Υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών στην πρωτεομική Shotgun – Σημείωση εφαρμογής
Η πρωτεομική ανάλυση τύπου «shotgun» εξαρτάται από την αποτελεσματική και αναπαραγώγιμη προετοιμασία των δειγμάτων, προκειμένου να μετατραπεί το σύνθετο βιολογικό υλικό σε πεπτίδια έτοιμα για ανάλυση με LC-MS/MS. Ο υπερηχητικός διαλυτιστής μικροπλακών UIP400MTP υποστηρίζει αυτή τη διαδικασία, επιτρέποντας την τυποποιημένη, παράλληλη υπερηχητική επεξεργασία δειγμάτων μικρού όγκου, βοηθώντας τα εργαστήρια να βελτιώσουν τη διάσπαση, την εκχύλιση και την επαναδιαλυτοποίηση σε ροές εργασίας που βασίζονται σε μικροπλάκες. Αυτή η σημείωση εφαρμογής περιγράφει τον τρόπο με τον οποίο το UIP400MTP μπορεί να ενσωματωθεί στην προετοιμασία πρωτεομικών δειγμάτων, χρησιμοποιώντας ως εργαστηριακά δοκιμασμένο παράδειγμα μια δημοσιευμένη ροή εργασίας με εξωκυτταρικά κυστίδια από μελέτες PLA2G12A/Th17.
Υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών για πιο αναπαραγώγιμη πρωτεομική ανάλυση τύπου «shotgun»
Για τους ερευνητές στον τομέα της πρωτεομικής, η αναπαραγώγιμη προετοιμασία δειγμάτων είναι ζωτικής σημασίας για την απόκτηση δεδομένων LC-MS/MS υψηλής ποιότητας. Ο υπερηχητικός επεξεργαστής μικροπλακών UIP400MTP υποστηρίζει την τυποποιημένη, παράλληλη υπερηχητική επεξεργασία σε ροές εργασίας που βασίζονται σε πλάκες καθώς και σε ροές εργασίας μικρού όγκου/υψηλής απόδοσης.
Είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για εργαστήρια που ασχολούνται με:
- Μεγάλα σύνολα δειγμάτων που απαιτούν ομοιόμορφη επεξεργασία σε πολλά φρεάτια
- Υλικό περιορισμένης ποσότητας, όπου η απώλεια δείγματος και η μεταβλητότητα πρέπει να ελαχιστοποιηθούν
- Δείγματα πλούσια σε λιπίδια, όπως τα εξωκυτταρικά κυστίδια
- Σύνθετα βιολογικά παρασκευάσματα που απαιτούν αποτελεσματική διάσπαση, εκχύλιση ή επαναδιαλυτοποίηση
- Συγκριτική πρωτεομική με τη μέθοδο «shotgun», όπου η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των συνθηκών και των επαναλήψεων είναι ουσιαστικής σημασίας
Με την ενσωμάτωση της υπερηχητικής επεξεργασίας μικροπλακών πριν από την πέψη, οι ερευνητές μπορούν να βελτιώσουν την προετοιμασία των δειγμάτων για:
- Εξαγωγή και επαναδιαλυτοποίηση πρωτεϊνών
- Πέψη με τρυψίνη/Lys-C
- Συλλογή δεδομένων με τη μέθοδο Nano-LC/MS/MS
- Ποσοτική ανάλυση πρωτεομικής κατάντη
Μάθετε πώς η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών συμβάλλει στη μείωση της μεταβλητότητας που οφείλεται στη χειροκίνητη επεξεργασία, στη βελτίωση της διάσπασης των δειγμάτων και στην προετοιμασία σύνθετων βιολογικών δειγμάτων για αξιόπιστη ανάλυση LC-MS/MS.
Η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών μπορεί να προσφέρει τα εξής οφέλη:
- Βασικές εγκαταστάσεις πρωτεομικής
- Ερευνητικά εργαστήρια για τα ηλεκτρικά αυτοκίνητα
- Εργαστήρια ανοσολογίας και κυτταρικής βιολογίας
- Ομάδες μεταφραστικής έρευνας
- Ομάδες στον τομέα των βιοεπιστημών που επεκτείνουν τις δραστηριότητές τους από την προετοιμασία μεμονωμένων δειγμάτων σε ροές εργασίας υψηλότερης απόδοσης
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Προετοιμασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης για την ανάλυση του πρωτεώματος των εξωκυτταρικών κυστιδίων
Τι είναι η πρωτεομική Shotgun;
Η πρωτεομική τύπου «shotgun» έχει καταστεί μια κεντρική αναλυτική στρατηγική για τον χαρακτηρισμό σύνθετων βιολογικών δειγμάτων, από λύματα ολόκληρων κυττάρων και εκχυλίσματα ιστών έως καθαρισμένα οργανίδια, εξωκυτταρικά κυστίδια και κλινικά δείγματα χαμηλής απόδοσης. Το βασικό της πλεονέκτημα έγκειται στη σύζευξη της πέψης πρωτεϊνών, της υγρής χρωματογραφίας υψηλής ανάλυσης σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας tandem και της υπολογιστικής εξαγωγής συμπερασμάτων από πεπτίδια προς πρωτεΐνες. Ωστόσο, η ποιότητα του τελικού συνόλου δεδομένων του πρωτεώματος καθορίζεται πολύ πριν το δείγμα φτάσει στο φασματογράφο μάζας. Η αποτελεσματική διάσπαση του δείγματος, η διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών, η απομάκρυνση των παρεμβαλλόμενων ουσιών, η αναπαραγώγιμη ενζυμική πέψη και η αξιόπιστη ανάκτηση πεπτιδίων είναι όλα καθοριστικά για το βάθος κάλυψης και την ποσοτική αξιοπιστία.
Για τους ερευνητές στον τομέα της πρωτεομικής και τα εργαστήρια βιοεπιστημών που εργάζονται με περιορισμένα ή πολύτιμα δείγματα, η προετοιμασία των δειγμάτων αποτελεί συχνά το σημείο συμφόρησης.
Το UIP400MTP εξασφαλίζει αξιόπιστη προετοιμασία δειγμάτων και εύκολη ενσωμάτωση με τις υπάρχουσες ροές εργασίας εργαστηρίου
Η πρόκληση των εξωκυτταρικών κυστιδίων στην πρωτεομική
Τα εξωκυτταρικά κυστίδια (EV), για παράδειγμα, αποτελούν μια ιδιαίτερα απαιτητική κατηγορία δειγμάτων. Πρόκειται για σωματίδια νανοκλίμακας, που περιβάλλονται από μεμβράνη και είναι πλούσια σε λιπίδια, με σχετικά χαμηλή απόδοση πρωτεϊνών και υψηλό κίνδυνο μεταφοράς λιπιδίων, αλάτων, απορρυπαντικών, πρωτεϊνών ορού και άλλων συστατικών της μήτρας. Αυτά τα χαρακτηριστικά μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά την αποτελεσματικότητα της πέψης, την απόδοση της χρωματογραφίας, τη σταθερότητα κατά την ηλεκτροψεκασμό και την ταυτοποίηση των πεπτιδίων. Επομένως, μια ροή εργασίας προετοιμασίας για την πρωτεομική ανάλυση των EV πρέπει να είναι αρκετά ισχυρή ώστε να διασπά τις δομές των κυστιδίων και να διαλύει το πρωτεϊνικό φορτίο, παραμένοντας παράλληλα συμβατή με την ενζυμική πέψη και την ανάλυση LC-MS/MS που ακολουθούν.
Στο πλαίσιο αυτό, η υπερηχητική επεξεργασία συμβατή με μικροπλάκες προσφέρει μια πρακτική προσέγγιση για την αναπαραγώγιμη και παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων. Τα μοντέλα υπερηχητικών συσκευών της Hielscher για μικροπλάκες UIP400MTP (400 W) και UIP550MTP (550 W) έχουν σχεδιαστεί για την υπερηχητική επεξεργασία δειγμάτων σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων και δοχεία μικρού όγκου, υποστηρίζοντας ροές εργασίας υψηλότερης απόδοσης σε σύγκριση με τις συμβατικές υπερηχητικές συσκευές με έναν μόνο αισθητήρα. Για τα εργαστήρια πρωτεομικής, αυτή η μορφή είναι ελκυστική, καθώς μπορεί να μειώσει τη μεταβλητότητα που οφείλεται στην ανθρώπινη παρέμβαση, να βελτιώσει την παράλληλη επεξεργασία πολλαπλών δειγμάτων και να ενσωματωθεί πιο φυσικά στις ροές εργασίας προετοιμασίας δειγμάτων που βασίζονται σε πλάκες.
Παραδειγματική ροή εργασιών
Μια πρόσφατη ροή εργασίας πρωτεομικής εξωκυτταρικών κυστιδίων στη βιολογία των κυττάρων Th17 που ενεργοποιούνται από την PLA2G12A αποτελεί ένα χρήσιμο, εργαστηριακά δοκιμασμένο παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο ο υπερηχητικός επεξεργαστής μικροπλακών UIP400MTP μπορεί να ενσωματωθεί στην προετοιμασία δειγμάτων για πρωτεομική ανάλυση τύπου «shotgun». Σε αυτή τη σειρά μελετών, τα δείγματα εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για πρωτεομική ανάλυση χρησιμοποιώντας επεξεργασία με μεθανόλη, υπερηχητική διάσπαση με το UIP400MTP, φυγοκέντρηση, ξήρανση, πέψη με τρυψίνη/Lys-C και LC νανοροής σε συνδυασμό με MS υψηλής ανάλυσης. Η ίδια βιολογική εργασία αναφέρθηκε αρχικά ως προδημοσίευση στο bioRxiv και στη συνέχεια δημοσιεύθηκε στο περιοδικό Cell Reports, όπου η πρωτεομική ανάλυση συνέβαλε στον χαρακτηρισμό του τρόπου με τον οποίο η PLA2G12A μεταβάλλει τις πρωτεΐνες φορτίου των EV στο πλαίσιο των παθογόνων αποκρίσεων των Τ-κυττάρων.
Συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκα 96 φρεατίων, για εκχύλιση πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης
Σονικατορ: UIP400MTP μικροπλακών υπερήχων
Εισαγωγή: 5 µg ισοδύναμο πρωτεΐνης EV
Πέψη: Τρυψίνη/Lys-C
Αποτελέσματα: Πρωτεομική ανάλυση με Nano-LC-MS/MS / DIA
Οδηγίες βήμα προς βήμα: Προετοιμασία δειγμάτων ηλεκτρικών οχημάτων (EV) με τη βοήθεια του UIP400MTP για πρωτεομική ανάλυση Shotgun
Αυτή η ροή εργασίας περιγράφει μια μέθοδο προετοιμασίας δειγμάτων για πρωτεομική ανάλυση τύπου «shotgun» εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV) με χαμηλή ποσότητα εισόδου, χρησιμοποιώντας τον υπερηχητικό επεξεργαστή μικροπλακών UIP400MTP. Βασίζεται σε μια δημοσιευμένη ροή εργασίας πρωτεομικής ανάλυσης EV, κατά την οποία τα δείγματα EV κανονικοποιήθηκαν, ξηράνθηκαν, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μεθανόλη, υποβλήθηκαν σε υπερήχους, υποβλήθηκαν σε πέψη με τρυψίνη/Lys-C, οξινίστηκαν και αναλύθηκαν με nano-LC-MS/MS.
Η μέθοδος απευθύνεται σε ερευνητές του τομέα της πρωτεομικής και σε εργαστήρια βιοεπιστημών που προετοιμάζουν εξωκυτταρικά σωματίδια (EVs) ή άλλα βιολογικά δείγματα μικρού όγκου και πλούσια σε λιπίδια, με σκοπό την εφαρμογή της πρωτεομικής μεθόδου «bottom-up shotgun».
Επισκόπηση της ροής εργασίας
| Σκηνή | Σκοπός | Κύριο αποτέλεσμα |
|---|---|---|
| Προετοιμασία του ηλεκτρικού οχήματος | Απομόνωση, πλύση και ποσοτικοποίηση δειγμάτων εξωκυτταρικών σωματιδίων (EV) | Κανονικοποιημένη τιμή εισόδου EV |
| Ξήρανση δειγμάτων | Απομακρύνετε το υγρό πριν από την επεξεργασία με τη βοήθεια διαλύτη | Αποξηραμένο υλικό EV |
| Επεξεργασία με μεθανόλη | Υποστήριξη της διάσπασης του πλούσιου σε λιπίδια υλικού των εξωκυτταρικών σωματιδίων (EV) | Δείγμα εμποτισμένο με μεθανόλη |
| Υπερηχητική επεξεργασία με UIP400MTP | Προώθηση της διάσπασης, της εκχύλισης και της ομογενοποίησης | Επεξεργασμένο δείγμα EV |
| πέψη | Δημιουργία πεπτιδίων από πρωτεΐνες EV | Πεπτιδική πέψη με τρυψίνη/Lys-C |
| Ανάλυση LC-MS/MS | Διαχωρισμός, ανίχνευση και ποσοτικοποίηση πεπτιδίων | Σύνολο δεδομένων πρωτεομικής |
| Ανάλυση δεδομένων | Αναγνώριση και ποσοτικοποίηση πεπτιδίων και πρωτεϊνών | Αποτελέσματα σε επίπεδο πρωτεϊνών |
Πρωτόκολλο βήμα προς βήμα
| βήμα | Οδηγίες | Κρίσιμες παράμετροι |
|---|---|---|
| 1 | Προετοιμάστε καθαρισμένα δείγματα EV ακολουθώντας την καθιερωμένη διαδικασία απομόνωσης του εργαστηρίου. | Απομακρύνετε τα κύτταρα, τα υπολείμματα και τους κύριους ρύπους πριν από την προετοιμασία για πρωτεομική ανάλυση. |
| 2 | Προσδιορίστε ποσοτικά την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες EV, για παράδειγμα με τη μέθοδο BCA. | Κανονικοποιήστε όλα τα δείγματα ώστε να έχουν την ίδια ποσότητα πρωτεΐνης ως είσοδο. |
| 3 | Μεταφέρετε 5 µg ισοδύναμου πρωτεΐνης EV σε καθαρούς σωλήνες PCR ή σε συμβατούς σωλήνες μικρού όγκου. | Χρησιμοποιήστε σωληνάρια χαμηλής πρόσφυσης όταν υπάρχει κίνδυνος απώλειας δείγματος. |
| 4 | Στεγνώστε πλήρως τα δείγματα EV. | Αποφύγετε την υπερθέρμανση· βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχει ορατό υγρό. |
| 5 | Προσθέστε 25 µL μεθανόλης σε κάθε αποξηραμένο δείγμα EV. | Βεβαιωθείτε ότι το αποξηραμένο υλικό έχει διαβραχεί πλήρως. |
| 6 | Υποβάλετε τα δείγματα σε υπερήχους για 3 λεπτά χρησιμοποιώντας τον υπερηχητικό επεξεργαστή μικροπλακών UIP400MTP. | Χρησιμοποιήστε τις ίδιες ρυθμίσεις υπερήχων και την ίδια λογική διάταξης για όλα τα δείγματα. |
| 7 | Φυγοκεντρήστε τα δείγματα που έχουν υποβληθεί σε υπερήχους στα 19.000 × g για 20 λεπτά στους 4 °C. | Αποφύγετε να ανακατέψετε τυχόν ιζήματα ή αδιάλυτα υλικά μετά τη φυγοκέντρηση. |
| 8 | Αφαιρέστε προσεκτικά 20 µL του υπερκείμενου υγρού. | Χρησιμοποιήστε την ίδια τεχνική πιπετάρισμα για όλα τα δείγματα. |
| 9 | Στεγνώστε πλήρως το υπόλοιπο δείγμα. | Προχωρήστε απευθείας στην πέψη ή αποθηκεύστε το μόνο υπό επικυρωμένες συνθήκες. |
| 10 | Προσθέστε 4 µL διαλύματος τρυψίνης/Lys-C σε συγκέντρωση 100 ng/µL σε διάλυμα διττανθρακικού αμμωνίου 50 mM. | Παρασκευάστε φρέσκο ενζυμικό διάλυμα ή χρησιμοποιήστε κατάλληλα αποθηκευμένα υποδείγματα. |
| 11 | Υποβάλετε το δείγμα σε σύντομη υπερήχηση για να διαλυθεί η ξηρή πρωτεΐνη στο διάλυμα πέψης. | Συλλέξτε όλο το υγρό που βρίσκεται στον πυθμένα του σωλήνα μετά την υπερηχητική επεξεργασία. |
| 12 | Αφήστε το μείγμα να υποστεί πέψη για 2 ώρες στους 37 °C, ανακινώντας με ταχύτητα 300 rpm. | Κρατήστε τα καπάκια καλά κλειστά για να αποφύγετε την εξάτμιση. |
| 13 | Προσθέστε 1 µL TFA 1,25% για να οξινίσετε το προϊόν της πέψης. | Η οξίνιση διακόπτει την πέψη και προετοιμάζει τα πεπτίδια για LC-MS/MS. |
| 14 | Μεταφέρετε το προϊόν της πέψης σε φιαλίδια ή πλάκες συμβατά με LC-MS. | Αποφύγετε τη μεταφορά αδιάλυτων υπολειμμάτων. |
| 15 | Ανάλυση με τη μέθοδο nano-LC-MS/MS. | Χρησιμοποιήστε σταθερό όγκο έγχυσης, σταθερή κλίση LC και σταθερές ρυθμίσεις καταγραφής MS. |
| 16 | Επεξεργαστείτε τα ακατέργαστα δεδομένα χρησιμοποιώντας λογισμικό DIA, DDA ή στοχευμένης πρωτεομικής, ανάλογα με την περίπτωση. | Εφαρμόστε την κατάλληλη βάση δεδομένων, την ειδικότητα των ενζύμων, τις ρυθμίσεις τροποποίησης και τα όρια FDR. |
Υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων UIP400MTP
Γιατί να χρησιμοποιήσουμε υπερήχους σε μικροπλάκες;
Το UIP400MTP επιτρέπει την τυποποιημένη, παράλληλη υπερηχητική επεξεργασία δειγμάτων μικρού όγκου. Αυτό είναι χρήσιμο όταν η αναπαραγωγιμότητα, η μικρή ποσότητα δείγματος και η παράλληλη επεξεργασία πολλών δειγμάτων είναι σημαντικά κριτήρια.
Χρησιμοποιήστε οποιαδήποτε τυπική μικροπλάκα! Προετοιμασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης με το UIP400MTP
Η αναφερόμενη ροή εργασίας πρωτεομικής ανάλυσης των EV περιελάμβανε εισροή EV ισοδύναμη με 5 µg πρωτεΐνης, 25 µL μεθανόλης, 3 λεπτά υπερηχητικής επεξεργασίας με UIP400MTP, πέψη με τρυψίνη/Lys-C, οξίνιση με TFA και ανάλυση με nano-LC-MS/MS.
Συνιστώμενα στάδια LC-MS/MS και ανάλυσης δεδομένων
Μετά την πέψη και την οξίνιση, τα δείγματα μπορούν να αναλυθούν με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης νανο-ροής, σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας tandem υψηλής ανάλυσης. Στην δημοσιευμένη ροή εργασίας, τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε ένα σύστημα νανο-LC και αναλύθηκαν με τη μέθοδο της ανεξάρτητης από δεδομένα συλλογής δεδομένων (data-independent acquisition) σε ένα φασματογράφο μάζας Orbitrap.
| Σκηνή | Σύσταση | Σκοπός |
|---|---|---|
| Φόρτωση δειγμάτων | Χρησιμοποιήστε μια παγίδα C18 ή ισοδύναμο σύστημα φόρτωσης πεπτιδίων. | Συμπυκνώνει τα πεπτίδια και απομακρύνει τις εξαιρετικά πολικές προσμείξεις. |
| Διαχωρισμός πεπτιδίων | Χρησιμοποιήστε LC αντίστροφης φάσης με νανοροή. | Βελτιώνει τον διαχωρισμό των πεπτιδίων και την ευαισθησία της φασματομετρίας μάζας (MS). |
| Εξαγορά της MS | Χρησιμοποιήστε τη μέθοδο DIA, DDA ή στοχευμένη MS, ανάλογα με τον σχεδιασμό της μελέτης. | Παράγει φασματικά δεδομένα σε επίπεδο πεπτιδίων. |
| Αναζήτηση στη βάση δεδομένων | Χρησιμοποιήστε μια βάση δεδομένων αναφοράς κατάλληλη για το συγκεκριμένο είδος. | Υποστηρίζει την ταυτοποίηση πεπτιδίων και πρωτεϊνών. |
| Έλεγχος FDR | Εφαρμόστε όρια για το ποσοστό ψευδών ανακαλύψεων σε πεπτίδια και πρωτεΐνες. | Ελέγχει το επίπεδο εμπιστοσύνης της ταυτοποίησης. |
| Ποσοτικοποίηση | Εξαγωγή πινάκων αφθονίας πεπτιδίων, προδρόμων και πρωτεϊνών. | Επιτρέπει τη στατιστική σύγκριση μεταξύ ομάδων. |
Λίστα ελέγχου ποιότητας
- Επιβεβαιώστε ότι η ποσότητα πρωτεΐνης ισοδύναμης με EV είναι η ίδια σε όλα τα δείγματα.
- Χρησιμοποιήστε τυχαιοποιημένα ή ισορροπημένα σχήματα επεξεργασίας δειγμάτων.
- Διατηρήστε σταθερούς τον όγκο της μεθανόλης, τον χρόνο υπερήχησης, τον χρόνο ξήρανσης και τον όγκο της πέψης.
- Παρακολούθηση της απόδοσης των πεπτιδίων και των ταυτοποιήσεων των συνολικών πρωτεϊνών.
- Ελέγξτε το ποσοστό των αποτυχημένων διασπάσεων και την κατανομή του μήκους των πεπτιδίων.
- Ελέγξτε το σχήμα της χρωματογραφικής κορυφής και την αναπαραγωγιμότητα του χρόνου κατακράτησης.
- Προσθέστε κενά για να παρακολουθείτε τη μεταφορά.
- Χρησιμοποιήστε συγκεντρωτικά δείγματα ποιοτικού ελέγχου για μελέτες μεγαλύτερης κλίμακας.
- Αξιολογήστε τον συντελεστή διακύμανσης των επαναλήψεων.
- Χρησιμοποιήστε την PCA ή συναφείς μεθόδους για τον εντοπισμό επιδράσεων παρτίδας ή δειγμάτων που αποτελούν ακραίες τιμές.
Συστάσεις σχετικά με την τήρηση πρακτικών
Κατά τη δημοσίευση ή την τεκμηρίωση αυτής της ροής εργασίας, αναφέρετε την ποσότητα εισόδου EV, τη μορφή της πλάκας, τον όγκο μεθανόλης, το πλάτος και τον χρόνο υπερήχησης του UIP400MTP, τις συνθήκες φυγοκέντρησης, τη μέθοδο ξήρανσης, το ρυθμιστικό διάλυμα πέψης, τη συγκέντρωση του ενζύμου, τον χρόνο πέψης, τις συνθήκες οξίνισης, την πλατφόρμα LC-MS/MS, τη λειτουργία καταγραφής δεδομένων, την έκδοση του λογισμικού, τη βάση δεδομένων, το όριο FDR, τη μέθοδο κανονικοποίησης και τη στατιστική ροή εργασίας.
Όλα τα συστήματα υπερήχων για μικροπλάκες της Hielscher καταγράφουν αυτόματα σημαντικές παραμέτρους της διαδικασίας, όπως το πλάτος, τη διάρκεια της υπερηχητικής επεξεργασίας και τη θερμοκρασία, με σήμανση ημερομηνίας και ώρας, σε μορφή αρχείου CSV στην ενσωματωμένη κάρτα SD. Η καταγραφή δεδομένων για την αναπαραγωγιμότητα και τον έλεγχο ποιότητας δεν ήταν ποτέ πιο εύκολη!
Για την πρωτεομική ανάλυση DIA, χρησιμοποιήστε ομοιόμορφες ρυθμίσεις καταγραφής σε όλα τα δείγματα και συμπεριλάβετε, όπου είναι δυνατόν, συγκεντρωτικά δείγματα ελέγχου ποιότητας. Παρακολουθήστε τον αριθμό των προδρόμων, τη σταθερότητα του χρόνου κατακράτησης και τη μεταβλητότητα μεταξύ των επαναλήψεων.
Αυτή η ροή εργασίας αποτελεί ένα εργαστηριακά δοκιμασμένο παράδειγμα για την πρωτεομική ανάλυση ηλεκτρικών οχημάτων (EV). Για άλλους τύπους δειγμάτων, βελτιστοποιήστε την ποσότητα εισόδου, τις συνθήκες διαλύτη, το χρόνο υπερήχησης, τον όγκο πέψης και τη στρατηγική έγχυσης LC-MS/MS πριν προχωρήσετε σε πλήρη μελέτη.
Η μελέτη αναλυτικά: Πρωτεομική ανάλυση EV Shotgun στη μελέτη PLA2G12A
Η μελέτη για την PLA2G12A αποτελεί ένα συγκεκριμένο παράδειγμα χρήσης του UIP400MTP σε μια ροή εργασίας πρωτεομικής τύπου «shotgun». Το βιολογικό ερώτημα ήταν πώς η εκκριόμενη φωσφολιπάση PLA2G12A τροποποιεί τα εξωκυτταρικά κυστίδια που προέρχονται από κύτταρα Th17 και, ως εκ τούτου, επηρεάζει τη διαφοροποίηση των παθογόνων Τ-κυττάρων. Οι συγγραφείς έδειξαν ότι η PLA2G12A δρα στις μεμβράνες των εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV) παράγοντας λυσοφωσφολιπίδια, συμπεριλαμβανομένης της 1-ολεοϋλ-λυσοφωσφατιδυλαιθανολαμίνης, και ότι η επακόλουθη σηματοδότηση μέσω του λυσοφωσφατιδικού οξέος (LPA) μέσω της LPA2 συμβάλλει στη διαφοροποίηση των Th17. Πέρα από τη σηματοδότηση μέσω λιπιδίων, οι μελέτες εξέτασαν επίσης το φορτίο των εξωκυτταρικών κυστιδίων, συμπεριλαμβανομένης της περιεκτικότητας σε RNA και πρωτεΐνες, καθιστώντας την πρωτεομική ανάλυση τύπου «shotgun» σημαντικό συστατικό της στρατηγικής χαρακτηρισμού.
Στη διαδικασία παρασκευής του EV, τα κύτταρα Th17 καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε εμβρυϊκό βοοειδές ορό χωρίς εξωσώματα. Τα υπερκείμενα της καλλιέργειας υποβλήθηκαν πρώτα σε φυγοκέντρηση για την απομάκρυνση των κυττάρων, διηθήθηκαν μέσω φίλτρου 0,22 µm, συμπυκνώθηκαν με υπερδιήθηση/υπερφυγοκέντρηση, πλύθηκαν, επαναδιαλύθηκαν σε PBS και ποσοτικοποιήθηκαν με τη μέθοδο προσδιορισμού πρωτεϊνών BCA. Αυτή η προπαρασκευή των EV εξασφάλισε ότι μια καθορισμένη ποσότητα υλικού EV, ισοδύναμη με πρωτεΐνη, θα μπορούσε να μεταφερθεί στη ροή εργασίας της πρωτεομικής ανάλυσης.
Για την πρωτεομική ανάλυση τύπου «shotgun», οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν δείγματα EV που αντιστοιχούσαν σε 5 µg ισοδύναμων πρωτεϊνών. Τα δείγματα αυτά ξηράνθηκαν σε σωληνάρια PCR και προστέθηκαν 25 µL μεθανόλης. Στη συνέχεια, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερηχητική επεξεργασία για 3 λεπτά χρησιμοποιώντας τον υπερηχητικό επεξεργαστή μικροπλακών UIP400MTP. Μετά την υπερηχητική επεξεργασία, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 4°C για 20 λεπτά στα 19.000 × g. Μετά την αφαίρεση 20 µL υπερκείμενου υγρού, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν μέχρι να στεγνώσουν. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες διαλύθηκαν με υπερήχους σε 4 µL διαλύματος τρυψίνης/Lys-C συγκέντρωσης 100 ng/µL σε 50 mM διττανθρακικό αμμώνιο. Η πέψη πραγματοποιήθηκε για 2 ώρες στους 37°C με ανάδευση στα 300 rpm. Το προϊόν της πέψης οξυνίστηκε με 1 µL τριφθοροξικού οξέος 1,25% και υποβλήθηκε σε φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης τύπου tandem με LC νανοροής.
Αυτή η ροή εργασίας αναδεικνύει διάφορες χρήσιμες αρχές για την πρωτεομική ανάλυση εξωκυτταρικών σωματιδίων (EV) με μικρή ποσότητα εισόδου. Πρώτον, η ποσότητα εισόδου κανονικοποιήθηκε με βάση το πρωτεϊνικό ισοδύναμο, κάτι που είναι σημαντικό κατά τη σύγκριση EV από διαφορετικούς γονότυπους ή θεραπείες. Δεύτερον, χρησιμοποιήθηκε μεθανόλη πριν από την υπερηχητική επεξεργασία, διευκολύνοντας τη διάσπαση και την εκχύλιση, ενώ παράλληλα αποφεύχθηκαν τα συστήματα απορρυπαντικών που ενδέχεται να περιπλέξουν την ανάλυση LC-MS/MS. Τρίτον, το στάδιο της υπερήχησης ήταν σύντομο και τυποποιημένο, κάτι που είναι συμβατό με την παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων. Τέταρτον, η πέψη με τρυψίνη/Lys-C πραγματοποιήθηκε σε πολύ μικρό όγκο, μειώνοντας την αραίωση και διευκολύνοντας την ανάκτηση πεπτιδίων από δείγματα χαμηλής περιεκτικότητας. Τέλος, η άμεση μετάβαση από την πέψη στην οξίνιση και την ανάλυση LC-MS/MS ελαχιστοποίησε τα περιττά στάδια χειρισμού.
Η μέθοδος LC-MS/MS που χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια περιελάμβανε διαχωρισμό αντίστροφης φάσης με νανοροή, σε συνδυασμό με φασματόμετρο μάζας Q-Exactive HF Orbitrap. Τα δείγματα παγιδεύτηκαν σε μια προ-στήλη C18 και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε μια αναλυτική στήλη εσωτερικής διαμέτρου 50 µm με ρυθμό ροής 200 nL/min και θερμοκρασία 40°C. Η κλίση κυμάνθηκε από χαμηλή περιεκτικότητα σε οργανικό διαλύτη έως 35% διαλύτη Β σε διάστημα 60 λεπτών, ακολουθούμενη από έκπλυση με υψηλή περιεκτικότητα σε οργανικό διαλύτη και επαναεξισορρόπηση. Η καταγραφή MS πραγματοποιήθηκε σε λειτουργία θετικών ιόντων χρησιμοποιώντας καταγραφή ανεξάρτητη από δεδομένα με διάσπαση λόγω σύγκρουσης υψηλότερης ενέργειας. Τα αρχεία DIA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό DIA-NN 1.8 με μια βιβλιοθήκη φασμάτων που είχε προβλεφθεί in silico.
Εξαγωγή πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης με την πλάκα 96 φρεατίων με υπερήχους UIP400MTP
Συχνές Ερωτήσεις
Ποιος επωφελείται περισσότερο από την υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών στην πρωτεομική μεθόδο «shotgun»;
Η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για εργαστήρια πρωτεομικής που επεξεργάζονται πολλαπλά δείγματα παράλληλα, συμπεριλαμβανομένων των κεντρικών εγκαταστάσεων, των ερευνητικών ομάδων πρωτεομικής, των εργαστηρίων ανοσολογίας, των ομάδων μεταφραστικής έρευνας και των εργαστηρίων βιοεπιστημών που στρέφονται προς ροές εργασίας LC-MS/MS υψηλότερης απόδοσης. Έχει ιδιαίτερη σημασία όταν η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των δειγμάτων είναι κρίσιμη.
Γιατί να χρησιμοποιήσετε το UIP400MTP αντί για ένα συμβατικό υπερηχητικό σύστημα με ηχητική κεφαλή;
Ένα συμβατικό υπερηχητικό σύστημα επεξεργασίας δειγμάτων επεξεργάζεται συνήθως τα δείγματα ένα-ένα και απαιτεί προσεκτικό καθαρισμό μεταξύ των δειγμάτων για τη μείωση της μεταφοράς ουσιών. Τα μοντέλα υπερηχητικών συσκευών για μικροπλάκες UIP400MTP και UIP550MTP υποστηρίζουν την παράλληλη υπερηχητική επεξεργασία σε μορφή μικροπλάκας ή μικρού όγκου, συμβάλλοντας στη μείωση του χειροκίνητου χειρισμού, στη βελτίωση της συνέπειας και στην απλοποίηση της προετοιμασίας πολλαπλών δειγμάτων. Επιτρέπουν επίσης την εύκολη ενσωμάτωση σε αυτοματοποιημένες ροές εργασίας.
Ποια είναι η θέση της υπερηχητικής επεξεργασίας στη ροή εργασίας της πρωτεομικής με τη μέθοδο «shotgun»;
Η υπερηχητική επεξεργασία εφαρμόζεται συνήθως κατά τη φάση της προ-πέψης στην προετοιμασία του δείγματος. Μπορεί να συμβάλει στη διάσπαση, την εκχύλιση, την ομογενοποίηση και την επαναδιαλυτοποίηση πριν από την ενζυμική πέψη με τρυψίνη, Lys-C ή μείγμα τρυψίνης και Lys-C.
Επιπλέον, η υπερηχητική επεξεργασία μπορεί επίσης να εφαρμοστεί κατά τη διάρκεια της πέψης, προκειμένου να επιταχυνθεί σημαντικά η ενζυματική πέψη των πρωτεϊνών. Ανακαλύψτε τις δυνατότητες της πέψης πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης με τη χρήση υπερήχων για μια γρήγορη πρωτεομική ροή εργασίας!
Είναι χρήσιμη η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών για την πρωτεομική ανάλυση των εξωκυτταρικών κυστιδίων;
Ναι. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια είναι σωματίδια πλούσια σε λιπίδια, που περικλείονται από μεμβράνη, και η επεξεργασία τους με επαναληψιμότητα μπορεί να αποτελεί πρόκληση. Στις αναφερόμενες μελέτες για το PLA2G12A, τα δείγματα εξωκυτταρικών κυστιδίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μεθανόλη, υποβλήθηκαν σε υπερήχους με το UIP400MTP, ξηράνθηκαν, υποβλήθηκαν σε πέψη με τρυψίνη/Lys-C και αναλύθηκαν με nano-LC/MS/MS.
Ποιοι τύποι δειγμάτων μπορούν να επωφεληθούν από την υπερηχητική επεξεργασία σε μικροπλάκες;
Η υπερηχητική επεξεργασία σε μικροπλάκες μπορεί να είναι χρήσιμη για κυτταρικά λύματα, κλάσματα οργανιδίων, ανοσοκαταβυθίματα, συσσωματώματα πρωτεϊνών, δείγματα πλούσια σε μεμβράνες, εξωκυτταρικά κυστίδια και άλλα βιολογικά παρασκευάσματα μικρού όγκου. Για κάθε τύπο δείγματος πρέπει να γίνεται βελτιστοποίηση όσον αφορά την ένταση και τη διάρκεια της υπερηχητικής επεξεργασίας, τις συνθήκες του διαλύτη, την ποσότητα του δείγματος και τη στρατηγική πέψης.
Η υπερηχητική επεξεργασία αντικαθιστά την ενζυμική πέψη;
Όχι. Η υπερηχητική επεξεργασία συμβάλλει στην προετοιμασία του δείγματος για την πέψη, βελτιώνοντας τη διάσπαση, την εκχύλιση ή την επαναδιαλυτοποίηση. Η πρωτεολυτική πέψη εξακολουθεί να είναι απαραίτητη για την παραγωγή πεπτιδίων για την πρωτεομική ανάλυση τύπου «bottom-up shotgun».
Διαβάστε περισσότερα για την πέψη πρωτεϊνών με τη βοήθεια υπερήχων στις πρωτεομικές ροές εργασίας!
Είναι το UIP400MTP συμβατό με την πρωτεομική ανάλυση χαμηλής εισόδου;
Ναι, η μορφή μικροπλάκας είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για ροές εργασίας μικρού όγκου, όπου η διατήρηση των δειγμάτων και η συνεπής επεξεργασία είναι σημαντικές. Στη δημοσιευμένη ροή εργασίας για τα EV, η προετοιμασία για πρωτεομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με εισροή EV ισοδύναμη με 5 µg πρωτεΐνης.
Μπορεί η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών να βελτιώσει την αναπαραγωγιμότητα;
Τα συστήματα υπερήχων της Hielscher συμβάλλουν στην αναπαραγωγιμότητα, εφαρμόζοντας τυποποιημένες συνθήκες υπερηχητικής επεξεργασίας σε πολλά δείγματα. Ωστόσο, και άλλοι παράγοντες, όπως η απομόνωση κυττάρων ή εξωκυτταρικών σωματιδίων (EV), η κανονικοποίηση της εισροής, η αποδοτικότητα της πέψης, η σταθερότητα της LC-MS/MS, η επεξεργασία δεδομένων και η στατιστική ανάλυση, συμβάλλουν επίσης στη συνολική αναπαραγωγιμότητα της πρωτεομικής.
Βελτιώνει η υπερηχητική επεξεργασία μικροπλακών το βάθος αναγνώρισης των πρωτεϊνών;
Μπορεί να συμβάλει στη βελτίωση του βάθους ταυτοποίησης όταν η διάσπαση ή η επαναδιαλυτοποίηση του δείγματος αποτελεί περιοριστικό παράγοντα. Το αποτέλεσμα εξαρτάται από τον τύπο του δείγματος, τη χημική σύσταση των πρωτεϊνών, τη στρατηγική καθαρισμού, τις συνθήκες πέψης και την απόδοση της μεθόδου LC-MS/MS.
Τι πρέπει να βελτιστοποιηθεί πριν από τη συστηματική χρήση της ροής εργασίας;
Οι βασικές παράμετροι περιλαμβάνουν την εισαγωγή του δείγματος, τη σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος ή του διαλύτη, τη μορφή της πλάκας, το πλάτος και τη διάρκεια των υπερήχων, τις συνθήκες ξήρανσης, τον όγκο της πέψης, τη συγκέντρωση του ενζύμου, τον χρόνο επώασης και την ποσότητα έγχυσης στο LC-MS/MS. Συνιστάται η διεξαγωγή πιλοτικών δοκιμών πριν από την εφαρμογή της ροής εργασίας σε μια πλήρη σειρά πειραμάτων.
Μπορεί αυτή η ροή εργασίας να χρησιμοποιηθεί στην πρωτεομική DIA;
Ναι. Η αναφερόμενη ροή εργασίας EV χρησιμοποίησε τη μέθοδο απόκτησης δεδομένων ανεξάρτητη από τα δεδομένα (data-independent acquisition), ακολουθούμενη από ανάλυση DIA-NN. Η υπερηχητική επεξεργασία των μικροπλακών αποτελεί μέρος της αρχικής διαδικασίας προετοιμασίας του δείγματος και μπορεί να ενσωματωθεί σε μεθόδους DIA, DDA ή στοχευμένης πρωτεομικής.
Ποιοι δείκτες ελέγχου ποιότητας πρέπει να παρακολουθούνται;
Οι συνιστώμενοι δείκτες ποιοτικού ελέγχου περιλαμβάνουν την απόδοση πεπτιδίων, τον αριθμό των ταυτοποιημένων πεπτιδίων και πρωτεϊνικών ομάδων, το ποσοστό χαμένων διαχωρισμών, την κατανομή του μήκους των πεπτιδίων, το σχήμα των χρωματογραφικών κορυφών, τη σταθερότητα του χρόνου κατακράτησης, τον συντελεστή μεταβλητότητας των επαναλήψεων, τη μεταφορά υπολειμμάτων και τον διαχωρισμό βιολογικών ομάδων μέσω PCA ή συναφών μεθόδων.
Ποιο είναι το κύριο πλεονέκτημα της ενσωμάτωσης των μοντέλων υπερηχητικών συσκευών για μικροπλάκες UIP400MTP ή UIP550MTP στην προετοιμασία δειγμάτων πρωτεομικής;
Το κύριο πλεονέκτημα είναι η τυποποιημένη, παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων μικρού όγκου. Αυτό βοηθά τα εργαστήρια να μειώσουν τη μεταβλητότητα που οφείλεται στη χειροκίνητη επεξεργασία και να προετοιμάζουν τα σύνθετα βιολογικά δείγματα με μεγαλύτερη συνέπεια για την πέψη, τη συλλογή δεδομένων με LC-MS/MS και την ποσοτική πρωτεομική ανάλυση.
Τα υπερηχητικά συστήματα Hielscher για μικροπλάκες μπορούν να ενσωματωθούν απρόσκοπτα σε αυτοματοποιημένες ροές εργασίας.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.