Πρωτεωμικές ροές εργασίας με πέψη πρωτεϊνών υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας

Η πρωτεωμική αποτελεί ουσιώδη κλάδο για την κατανόηση των βιολογικών διεργασιών και συστημάτων, με την πέψη πρωτεϊνών να συνιστά κρίσιμο βήμα στις ροές εργασίας της. Παραδοσιακά, η πέψη πρωτεϊνών πραγματοποιείται σε διάλυμα με χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων όπως η θρυψίνη, η οποία υδρολύει ειδικά τους πεπτιδικούς δεσμούς σε κατάλοιπα λυσίνης και αργινίνης. Αυτή η διεργασία παράγει πεπτίδια κατάλληλα για ιονισμό και θραυσματοποίηση σε εφαρμογές φασματομετρίας μάζας (MS). Ωστόσο, οι συμβατικές μέθοδοι πέψης απαιτούν 12–24 ώρες για να ολοκληρωθούν, δημιουργώντας σημαντικές καθυστερήσεις στις πρωτεωμικές ροές εργασίας.
Η κατεργασία με υπερήχους προσφέρει μια ισχυρή εναλλακτική λύση, μειώνοντας δραστικά τους χρόνους πέψης από ώρες σε μόλις λίγα λεπτά. Σε συνδυασμό με προηγμένες συσκευές υπερήχων για πολλαπλά δείγματα, όπως οι Hielscher CupHorn, VialTweeter και η συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκες 96 βοθρίων, η κατεργασία με υπερήχους επιτρέπει την επιτάχυνση των πρωτεωμικών αναλύσεων με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα. Αυτές οι τεχνολογίες απλοποιούν τις ροές εργασίας, μειώνοντας τον χρόνο προετοιμασίας των δειγμάτων και αυξάνοντας την αποδοτικότητα χωρίς να υποβαθμίζουν την αναπαραγωγιμότητα ή την ποιότητα των δεδομένων.

Ο ρόλος της ενέργειας υπερήχων στην πέψη πρωτεϊνών

Η κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιεί εστιασμένα κύματα υπερήχων για να δημιουργήσει σπηλαίωση – εντοπισμένες μικροφυσαλίδες που καταρρέουν, παράγοντας έντονες δυνάμεις διάτμησης. Το φαινόμενο αυτό ενισχύει τη μεταφορά μάζας, προάγει την ανάμειξη των ενζύμων με τα υποστρώματα και προκαλεί εκδίπλωση των πρωτεϊνικών δομών, εκθέτοντας τις θέσεις διάσπασης σε πρωτεολυτικά ένζυμα όπως η θρυψίνη.
Το αποτέλεσμα; Σημαντική μείωση του χρόνου πέψης χωρίς να υποβαθμίζεται η αποδοτικότητα ή η αναπαραγωγιμότητα.

Πρωτεολυτική πέψη ενισχυμένη με υπερήχους: Μεθοδολογία και αποτελέσματα

Πρωτόκολλο επιταχυνόμενης πέψης

Η υποβοηθούμενη με υπερήχους πέψη συνδυάζει πρωτεολυτικά ένζυμα και ενέργεια υπερήχων για την επιτάχυνση των ροών εργασίας. Για παράδειγμα, με χρήση του Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), η ροή εργασίας της πέψης εξελίσσεται ως εξής:

1. Αναγωγή: Τα δείγματα πρωτεϊνών (0,5 mg/mL, 20 µL) υποβάλλονται σε επεξεργασία με DTT (2 µL, 110 mM) σε ρυθμιστικό διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου (12,5 mM). Εφαρμόζεται κατεργασία με υπερήχους σε πλάτος 50% για 5 λεπτά.
2. Αλκυλίωση: Μετά την προσθήκη IAA (2 µL, 400 mM), η κατεργασία με υπερήχους επαναλαμβάνεται υπό τις ίδιες συνθήκες.
3. Πέψη: Τα δείγματα αραιώνονται και επωάζονται με νανοσωματίδια που φέρουν ακινητοποιημένη θρυψίνη. Ένας τελικός κύκλος κατεργασίας με υπερήχους (5 λεπτά) ολοκληρώνει την πέψη. Τα πεπτίδια διαχωρίζονται, ξηραίνονται και αποθηκεύονται για ανάλυση MS.

Αυτή η μέθοδος υπερήχων μειώνει τον συνολικό χρόνο προετοιμασίας από 12 ώρες σε λιγότερο από 30 λεπτά. Παρά την επιταχυνόμενη διεργασία, η απόδοση και η ποιότητα των πεπτιδίων παραμένουν αντίστοιχες με εκείνες των παραδοσιακών μεθόδων ολονύκτιας πέψης.

Αποδοτικότητα της πέψης πρωτεϊνών με υπερήχους

Σε συγκριτικές μελέτες με χρήση πρωτεωμάτων E. coli:

• Ταυτοποίηση πρωτεϊνών: Στα δείγματα που υποβλήθηκαν σε πέψη με υπερήχους ταυτοποιήθηκαν 777 πρωτεΐνες σε 5 λεπτά, έναντι 817 σε 12 ώρες. Οι κοινές ταυτοποιήσεις πρωτεϊνών υπερέβησαν το 70%.
• Αναπαραγωγιμότητα: Οι επαναληπτικές αναλύσεις έδειξαν τιμές συσχέτισης άνω του 98% εντός κάθε μεθόδου, καταδεικνύοντας την αξιοπιστία τους.
• Εκλεκτικότητα: Ορισμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν κατά προτίμηση σε πέψη με κάθε μέθοδο, με την πέψη με υπερήχους να ευνοεί 65 πρωτεΐνες και την ολονύκτια πέψη 54 πρωτεΐνες. Τέτοιες λεπτές διαφορές υπογραμμίζουν τις μοναδικές δυνατότητες της κατεργασίας με υπερήχους για συγκεκριμένες εφαρμογές.

Αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεϊνών χωρίς επισήμανση μετά την προσθήκη επτά πρωτεϊνών σε
δείγμα E. coli. Οι ακόλουθες πρωτεΐνες προστέθηκαν σε δύο διαφορετικά επίπεδα, όπως σημειώνεται στη στήλη
με την ονομασία «Theo Ratio». Το Theo Ratio είναι ο θεωρητικός λόγος μεταξύ των δύο επιπέδων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το
πείραμα. Αλβουμίνη βόειου ορού (ALBU), β-λακτοσφαιρίνη (LACB), α-S1 καζεΐνη (CASA1),
α-S2 καζεΐνη (CASA2), κυτόχρωμα c (CYC), ωοαλβουμίνη (OVAL) και καρβονική ανυδράση 2
(CAH2). Οι λόγοι υπολογίστηκαν με χρήση των εντάσεων πρωτεϊνών LFQ που προέκυψαν από το MaxQuant κατά την
ανάλυση. Εφαρμόστηκε η δοκιμασία t του Student για τη σύγκριση των τιμών που προέκυψαν με κάθε μέθοδο (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Μελέτη και γράφημα: © Martins et al., 2019)

Θρυψίνη ακινητοποιημένη σε νανοσωματίδια

Ο συνδυασμός νανοσωματιδίων που φέρουν ακινητοποιημένη θρυψίνη (π.χ. T-FMNPs) με την κατεργασία με υπερήχους βελτιώνει περαιτέρω τις ροές εργασίας της πρωτεωμικής. Αυτά τα νανοσωματίδια παρέχουν μεγάλη επιφάνεια για αλληλεπιδράσεις ενζύμου–υποστρώματος, αυξάνοντας την αποδοτικότητα. Όταν εφαρμόζεται σε σύνθετα πρωτεώματα, όπως αυτό του E. coli, η συνδυασμένη μέθοδος επιτυγχάνει:

• Ταχύτητα: Πλήρης πέψη εντός 5 λεπτών.
• Ακρίβεια: Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών συγκρίσιμος με αυτόν των παραδοσιακών μεθόδων (p > 0,01, n=3).
• Δυνατότητα κλιμάκωσης: Η προσαρμογή σε πλατφόρμες πλακών πολλαπλών βοθρίων όπως το UIP400MTP επιτρέπει επεξεργασία υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας.

Κάντε κλικ εδώ για το αναλυτικό πρωτόκολλο με οδηγίες βήμα προς βήμα!
(βλ. Martins et al., 2019)

Πρωτεολυτική πέψη με υψηλή ταχύτητα και υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα με συσκευές υπερήχων της Hielscher

Τα καλύτερα μοντέλα συσκευών υπερήχων για την πρωτεωμική

Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορα μοντέλα συσκευών υπερήχων για την ταυτόχρονη προετοιμασία πολλαπλών δειγμάτων, διευκολύνοντας ροές εργασίας υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας. Είτε εργάζεστε με φιαλίδια, δοκιμαστικούς σωλήνες, πλάκες πολλαπλών βοθρίων (π.χ. πλάκες 6, 24 ή 96 βοθρίων) είτε με τρυβλία Petri – σας προσφέρουμε τις ιδανικές συσκευές υπερήχων για τα πειράματά σας.

Συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών βοθρίων

Για τον μέγιστο ρυθμό επεξεργασίας δειγμάτων, το UIP400MTP παρέχει τη δυνατότητα κατεργασίας πλακών 96 βοθρίων με υπερήχους. Συμβατό με οποιαδήποτε τυπική μικροπλάκα, το UIP400MTP δεν απαιτεί ακριβά αναλώσιμα αποκλειστικής κατασκευής και σας δίνει την ελευθερία να επιλέξετε την καλύτερη πλάκα πολλαπλών βοθρίων για την έρευνά σας. Παρέχοντας ομοιόμορφη ενέργεια σε όλη την πλάκα, επιτρέπει την ταχεία αναγωγή, αλκυλίωση και πέψη έως και 200 σύνθετων πρωτεωμάτων σε μόλις 1 ώρα. Αυτό το επίπεδο αυτοματοποίησης και αποδοτικότητας είναι καθοριστικό για την πρωτεωμική υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας και τις κλινικές εφαρμογές. Μάθετε περισσότερα για τη συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών βοθρίων!

VialTweeter

Το VialTweeter είναι προσαρμοσμένο στις ανάγκες εργαστηρίων που απαιτούν την ταυτόχρονη κατεργασία με υπερήχους έως και 10 φιαλιδίων ή δοκιμαστικών σωλήνων. Η μη επεμβατική προσέγγισή του εξαλείφει τους κινδύνους διασταυρούμενης επιμόλυνσης, εξασφαλίζοντας παράλληλα αναπαραγώγιμη πέψη πρωτεϊνών. Αυτή η συσκευή είναι ιδανική για ερευνητές που εργάζονται με περιορισμένους όγκους δειγμάτων ή ποικίλους τύπους δειγμάτων.
Μάθετε περισσότερα για τη συσκευή υπερήχων VialTweeter για πολλαπλούς σωλήνες!

Hielscher UP200St-CupHorn

Η συσκευή υπερήχων CupHorn είναι μια ισχυρή συσκευή σχεδιασμένη για την ταυτόχρονη επεξεργασία πολλαπλών δειγμάτων σε σφραγισμένα δοχεία. Εξασφαλίζει ομοιόμορφη κατανομή της ενέργειας υπερήχων και ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας. Η δυνατότητα ταυτόχρονης επεξεργασίας έως και πέντε δειγμάτων, σε συνδυασμό με τη συμβατότητά της με ροές εργασίας που περιλαμβάνουν αναγωγή, αλκυλίωση και πέψη, καθιστά το CupHorn αξιόπιστο εργαλείο για την πρωτεωμική που βασίζεται στη φασματομετρία μάζας (MS).
Μάθετε περισσότερα για το CupHorn SonoReactor!

Πρωτόκολλο βήμα προς βήμα για πρωτεολυτική πέψη υποβοηθούμενη από υπερήχους με χρήση θρυψίνης ακινητοποιημένης σε νανοσωματίδια

Αυτό το πρωτόκολλο των Martins et al. (2019) έχει βελτιστοποιηθεί για ταχεία πέψη πρωτεϊνών με χρήση ενέργειας υπερήχων και θρυψίνης ακινητοποιημένης σε νανοσωματίδια (T-FMNPs). Τα βήματα που περιγράφονται εξασφαλίζουν αποδοτική αναγωγή, αλκυλίωση και πρωτεόλυση, κατάλληλες για εφαρμογές φασματομετρίας μάζας (MS).
Βήματα του πρωτοκόλλου

1. Αναγωγή δισουλφιδικών δεσμών
   • Προσθέστε 2 µL διαλύματος DTT (110 mM) στο δείγμα πρωτεΐνης των 20 µL (0,5 mg/mL) σε ρυθμιστικό διάλυμα AmBic.
   • Τοποθετήστε τον σωλήνα του δείγματος στον ηχοαντιδραστήρα UP200St-CupHorn.
   • Υποβάλετε το δείγμα σε κατεργασία με υπερήχους για 2,5 λεπτά σε πλάτος ταλάντωσης 50% (200 W, 26 kHz).
   • Διακόψτε για σύντομο χρονικό διάστημα ώστε να επιτραπεί η ψύξη και, στη συνέχεια, υποβάλετε το δείγμα σε κατεργασία με υπερήχους για ακόμη 2,5 λεπτά υπό τις ίδιες συνθήκες.
2. Αλκυλίωση ανηγμένων καταλοίπων κυστεΐνης
   • Προσθέστε 2 µL διαλύματος IAA (400 mM) στο ανηγμένο δείγμα πρωτεΐνης.
   • Υποβάλετε το δείγμα σε κατεργασία με υπερήχους για 2,5 λεπτά σε πλάτος ταλάντωσης 50% για να διευκολύνετε την αλκυλίωση.
   • Διακόψτε για ψύξη και, στη συνέχεια, υποβάλετε το δείγμα σε κατεργασία με υπερήχους για επιπλέον 2,5 λεπτά.

   Σημείωση: Ελαχιστοποιήστε την έκθεση του αλκυλιωμένου δείγματος στο φως για να αποτρέψετε την αποδόμηση του IAA.

3. Αραίωση δείγματος
   • Αραιώστε το αλκυλιωμένο δείγμα πρωτεΐνης σε τελικό όγκο 100 µL χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα AmBic 25 mM που περιέχει 4% ακετονιτρίλιο (v/v).
   • Αναμείξτε καλά με ήπια αναρρόφηση και εκροή με πιπέτα.
4. Πρωτεολυτική πέψη με θρυψίνη ακινητοποιημένη σε νανοσωματίδια
   • Προσθέστε 20 µL διαλύματος T-FMNP (3 mg/mL) στο αραιωμένο δείγμα πρωτεΐνης.
   • Υποβάλετε το μείγμα σε κατεργασία με υπερήχους στον ηχοαντιδραστήρα για 2,5 λεπτά με πλάτος 50%.
   • Διακόψτε για να επιτρέψετε την ψύξη και, στη συνέχεια, υποβάλετε σε κατεργασία με υπερήχους για ακόμη 2,5 λεπτά υπό τις ίδιες συνθήκες.
5. Διαχωρισμός των νανοσωματιδίων με ακινητοποιημένη τρυψίνη
   • Χρησιμοποιήστε έναν μαγνήτη για να διαχωρίσετε τα T-FMNPs από το υπερκείμενο υγρό που περιέχει τα πεπτίδια της πέψης.
   • Μεταφέρετε το υπερκείμενο υγρό σε νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης.
6. Προετοιμασία πεπτιδίων για ανάλυση MS
   • Ξηράνετε το υπερκείμενο υγρό που περιέχει πεπτίδια σε φυγόκεντρο κενού.
   • Αποθηκεύστε τα ξηραμένα πεπτίδια στους -20°C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση με φασματομετρία μάζας.