Πρωτεομικές ροές εργασίας με πέψη πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης

Η πρωτεομική είναι ένα βασικό πεδίο για την κατανόηση των βιολογικών διεργασιών και συστημάτων, με την πέψη πρωτεϊνών να αποτελεί ένα κρίσιμο βήμα στις ροές εργασίας της. Παραδοσιακά, η πέψη πρωτεϊνών πραγματοποιείται σε διάλυμα χρησιμοποιώντας πρωτεολυτικά ένζυμα όπως η θρυψίνη, η οποία υδρολύει ειδικά πεπτιδικούς δεσμούς σε υπολείμματα λυσίνης και αργινίνης. Αυτή η διαδικασία παράγει πεπτίδια κατάλληλα για ιονισμό και κατακερματισμό σε εφαρμογές φασματομετρίας μάζας (MS). Ωστόσο, οι συμβατικές μέθοδοι πέψης απαιτούν 12-24 ώρες για να ολοκληρωθούν, δημιουργώντας σημαντικά σημεία συμφόρησης στις πρωτεομικές ροές εργασίας.
Υπερήχους προσφέρει μια ισχυρή εναλλακτική λύση, μειώνοντας δραματικά τους χρόνους πέψης από ώρες σε λίγα λεπτά. Όταν συνδυάζεται με προηγμένους υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων όπως το Hielscher CupHorn, VialTweeter και το UIP400MTP υπερήχων πλάκας 96 πηγαδιών, υπερήχους επιτρέπει την επιταχυνόμενη, υψηλής απόδοσης πρωτεομική. Αυτές οι τεχνολογίες βελτιστοποιούν τις ροές εργασίας, μειώνοντας τον χρόνο προετοιμασίας των δειγμάτων και αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα χωρίς συμβιβασμούς στην αναπαραγωγιμότητα ή την ποιότητα των δεδομένων.

Ο ρόλος της υπερηχητικής ενέργειας στην πέψη πρωτεϊνών

Υπερήχους χρησιμοποιεί εστιασμένα κύματα υπερήχων για να δημιουργήσει σπηλαίωση - εντοπισμένες μικροφυσαλίδες που καταρρέουν για να δημιουργήσουν έντονες δυνάμεις διάτμησης. Αυτό το φαινόμενο ενισχύει τη μεταφορά μάζας, προάγει την ανάμειξη ενζύμων με υποστρώματα και ξεδιπλώνει πρωτεϊνικές δομές, εκθέτοντας θέσεις διάσπασης σε πρωτεολυτικά ένζυμα όπως η θρυψίνη.
Το αποτέλεσμα; Σημαντική μείωση του χρόνου πέψης χωρίς συμβιβασμούς στην αποτελεσματικότητα ή την αναπαραγωγιμότητα.

Υπερήχων-ενισχυμένη πρωτεολυτική πέψη: Μεθοδολογία και αποτελέσματα

Πρωτόκολλο επιταχυνόμενης πέψης

Υπερήχων-υποβοηθούμενη πέψη συνδυάζει πρωτεολυτικά ένζυμα και υπερήχων ενέργειας για να επιταχύνει τις ροές εργασίας. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), η ροή εργασίας πέψης προχωρά ως εξής:

1. Αναγωγή: Δείγματα πρωτεϊνών (0,5 mg/mL, 20 μL) υποβάλλονται σε κατεργασία με DTT (2 μL, 110 mM) σε ρυθμιστικό διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου (12,5 mM). Κατεργασία με υπερήχους εφαρμόζεται σε πλάτος 50% για 5 λεπτά.
2. Αλκυλίωση: Μετά την προσθήκη ισοασκορβικού οξέος (2 μL, 400 mM), υπερήχηση επαναλαμβάνεται υπό τις ίδιες συνθήκες.
3. Πέψη: Τα δείγματα αραιώνονται και επωάζονται με ακινητοποιημένα νανοσωματίδια θρυψίνης. Ένας τελικός γύρος υπερήχων (5 λεπτά) ολοκληρώνει την πέψη. Τα πεπτίδια διαχωρίζονται, ξηραίνονται και αποθηκεύονται για ανάλυση MS.

Αυτή η μέθοδος υπερήχων μειώνει το συνολικό χρόνο προετοιμασίας από 12 ώρες σε λιγότερο από 30 λεπτά. Παρά την επιταχυνόμενη διαδικασία, η απόδοση και η ποιότητα των πεπτιδίων παραμένουν σύμφωνες με τις παραδοσιακές μεθόδους διανυκτέρευσης.

Αποτελεσματικότητα της πέψης πρωτεϊνών υπερήχων

Σε συγκριτικές μελέτες που χρησιμοποιούν πρωτεώματα E. coli:

• Ταυτοποίηση πρωτεϊνών: Τα δείγματα που αφομοιώθηκαν με υπερήχους εντόπισαν 777 πρωτεΐνες σε 5 λεπτά, σε σύγκριση με 817 σε 12 ώρες. Οι κοινές ταυτοποιήσεις πρωτεϊνών ξεπέρασαν το 70%.
• Αναπαραγωγιμότητα: Οι επαναληπτικές αναλύσεις έδειξαν τιμές συσχέτισης άνω του 98% σε κάθε μέθοδο, αποδεικνύοντας αξιοπιστία.
• Επιλεκτικότητα: Ορισμένες πρωτεΐνες αφομοιώθηκαν κατά προτίμηση με κάθε μέθοδο, με υπερηχητική πέψη που ευνοεί 65 πρωτεΐνες και ολονύκτια πέψη 54 πρωτεΐνες. Τέτοιες λεπτές διαφορές υπογραμμίζουν το μοναδικό δυναμικό της υπερήχων για συγκεκριμένες εφαρμογές.

Αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεϊνών χωρίς ετικέτα επτά πρωτεΐνων σε E. coli
δείγμα. Οι ακόλουθες πρωτεΐνες προστέθηκαν σε δύο διαφορετικά επίπεδα, όπως σημειώνεται στη στήλη:
ονομάζεται "Theo Ratio". Theo Ratio είναι η θεωρητική αναλογία μεταξύ των δύο επιπέδων που χρησιμοποιούνται σε αυτό
πείραμα. Αλβουμίνη ορού βοοειδών (ALBU), β-λακτοσφαιρίνη (LACB), καζεΐνη α-S1 (CASA1),
α-S2 καζεΐνη (CASA2), κυτόχρωμα c (CYC), ωοαλβουμίνη (OVAL) και καρβονική ανυδράση 2
(CAH2). Οι αναλογίες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας εντάσεις πρωτεΐνης LFQ που ελήφθησαν από το MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Μελέτη και γράφημα: © Martins et al., 2019)

Θρυψίνη ακινητοποιημένη σε νανοσωματίδια

Η ενσωμάτωση των ακινητοποιημένων νανοσωματιδίων θρυψίνης (π.χ., T-FMNPs) με υπερήχους ενισχύει περαιτέρω τις ροές εργασίας πρωτεομικής. Αυτά τα νανοσωματίδια παρέχουν μια υψηλή επιφάνεια για αλληλεπιδράσεις ενζύμου-υποστρώματος, αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα. Όταν εφαρμόζεται σε σύνθετα πρωτεώματα, όπως το E. coli, η συνδυασμένη μέθοδος επιτυγχάνει:

• Ταχύτητα: Ολοκληρώστε την πέψη μέσα σε 5 λεπτά.
• Ακρίβεια: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Επεκτασιμότητα: Η προσαρμογή σε πλατφόρμες πολλαπλών φρεατίων όπως το UIP400MTP επιτρέπει την επεξεργασία υψηλής απόδοσης.

Κάντε κλικ εδώ για το λεπτομερές πρωτόκολλο με οδηγίες βήμα προς βήμα!
(βλ. Martins et al., 2019)

Πρωτεολυτική πέψη σε υψηλή ταχύτητα και υψηλή απόδοση με υπερήχους Hielscher

Τα καλύτερα μοντέλα υπερήχων για πρωτεομική

Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορα μοντέλα υπερήχων για ταυτόχρονη προετοιμασία πολλαπλών δειγμάτων διευκολύνοντας ροές εργασίας υψηλής απόδοσης. Είτε εργάζεστε με φιαλίδια, δοκιμαστικούς σωλήνες, πλάκες πολλαπλών φρεατίων (π.χ. πλάκες 6, 24, 96 φρεατίων) ή τρυβλία Petri – Σας προσφέρουμε τους ιδανικούς υπερήχους για τα πειράματά σας.

UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων

Για τελική απόδοση, το UIP400MTP παρέχει τη δυνατότητα επεξεργασίας πλακών 96 φρεατίων υπερήχων. Συμβατό με οποιαδήποτε τυπική μικροπλάκα, το UIP400MTP δεν απαιτεί ακριβά ιδιόκτητα αναλώσιμα και σας δίνει την ελευθερία να επιλέξετε την καλύτερη πλάκα πολλαπλών φρεατίων για την έρευνά σας. Παρέχοντας ομοιόμορφη ενέργεια σε όλη την πλάκα, επιτρέπει την ταχεία μείωση, αλκυλίωση και πέψη έως και 200 σύνθετων πρωτεωμάτων σε μόλις 1 ώρα. Αυτό το επίπεδο αυτοματοποίησης και αποτελεσματικότητας είναι ζωτικής σημασίας για πρωτεομική υψηλής απόδοσης και κλινικές εφαρμογές. Μάθετε περισσότερα για τον υπερήχων πλάκας πολλαπλών πηγαδιών!

VialTweeter

Το VialTweeter είναι προσαρμοσμένο για εργαστήρια που απαιτούν την ταυτόχρονη υπερήχηση έως και 10 φιαλιδίων ή δοκιμαστικών σωλήνων. Η μη επεμβατική προσέγγισή του εξαλείφει τους κινδύνους διασταυρούμενης μόλυνσης, διασφαλίζοντας παράλληλα την αναπαραγώγιμη πέψη πρωτεϊνών. Αυτή η συσκευή είναι ιδανική για ερευνητές που εργάζονται με περιορισμένους όγκους δειγμάτων ή διαφορετικούς τύπους δειγμάτων.
Μάθετε περισσότερα σχετικά με τον υπερηχητικό υπολογιστή πολλαπλών σωλήνων VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ο υπερηχητής CupHorn είναι μια ισχυρή συσκευή σχεδιασμένη για ταυτόχρονη επεξεργασία πολλαπλών δειγμάτων σε σφραγισμένα δοχεία. Εξασφαλίζει ομοιόμορφη υπερηχητική κατανομή ενέργειας και ακριβή έλεγχο θερμοκρασίας. Η δυνατότητα επεξεργασίας έως και πέντε δειγμάτων ταυτόχρονα, σε συνδυασμό με τη συμβατότητά του με μειωμένες, αλκυλιωμένες και αφομοιωμένες ροές εργασίας, καθιστά το CupHorn ένα αξιόπιστο εργαλείο για πρωτεομική με βάση τη σκλήρυνση κατά πλάκας.
Μάθετε περισσότερα για τον αντιδραστήρα CupHorn SonoReactor!

Βήμα-βήμα πρωτόκολλο για υπερήχους-υποβοηθούμενη πρωτεολυτική πέψη χρησιμοποιώντας νανοσωματίδια-ακινητοποιημένη θρυψίνη

Αυτό το πρωτόκολλο από τους Martins et al. (2019) είναι βελτιστοποιημένο για ταχεία πέψη πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας υπερηχητική ενέργεια και θρυψίνη ακινητοποιημένη με νανοσωματίδια (T-FMNPs). Τα βήματα που περιγράφονται εξασφαλίζουν αποτελεσματική μείωση, αλκυλίωση και πρωτεόλυση κατάλληλα για εφαρμογές φασματομετρίας μάζας (MS).
Βήματα πρωτοκόλλου

1. Μείωση δισουλφιδικών δεσμών
   • Προστίθενται 2 μL διαλύματος DTT (110 mM) στο δείγμα πρωτεΐνης των 20 μL (0,5 mg/ml) σε ρυθμιστικό διάλυμα AmBic.
   • Τοποθετήστε το σωλήνα δείγματος στον υπερηχητικό αντιδραστήρα UP200St-CupHorn.
   • Κατεργασία με υπερήχους του δείγματος για 2,5 λεπτά σε πλάτος 50% (200 W, 26 kHz).
   • Σταματήστε για ένα σύντομο χρονικό διάστημα για να επιτρέψετε την ψύξη, στη συνέχεια υπερήχων για άλλα 2,5 λεπτά υπό τις ίδιες συνθήκες.
2. Αλκυλίωση ανηγμένων υπολειμμάτων κυστεΐνης
   • Προστίθενται 2 μL διαλύματος ισοασκορβικού οξέος (400 mM) στο δείγμα ανηγμένης πρωτεΐνης.
   • Υπερήχηση για 2,5 λεπτά σε πλάτος 50% για τη διευκόλυνση της αλκυλίωσης.
   • Παύση για ψύξη, στη συνέχεια υπερήχηση για επιπλέον 2,5 λεπτά.

   Σημείωση: Ελαχιστοποιείται η έκθεση του αλκυλιωμένου δείγματος στο φως για να αποφευχθεί η αποδόμηση του ισοασκορβικού οξέος.

3. Αραίωση δείγματος
   • Αραιώνεται το δείγμα αλκυλιωμένης πρωτεΐνης μέχρι τελικού όγκου 100 μL χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα AmBic 25 mM που περιέχει 4% ακετονιτρίλιο (v/v).
   • Ανακατέψτε καλά με απαλό σιφώνιο.
4. Πρωτεολυτική πέψη με θρυψίνη ακινητοποιημένη με νανοσωματίδια
   • Προστίθενται 20 μL διαλύματος T-FMNP (3 mg/ml) στο δείγμα αραιωμένης πρωτεΐνης.
   • Υπερήχων το μείγμα στον υπερηχητικό αντιδραστήρα για 2,5 λεπτά σε πλάτος 50%.
   • Παύση για ψύξη, στη συνέχεια υπερήχηση για άλλα 2,5 λεπτά υπό τις ίδιες συνθήκες.
5. Διαχωρισμός νανοσωματιδίων θρυψίνης
   • Χρησιμοποιήστε έναν μαγνήτη για να διαχωρίσετε τα T-FMNP από το υπερκείμενο υγρό που περιέχει χωνευμένα πεπτίδια.
   • Μεταφέρετε το υπερκείμενο υγρό σε νέο σωλήνα μικροφυγοκέντρισης.
6. Προετοιμασία πεπτιδίων για ανάλυση MS
   • Ξηραίνεται το υπερκείμενο υγρό που περιέχει πεπτίδια σε φυγόκεντρο κενού.
   • Φυλάσσετε τα αποξηραμένα πεπτίδια στους -20°C μέχρι περαιτέρω ανάλυσης με φασματομετρία μάζας.