Προετοιμασία δειγμάτων με τη βοήθεια φίλτρου (FASP) με υπερήχους: Βελτίωση των πρωτεωμικών ροών εργασίας με προηγμένη κατεργασία με υπερήχους

Η προετοιμασία δειγμάτων με τη βοήθεια φίλτρου (FASP) με υπερήχους αναδεικνύεται σε μια ιδιαίτερα αποδοτική και αναπαραγώγιμη μέθοδο στη σύγχρονη πρωτεωμική. Ενσωματώνοντας την ελεγχόμενη κατεργασία με υπερήχους σε καθιερωμένες ροές εργασίας FASP, οι ερευνητές μπορούν να βελτιώσουν σημαντικά την εκχύλιση πρωτεϊνών, την απόδοση της πέψης και τη συνολική ποιότητα των δεδομένων. Καθώς αυξάνεται η ζήτηση για αναπαραγώγιμη προετοιμασία δειγμάτων με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα, οι συσκευές εστιασμένων υπερήχων, όπως η συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP, αποκτούν ολοένα μεγαλύτερη επιστημονική και πρακτική σημασία.

Επιστημονικό πλαίσιο: Γιατί η FASP είναι σημαντική στην πρωτεωμική

Η προετοιμασία δειγμάτων με τη βοήθεια φίλτρου (FASP) έχει καθιερωθεί ως μέθοδος αναφοράς στην πρωτεωμική με προσέγγιση από κάτω προς τα πάνω, χάρη στην ικανότητά της να απομακρύνει απορρυπαντικά, άλατα και άλλους επιμολυντές, επιτρέποντας παράλληλα την αποδοτική ενζυμική πέψη. Ωστόσο, τα κλασικά πρωτόκολλα FASP συχνά παρουσιάζουν περιορισμούς που σχετίζονται με την ατελή λύση, τη μη σταθερή απόδοση της πέψης και τη μεταβλητότητα των δειγμάτων – ιδίως κατά την επεξεργασία σύνθετων ή ανθεκτικών βιολογικών κυττάρων ή ιστών.
Σε αυτό το σημείο, η εστιασμένη ενέργεια υπερήχων (κατεργασία με υπερήχους) παρέχει ένα καθοριστικό πλεονέκτημα. Προκαλώντας μηχανικές δυνάμεις διάτμησης και σπηλαίωση, η κατεργασία με υπερήχους βελτιώνει πολλά κρίσιμα στάδια της ροής εργασίας FASP, χωρίς να διακυβεύει την ακεραιότητα των πρωτεϊνών.

Οι θετικές επιδράσεις της κατεργασίας με υπερήχους στη FASP με υπερήχους

Η κατεργασία με υπερήχους προκαλεί ελεγχόμενη ακουστική σπηλαίωση – σχηματισμό και κατάρρευση μικροσκοπικών φυσαλίδων – η οποία δημιουργεί τοπικές δυνάμεις διάτμησης και μικροροές.
Η κατεργασία με υπερήχους βελτιώνει τόσο το στάδιο της αλκυλίωσης όσο και το στάδιο της πέψης στη FASP με υπερήχους, βελτιώνοντας τη μεταφορά μάζας και επιταχύνοντας την κινητική των αντιδράσεων. Η εφαρμογή ενέργειας υπερήχων δημιουργεί σπηλαίωση, οδηγώντας σε τοπικές μικροροές και παροδικές δυνάμεις διάτμησης που προάγουν την ταχεία ανάμειξη και την αποτελεσματική διείσδυση των αντιδραστηρίων στην πρωτεϊνική μήτρα ή στο περιβάλλον του φίλτρου. Κατά την αλκυλίωση, αυτό έχει ως αποτέλεσμα την πιο ομοιόμορφη και ταχύτερη τροποποίηση των καταλοίπων κυστεΐνης από το ιωδοακεταμίδιο. Στο στάδιο της πέψης, η κατεργασία με υπερήχους αυξάνει την προσβασιμότητα των θέσεων πρωτεολυτικής διάσπασης και βελτιώνει τις αλληλεπιδράσεις ενζύμου–υποστρώματος, επιταχύνοντας έτσι τη δράση της θρυψίνης και ενισχύοντας την απόδοση της πέψης. Συνολικά, η κατεργασία με υπερήχους μειώνει τον χρόνο επεξεργασίας, διατηρώντας ή βελτιώνοντας παράλληλα την πληρότητα και την αναπαραγωγιμότητα των αντιδράσεων.

Στην προετοιμασία δειγμάτων για πρωτεωμική ανάλυση, η FASP με υπερήχους συνεπάγεται:

• Αποδοτικότερη κυτταρική διάρρηξη και εκχύλιση πρωτεϊνών, ακόμη και σε ανθεκτικούς ιστούς ή μικροβιακά δείγματα
• Ενισχυμένη διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών
• Βελτιωμένη πρόσβαση των ενζύμων κατά την πέψη
• Μειωμένο χρόνο επεξεργασίας και αυξημένη αναπαραγωγιμότητα

Σε αντίθεση με τις συμβατικές μεθόδους μηχανικής ή χημικής λύσης, η επεξεργασία με υπερήχους προσφέρει υψηλό βαθμό ελέγχου και δυνατότητα κλιμάκωσης, γεγονός που την καθιστά ιδιαίτερα κατάλληλη για τυποποιημένες πρωτεωμικές ροές εργασίας.

Πλεονεκτήματα της FASP με υπερήχους έναντι των συμβατικών προσεγγίσεων

Η ενσωμάτωση της κατεργασίας με υπερήχους στα πρωτόκολλα FASP παρέχει μετρήσιμα οφέλη που επηρεάζουν άμεσα τα αποτελέσματα της επακόλουθης φασματομετρίας μάζας.
Η FASP με υπερήχους επιτρέπει πληρέστερη ανάκτηση πρωτεϊνών, ιδιαίτερα από απαιτητικά δείγματα, όπως ινώδεις ιστοί ή βιοϋμένια. Η ομοιόμορφη κατανομή της ενέργειας εξασφαλίζει ομοιόμορφη κατεργασία μεταξύ των επαναλήψεων, μειώνοντας τη μεταβλητότητα – μια ουσιώδης απαίτηση για την ποσοτική πρωτεωμική.
Επιπλέον, η κατεργασία με υπερήχους επιταχύνει την κινητική της πέψης, βελτιώνοντας την αλληλεπίδραση ενζύμου–υποστρώματος. Αυτό συχνά οδηγεί σε μικρότερους χρόνους πέψης και υψηλότερη απόδοση σε πεπτίδια, διατηρώντας παράλληλα την κάλυψη της αλληλουχίας.
Από την άποψη της ροής εργασίας, τα συστήματα υπερήχων μειώνουν τη χειροκίνητη παρέμβαση και εξαλείφουν την ανάγκη για επιθετικές χημικές κατεργασίες, διατηρώντας την ακεραιότητα των δειγμάτων και απλοποιώντας την τυποποίηση των πρωτοκόλλων.

Διάγραμμα Venn που δείχνει τον αυξημένο αριθμό πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν με τη FASP με υπερήχους σε σύγκριση με τη FASP που εκτελείται κατά τη διάρκεια της νύχτας
Εικόνα και μελέτη: ©Carvalho et al., 2020

Πρωτόκολλο: FASP υψηλής απόδοσης επεξεργασίας δειγμάτων με υπερήχους και το UIP400MTP

Για εργαστήρια που επεξεργάζονται μεγάλες ομάδες δειγμάτων, η συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP επιτρέπει την ταυτόχρονη κατεργασία τυπικών πλακών πολλαπλών βοθρίων (π.χ. πλακών 96 βοθρίων) με υπερήχους, αυξάνοντας σημαντικά τον ρυθμό επεξεργασίας δειγμάτων και την αναπαραγωγιμότητα.
Σε αυτή τη διάταξη, τα δείγματα (συνήθως 50–200 µL ανά βοθρίο) προετοιμάζονται απευθείας σε μικροπλάκες συμβατές με υπερδιήθηση ή με τα επόμενα στάδια επεξεργασίας. Τα ρυθμιστικά διαλύματα λύσης είναι παρόμοια με εκείνα που χρησιμοποιούνται στα τυπικά πρωτόκολλα FASP.

Το UIP400MTP εφαρμόζει ομοιόμορφη ενέργεια υπερήχων σε όλα τα βοθρία. Η κατεργασία με υπερήχους πραγματοποιείται συνήθως σε πλάτος ταλάντωσης 60–80% για 2–4 λεπτά, ανάλογα με τον τύπο του δείγματος. Παρακολουθείτε τη θερμοκρασία χρησιμοποιώντας τον συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας. Χρησιμοποιείτε παλμική κατεργασία με υπερήχους και, προαιρετικά, εργαστηριακό ψύκτη.

Ενδεικτικό πρωτόκολλο:

1. Για το στάδιο της αλκυλίωσης, τα δείγματα υποβάλλονται σε κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών (UIP400MTP) σε πλάτος ταλάντωσης 40% για 7 κύκλους (30 s λειτουργίας, 15 s παύσης· συνολικός χρόνος κατεργασίας με υπερήχους: 5 min 45 s).
2. Μετά την κατεργασία με υπερήχους, το διάλυμα ιωδοακεταμιδίου (IAA) απομακρύνεται με φυγοκέντρηση. Πριν από την πέψη με θρυψίνη, τα δείγματα πρέπει να πλυθούν για να απομακρυνθεί η υπολειμματική ουρία, ένας ισχυρός χαοτροπικός παράγοντας που αναστέλλει την ενζυμική δραστικότητα. Επομένως, τα δείγματα πλένονται δύο φορές με 200 μL διαλύματος όξινου ανθρακικού αμμωνίου (AmBic) 25 mM.
3. Στη συνέχεια, προστίθενται 100 μL διαλύματος θρυψίνης (αναλογία ενζύμου προς πρωτεΐνη 1:30), παρασκευασμένου σε διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου 12,5 mM. Η πέψη των πρωτεϊνών πραγματοποιείται κατόπιν με το UIP400MTP υπό τις ίδιες συνθήκες κατεργασίας με υπερήχους (πλάτος ταλάντωσης 40%, 7 κύκλοι, 30 s λειτουργίας / 15 s παύσης· συνολικός χρόνος: 5 min 45 s).
4. Μετά την κατεργασία με υπερήχους, τα δείγματα μεταφέρονται σε πλάκες φίλτρων ή υποβάλλονται σε επεξεργασία με συστήματα FASP που βασίζονται σε πλάκες. Τα στάδια αναγωγής και αλκυλίωσης πραγματοποιούνται εντός της πλάκας, διατηρώντας μια απλοποιημένη ροή εργασίας.
5. Η πέψη με θρυψίνη πραγματοποιείται υπό ελεγχόμενες συνθήκες (π.χ. 37°C, 4–16 ώρες), με δυνατότητα σύντομης διέγερσης με υπερήχους για την επιτάχυνση της ενζυμικής δραστικότητας και τη βελτίωση της απόδοσης σε πεπτίδια.
6. Τα πεπτίδια ανακτώνται με φυγοκέντρηση και είναι έτοιμα για ανάλυση LC-MS/MS.

Το βασικό πλεονέκτημα αυτού του συστήματος έγκειται στην ικανότητά του να παρέχει πανομοιότυπες συνθήκες επεξεργασίας σε όλα τα βοθρία, ελαχιστοποιώντας τις επιδράσεις της παρτίδας και επιτρέποντας αξιόπιστες ποσοτικές συγκρίσεις σε πρωτεωμικές μελέτες μεγάλης κλίμακας.

Σχεδιασμός, κατασκευή και συμβουλευτική – Ποιότητα κατασκευασμένη στη Γερμανία

Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι γνωστές για τα ανώτατα πρότυπα ποιότητας και σχεδιασμού τους. Η στιβαρότητα και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των συσκευών υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher ανταποκρίνονται με ευκολία σε σκληρές συνθήκες και απαιτητικά περιβάλλοντα.

Η Hielscher Ultrasonics είναι εταιρεία πιστοποιημένη κατά ISO και δίνει ιδιαίτερη έμφαση σε συσκευές υπερήχων υψηλών επιδόσεων που διαθέτουν τεχνολογία αιχμής και είναι φιλικές προς τον χρήστη. Φυσικά, οι συσκευές υπερήχων της Hielscher συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις CE και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.

Βιβλιογραφία / Αναφορές

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).