυβο που παράγεται κατά τον ηχοβολισμό.
Φορέστε προστατευτικά για τα μάτια, εργαστηριακό παλτό και γάντια.
Κρατήστε τον αισθητήρα μακριά από το δέρμα και μην κάνετε ποτέ ηχομόνωση σε ανοιχτό δοχείο χωρίς προστασία από πιτσιλιές.
Χειριστείτε το PMSF και άλλους αναστολείς σύμφωνα με τους τοπικούς κανόνες χημικής ασφάλειας.
Διατηρήστε τα δείγματα σε πάγο για να μειώσετε τη βλάβη των πρωτεϊνών που προκαλείται από τη θερμότητα- το έγγραφο αναφέρει επανειλημμένα ότι ο έλεγχος της θερμοκρασίας είναι κρίσιμος.
Το VialTweeter Sonicator επιταχύνει και βελτιώνει την εκχύλιση πρωτεϊνών στην πρωτεομική
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.