Λύση κυττάρων ζύμης σε μικροπλάκες με χρήση υπερήχων υψηλής έντασης

Μικροβιολόγοι και ερευνητές των βιοεπιστημών που ασχολούνται με Σακχαρομύκητες cerevisiae, Πίχια Ποιστόρης / Komagataella phaffii, και άλλα συστήματα με ζύμη γνωρίζουν το πρόβλημα: τα κύτταρα της ζύμης είναι ανθεκτικά, η αναπαραγώγιμη λύση μπορεί να είναι δύσκολη, και η χειροκίνητη διάσπαση των δειγμάτων γρήγορα αποτελεί εμπόδιο όταν πρέπει να εξεταστούν πολλά στελέχη, κλώνοι, συνθήκες καλλιέργειας ή κατασκευάσματα έκφρασης.

Λύση ζύμης υψηλής απόδοσης για τη μικροβιολογία, τη μοριακή βιολογία και την ανάλυση πρωτεϊνών

Τα υπερηχητικά συστήματα της Hielscher για μικροπλάκες, όπως τα μοντέλα UIP400MTP (400 W) και UIP550MTP (550 W), προσφέρουν μια λύση υψηλής απόδοσης για τη μηχανική λύση των κυττάρων ζύμης απευθείας στις μικροπλάκες. Αντί να υποβάλλονται τα δείγματα σε επεξεργασία ένα προς ένα με έναν αισθητήρα, ολόκληρες οι μικροπλάκες μπορούν να υποβληθούν σε υπερηχητική επεξεργασία υπό ομοιόμορφες συνθήκες. Αυτό καθιστά τη λύση της μαγιάς με υπερήχους ταχύτερη, πιο αναπαραγώγιμη και ευκολότερη στην ενσωμάτωση σε σύγχρονες ροές εργασίας μικροβιολογίας, έκφρασης πρωτεϊνών, διαλογής ενζύμων και ομικών μεθόδων.
Είτε θέλετε να απομονώσετε ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες από το P. pastoris, να προετοιμάσετε λύματα ζύμης για ενζυμικές αναλύσεις, να διασπάσετε κύτταρα S. cerevisiae για ανάλυση πρωτεϊνών, είτε να εξετάσετε παράλληλα δεκάδες κλώνους ζύμης, τα συστήματα υπερήχων για μικροπλάκες της Hielscher προσφέρουν ισχυρή διάσπαση κυττάρων με βάση τη σπηλαίωση, με ακριβή έλεγχο της διαδικασίας.

Γιατί τα κύτταρα ζύμης απαιτούν αποτελεσματική μηχανική λύση

Τα κύτταρα ζύμης είναι πιο δύσκολο να υποστούν λύση σε σύγκριση με πολλά βακτηριακά ή θηλαστικά κύτταρα, καθώς προστατεύονται από ένα άκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα που αποτελείται κυρίως από πολυσακχαρίτες, γλυκάνες, μαννοπρωτεΐνες και χιτίνη. Αυτό το κυτταρικό τοίχωμα παρέχει μηχανική σταθερότητα, αλλά περιορίζει επίσης την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων, μεταβολιτών και ενζύμων.
Οι συμβατικές μέθοδοι λύσης ζύμης περιλαμβάνουν την κρούση με σφαιρίδια, την ενζυμική πέψη, τους κύκλους ψύξης-απόψυξης, τη χημική λύση και την υπερηχητική επεξεργασία με ανιχνευτή. Αυτές οι μέθοδοι μπορεί να είναι αποτελεσματικές, αλλά παρουσιάζουν και περιορισμούς. Η κρούση με σφαιρίδια μπορεί να προκαλέσει τη δημιουργία υπολειμμάτων και θέρμανση, η ενζυμική πέψη μπορεί να αυξήσει το κόστος και τη μεταβλητότητα, ενώ η υπερηχητική διάσπαση με ανιχνευτή σε μεμονωμένα δείγματα είναι χρονοβόρα όταν πρέπει να υποβληθούν σε επεξεργασία μεγάλοι αριθμοί δειγμάτων.
Η εστιασμένη σπηλαίωση με υπερήχους υψηλής έντασης ξεπερνά αυτούς τους περιορισμούς, ασκώντας έντονες μηχανικές δυνάμεις διάτμησης, διακυμάνσεις πίεσης και μικρορροές στο εναιώρημα ζύμης. Το αποτέλεσμα είναι η ταχεία διάσπαση των κυτταρικών τοιχωμάτων και μεμβρανών, η βελτιωμένη ενδοκυτταρική απελευθέρωση και η προετοιμασία δειγμάτων με υψηλή αναπαραγωγιμότητα σε μορφή πλάκας.

Υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών για την παράλληλη προετοιμασία δειγμάτων ζύμης

Τα μοντέλα Hielscher UIP400MTP και UIP550MTP έχουν σχεδιαστεί για την ομοιόμορφη υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών, πλακών πολλαπλών φρεατίων, πλακών PCR και κατάλληλων στηριγμάτων δειγμάτων. Σε αντίθεση με την υπερηχητική επεξεργασία με αισθητήρα, τα δείγματα δεν χρειάζεται να υποβάλλονται σε επεξεργασία ξεχωριστά. Ολόκληρη η πλάκα εκτίθεται σε ελεγχόμενη υπερηχητική ενέργεια, καθιστώντας τη ροή εργασίας ιδιαίτερα κατάλληλη για την παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων.

Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για:

• προβολή Μαγιά αρτοποιίας μεταλλάγματα ή στελέχη έκφρασης
• Λύση του Ο πατέρας του πάστορα / K. phaffii κλώνοι μετά την έκφραση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης
• Προετοιμασία λυμάτων ζύμης για ενζυμικές αναλύσεις
• Εξαγωγή πρωτεϊνών για SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS ή δοκιμές δραστικότητας
• Απελευθέρωση ενδοκυτταρικών μεταβολιτών για σκοπούς μεταβολομικής ανάλυσης
• Προετοιμασία δειγμάτων DNA και RNA μετά από κατάλληλο επακόλουθο καθαρισμό
• Βελτιστοποίηση υψηλής απόδοσης των ρυθμιστικών διαλυμάτων λύσης, των προσθέτων και των συνθηκών εκχύλισης

Πώς η υπερηχητική σπηλαίωση καταστρέφει τα κύτταρα της μαγιάς

Κατά τη διάρκεια της υπερηχητικής επεξεργασίας, τα εστιασμένα υπερήχητα υψηλής ισχύος δημιουργούν εναλλασσόμενους κύκλους συμπίεσης και αραιώσεως στο υγρό δείγμα. Όταν η ένταση είναι επαρκής, αυτές οι διακυμάνσεις της πίεσης προκαλούν ακουστική σπηλαίωση. Οι φυσαλίδες σπηλαίωσης σχηματίζονται, ταλαντώνονται και καταρρέουν, παράγοντας τοπικές δυνάμεις διάτμησης, μικροπίδακες, στροβιλισμό και ισχυρές κλίσεις πίεσης.
Στα εναιωρήματα ζύμης, αυτές οι μηχανικές επιδράσεις αποδυναμώνουν και προκαλούν ρήξη του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρικής μεμβράνης. Οι ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, τα ένζυμα, τα νουκλεϊκά οξέα και οι μεταβολίτες απελευθερώνονται στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Δεδομένου ότι η διαδικασία είναι μηχανική, μπορεί να χρησιμοποιηθεί με πολλά διαφορετικά συστήματα ρυθμιστικών διαλυμάτων και μπορεί να συνδυαστεί με αναστολείς πρωτεασών, αναγωγικά μέσα, απορρυπαντικά, άλατα ή ήπια ενζυμική προεπεξεργασία.

Γενικό πρωτόκολλο: Λύση κυττάρων ζύμης σε μικροπλάκες

Το παρακάτω πρωτόκολλο αποτελεί ένα πρακτικό σημείο εκκίνησης για τη λύση ζύμης με τη χρήση του υπερηχητικού συστήματος μικροπλακών Hielscher UIP400MTP ή UIP550MTP. Οι παράμετροι θα πρέπει να βελτιστοποιηθούν ανάλογα με το στέλεχος της ζύμης, την κυτταρική πυκνότητα, το μόριο-στόχο, τη σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος, τον τύπο της πλάκας και την επακόλουθη ανάλυση.

1. Συγκομιδή και πλύση των κυττάρων ζύμης

Καλλιεργήστε Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces ή άλλο στέλεχος ζύμης υπό τις επιθυμητές συνθήκες καλλιέργειας. Συλλέξτε τα κύτταρα με φυγοκέντρηση και απομακρύνετε το μέσο καλλιέργειας. Πλύνετε το ίζημα με κρύο αποσταγμένο νερό, PBS ή τον επιλεγμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, προκειμένου να απομακρυνθούν τα υπολείμματα συστατικών του μέσου που ενδέχεται να επηρεάσουν τις επόμενες αναλύσεις.
Για την εκχύλιση πρωτεϊνών, διατηρήστε τα δείγματα σε χαμηλή θερμοκρασία και εργαστείτε γρήγορα. Εάν υπάρχει κίνδυνος πρωτεασών, προψύξτε όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα και τα αναλώσιμα.

2. Ανακατέψτε ξανά το ίζημα των κυττάρων

Ανακατέψτε το ίζημα της μαγιάς σε κατάλληλο ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Για την αποτελεσματική απελευθέρωση πρωτεϊνών, η υψηλή κυτταρική πυκνότητα είναι συχνά πλεονεκτική. Ως σημείο εκκίνησης, χρησιμοποιήστε περίπου 10–20% w/v υγρού ιζήματος κυττάρων ή ένα πυκνό εναιώρημα που αντιστοιχεί σε OD₆₀₀ > 10, ανάλογα με τη μέθοδο ανάλυσης.

Ένα τυπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πρωτεϊνών ζύμης μπορεί να περιέχει:

• ρυθμιστικό διάλυμα όπως Tris-HCl, φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ή HEPES
• άλας, όπως το NaCl ή το KCl
• κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης
• προαιρετικό αναγωγικό μέσο, όπως DTT ή β-μερκαπτοαιθανόλη
• προαιρετικό απορρυπαντικό, όπως Triton X-100, NP-40, SDS ή CHAPS, ανάλογα με τη συμβατότητα με τις επόμενες διεργασίες
• προαιρετικοί αναστολείς φωσφατάσης για μελέτες φωσφορυλίωσης

Για δύσκολα στελέχη ζύμης ή για πολύ ήπια εκχύλιση πρωτεϊνών, μπορεί να εφαρμοστεί μια σύντομη προεπεξεργασία με Zymolyase, Lyticase ή άλλο ένζυμο που διασπά το κυτταρικό τοίχωμα πριν από την υπερηχητική επεξεργασία. Αυτή η ενζυμική προεπεξεργασία είναι προαιρετική, αλλά μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της λύσης ή να μειώσει την απαιτούμενη ένταση των υπερήχων.

3. Μεταφέρετε τα δείγματα σε μια κατάλληλη μικροπλάκα

Ρίξτε το εναιώρημα μαγιάς σε μικροπλάκα κατάλληλη για υπερήχους. Συχνά προτιμώνται οι πλάκες με στρογγυλό πυθμένα, καθώς βελτιώνουν τη συλλογή δειγμάτων και μειώνουν τις νεκρές ζώνες. Χρησιμοποιήστε ίσους όγκους δείγματος σε όλα τα φρεάτια για να βελτιώσετε την αναπαραγωγιμότητα.
Σφραγίστε το πιάτο με ένα κατάλληλο στρώμα ή μεμβράνη σφράγισης, ώστε να αποτρέψετε την εξάτμιση, τον σχηματισμό αερολύματος και τη διασταυρούμενη μόλυνση. Βεβαιωθείτε ότι η σφράγιση είναι συμβατή με τη θερμοκρασία και τις συνθήκες υπερήχων που έχετε επιλέξει.
Οι τυπικοί όγκοι εργασίας εξαρτώνται από το μέγεθος της πλάκας και την εφαρμογή. Συνηθισμένα μεγέθη περιλαμβάνουν πλάκες 96 φρεατίων, πλάκες με βαθιά φρεάτια, πλάκες PCR ή κατάλληλες βάσεις σωληναρίων.

4. Ρύθμιση ψύξης

Η λύση των ζυμομυκήτων απαιτεί υψηλή ένταση υπερήχων, ενώ η μηχανική διάσπαση παράγει θερμότητα. Ως εκ τούτου, ο έλεγχος της θερμοκρασίας είναι κρίσιμος, ειδικά για την ανάλυση πρωτεϊνών, ενζύμων, RNA ή φωσφορυλίωσης.

Χρησιμοποιήστε μια κατάλληλη στρατηγική ψύξης, όπως:

• προψυγμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης
• προψυγμένες μικροπλάκες
• διαλείμματα ψύξης μεταξύ των διαστημάτων υπερήχων
• εξωτερική ψύξη της πλατφόρμας υπερήχων, όπου απαιτείται

Ο στόχος είναι να διατηρηθεί το δείγμα αρκετά κρύο, ώστε να αποφευχθεί η μετουσίωση των πρωτεϊνών, η αδρανοποίηση των ενζύμων, η αποικοδόμηση του RNA και η μεταβλητότητα του δείγματος που προκαλείται από τη θερμότητα.

5. Υποβάλετε το εναιώρημα ζύμης σε υπερήχους

Τοποθετήστε την σφραγισμένη πλάκα στον υπερηχητικό επεξεργαστή μικροπλακών Hielscher UIP400MTP ή UIP550MTP και επιλέξτε ένα πρόγραμμα παλμικής υπερηχητικής επεξεργασίας. Η παλμική επεξεργασία συνιστάται, καθώς επιτρέπει τη μηχανική διάσπαση κατά τη διάρκεια των φάσεων «ON» και την απαγωγή θερμότητας κατά τη διάρκεια των φάσεων «OFF».
Ως σημείο εκκίνησης για τη λύση των κυττάρων ζύμης:

Για εναιωρήματα ζύμης με υψηλή αντοχή, πυκνή βιομάζα P. pastoris ή δύσκολη εκχύλιση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, αυξήστε σταδιακά τον αθροιστικό χρόνο ενεργοποίησης (ON-time). Για θερμοευαίσθητες πρωτεΐνες ή ενζυμικές αναλύσεις, χρησιμοποιήστε μικρότερους παλμούς, μακρύτερες παύσεις ψύξης και χαμηλότερο αρχικό πλάτος.

Λύση ζύμης υψηλής απόδοσης σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων με το UIP400MTP

6. Διύλιση του λυσάτου

Μετά την υπερηχητική επεξεργασία, φυγοκεντρήστε τη μικροπλάκα ή μεταφέρετε τα δείγματα σε σωληνάρια για φυγοκέντρηση. Απομακρύνετε τα κυτταρικά υπολείμματα με φυγοκέντρηση σε κατάλληλη ταχύτητα και θερμοκρασία. Συλλέξτε τον υπερκείμενο για περαιτέρω ανάλυση.

Ανάλογα με την εφαρμογή, το λύσμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για:

• Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών
• δοκιμασίες ενζυμικής δραστηριότητας
• SDS-PAGE και Western blotting
• ELISA και ανοσολογικές αναλύσεις
• Πρωτεομική ανάλυση LC-MS/MS
• ανάλυση μεταβολιτών
• Καθαρισμός DNA ή RNA

7. Βελτιστοποίηση και τεκμηρίωση της μεθόδου

Για να εξασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα της λύσης της μαγιάς, καταγράψτε όλες τις σχετικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένου του στελέχους, των συνθηκών καλλιέργειας και της οπτικής πυκνότητας (OD)₆₀₀, μάζα υγρού στοιχείου, σύνθεση ρυθμιστικού διαλύματος, τύπος πλάκας, όγκος δείγματος, πλάτος, κύκλος παλμού, αθροιστικός χρόνος ενεργοποίησης, μέθοδος ψύξης και τελική θερμοκρασία δείγματος.
Εάν ο υπερηχητικός μετατροπέας της Hielscher διαθέτει λειτουργία αυτόματης καταγραφής δεδομένων, τα δεδομένα της διαδικασίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τεκμηρίωση, ανάπτυξη μεθόδων, κλιμάκωση και έλεγχο ποιότητας.

Συμβουλές βελτιστοποίησης για τη λύση της μαγιάς

Για μέγιστη απελευθέρωση πρωτεϊνών, χρησιμοποιήστε πυκνά εναιωρήματα ζύμης, υψηλή ένταση υπερήχων και επαρκή αθροιστικό χρόνο λειτουργίας. Για ευαίσθητες πρωτεΐνες, μειώστε το πλάτος, παρατείνετε τις παύσεις ψύξης και διατηρήστε την πλάκα κρύα καθ’ όλη τη διάρκεια της διαδικασίας.
Εάν η λύση είναι ατελής, αυξήστε σταδιακά το χρόνο υπερήχησης, δοκιμάστε ενζυματική προεπεξεργασία, μειώστε το ιξώδες του δείγματος ή βελτιστοποιήστε το ρυθμιστικό διάλυμα. Εάν οι πρωτεΐνες υποστούν αποικοδόμηση ή χάσουν τη δραστικότητά τους, βελτιώστε την ψύξη, μειώστε τα διαστήματα ON, προσθέστε αναστολείς και βεβαιωθείτε ότι το σύστημα απορρυπαντικών είναι συμβατό με την πρωτεΐνη-στόχο.
Επειδή τα στελέχη ζύμης διαφέρουν σημαντικά ως προς τη δομή του κυτταρικού τοιχώματος, τη φάση ανάπτυξης, το σύστημα έκφρασης και την πυκνότητα της βιομάζας, συνιστάται η χρήση ενός σύντομου πίνακα βελτιστοποίησης. Για παράδειγμα, δοκιμάστε τρία πλάτη, δύο κύκλους παλμών και δύο συνολικούς χρόνους ενεργοποίησης, και στη συνέχεια αξιολογήστε την αποτελεσματικότητα της λύσης και την ακεραιότητα της πρωτεΐνης.

Πλεονεκτήματα των συσκευών υπερήχων για μικροπλάκες της Hielscher για τη λύση της μαγιάς

Τα συστήματα υπερήχων για μικροπλάκες της Hielscher είναι ιδανικά για εργαστήρια που χρειάζονται αναπαραγώγιμη λύση σε πολλά δείγματα. Εξαλείφουν τον αργό χειρισμό ενός δείγματος κάθε φορά που απαιτείται από την υπερηχητική επεξεργασία με ανιχνευτή και μειώνουν τη μεταβλητότητα που προκαλείται από τη χειροκίνητη τοποθέτηση του ανιχνευτή, το βάθος εμβάπτισης και τις διαφορές στον χειρισμό μεταξύ των δειγμάτων.

Τα βασικά πλεονεκτήματα περιλαμβάνουν:

• Επεξεργασία υψηλής απόδοσης: Υποβάλετε σε υπερήχους πολλά δείγματα ζύμης παράλληλα σε μικροπλάκες ή σε συμβατές βάσεις δειγμάτων.
• Συνθήκες αναπαραγωγής: Ίδιες συνθήκες υπερήχησης σε όλα τα φρεάτια, για ομοιόμορφα και συγκρίσιμα αποτελέσματα λύσης.
• Δεν υπάρχει διασταυρούμενη μόλυνση από τον καθετήρα: Τα δείγματα παραμένουν σφραγισμένα κατά τη διάρκεια της υπερηχητικής επεξεργασίας, μειώνοντας έτσι τη μεταφορά ουσιών και τα στάδια καθαρισμού.
• Κατάλληλο για ανθεκτικά κύτταρα: Τα υπερηχητικά κύματα υψηλής έντασης συμβάλλουν στη διάσπαση των κυτταρικών τοιχωμάτων της μαγιάς.
• Αποτελεσματική ροή εργασίας: Ιδανικό για τη διαλογή στελεχών, κλώνων, συνθηκών έκφρασης και ρυθμιστικών διαλυμάτων λύσης.
• Αποτελεσματική ροή εργασίας: Προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις, αυτόματη καταγραφή δεδομένων και κατάλληλο για αυτοματοποίηση εργαστηριακών διαδικασιών.

Εφαρμογές στη βιοτεχνολογία της ζύμης και στην έρευνα στις βιοεπιστήμες

Η λύση ζύμης με υπερήχους σε μικροπλάκες υποστηρίζει πολλές ερευνητικές διαδικασίες και ροές εργασίας διαλογής. Στην έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, οι κλώνοι P. pastoris και S. cerevisiae μπορούν να υποστούν λύση παράλληλα, προκειμένου να συγκριθούν τα επίπεδα έκφρασης ή η ενζυμική δραστηριότητα. Στη βιολογία συστημάτων και στις επιστήμες «ομικής», η τυποποιημένη λύση βελτιώνει τη συγκρισιμότητα μεταξύ διαφορετικών συνθηκών. Στη μικροβιολογία, η υπερηχητική επεξεργασία διευκολύνει την ταχεία παρασκευή λυμάτων από πολλαπλά στελέχη, συνθήκες καλλιέργειας ή επεξεργασίες στρες.
Στους τυπικούς τομείς εφαρμογής περιλαμβάνονται:

• εξαγωγή πρωτεϊνών από μαγιά
• διαλογή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών
• έλεγχος ενζυμικής δραστηριότητας
• επιλογή κλώνων μετά τη μεταμόρφωση
• βελτιστοποίηση της ζύμωσης
• προετοιμασία δειγμάτων πρωτεομικής
• προετοιμασία δειγμάτων για μεταβολομική ανάλυση
• μελέτες διάσπασης του κυτταρικού τοιχώματος
• μικροβιολογικές αναλύσεις υψηλής απόδοσης

Η αξιόπιστη λύση της μαγιάς ξεκινά με ελεγχόμενη υπερηχητική επεξεργασία

Η λύση της μαγιάς μπορεί να αποδειχθεί δύσκολη όταν αυξάνεται ο αριθμός των δειγμάτων, αλλά τα υπερηχητικά συστήματα μικροπλακών της Hielscher καθιστούν τη διαδικασία ταχύτερη, καθαρότερη και πιο αναπαραγώγιμη. Τα μοντέλα UIP400MTP και UIP550MTP επιτρέπουν στους ερευνητές να επεξεργάζονται ολόκληρες πλάκες υπό καθορισμένες συνθήκες υπερήχων, βελτιώνοντας την παραγωγικότητα και μειώνοντας παράλληλα τον χειροκίνητο χειρισμό.
Για τους μικροβιολόγους, τους μοριακούς βιολόγους, τους επιστήμονες που ασχολούνται με τις πρωτεΐνες και τα εργαστήρια βιοτεχνολογίας, η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για την αποτελεσματική και αναπαραγώγιμη απελευθέρωση ενδοκυτταρικών συστατικών της μαγιάς.

Βιβλιογραφία / Αναφορές