Κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους στην πρωτεωμική shotgun – Σημείωμα εφαρμογής
Η πρωτεωμική shotgun βασίζεται στην αποτελεσματική, αναπαραγώγιμη προετοιμασία δειγμάτων για τη μετατροπή σύνθετου βιολογικού υλικού σε πεπτίδια έτοιμα για LC-MS/MS. Η συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP υποστηρίζει αυτή τη διαδικασία επιτρέποντας την τυποποιημένη, παράλληλη κατεργασία δειγμάτων μικρού όγκου με υπερήχους και βοηθώντας τα εργαστήρια να βελτιώσουν τη διάρρηξη, την εκχύλιση και την επαναδιαλυτοποίηση σε ροές εργασίας που βασίζονται σε μικροπλάκες. Αυτό το σημείωμα εφαρμογής περιγράφει πώς το UIP400MTP μπορεί να ενσωματωθεί στην προετοιμασία δειγμάτων για πρωτεωμική ανάλυση, χρησιμοποιώντας ως εργαστηριακά δοκιμασμένο παράδειγμα μια δημοσιευμένη ροή εργασίας για εξωκυττάρια κυστίδια από μελέτες PLA2G12A/Th17.
Κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους για πιο αναπαραγώγιμη πρωτεωμική shotgun
Για τους ερευνητές της πρωτεωμικής, η αναπαραγώγιμη προετοιμασία δειγμάτων είναι κρίσιμη για την παραγωγή δεδομένων LC-MS/MS υψηλής ποιότητας. Η συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP υποστηρίζει την τυποποιημένη, παράλληλη κατεργασία με υπερήχους σε ροές εργασίας που βασίζονται σε πλάκες και σε ροές εργασίας μικρού όγκου/υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας.
Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για εργαστήρια που εργάζονται με:
- Μεγάλα σύνολα δειγμάτων που απαιτούν ομοιόμορφη επεξεργασία σε πολλά βοθρία
- Υλικό περιορισμένης αρχικής ποσότητας, όπου η απώλεια δείγματος και η μεταβλητότητα πρέπει να ελαχιστοποιούνται
- Δείγματα πλούσια σε λιπίδια, όπως τα εξωκυττάρια κυστίδια
- Σύνθετα βιολογικά παρασκευάσματα που απαιτούν αποτελεσματική διάρρηξη, εκχύλιση ή επαναδιαλυτοποίηση
- Συγκριτική πρωτεωμική shotgun, όπου η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ συνθηκών και επαναλήψεων είναι απαραίτητη
Ενσωματώνοντας την κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους πριν από την πέψη, οι ερευνητές μπορούν να βελτιώσουν την ετοιμότητα των δειγμάτων για:
- Εκχύλιση και επαναδιαλυτοποίηση πρωτεϊνών
- Πέψη με θρυψίνη/Lys-C
- Λήψη δεδομένων Nano-LC/MS/MS
- Ποσοτική πρωτεωμική ανάλυση σε επόμενα στάδια
Μάθετε πώς η κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους βοηθά στη μείωση της μεταβλητότητας από τους χειρωνακτικούς χειρισμούς, στη βελτίωση της διάρρηξης των δειγμάτων και στην προετοιμασία σύνθετων βιολογικών δειγμάτων για αξιόπιστη ανάλυση LC-MS/MS.
Η κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους μπορεί να ωφελήσει:
- Κεντρικές εργαστηριακές υποδομές πρωτεωμικής
- Εργαστήρια έρευνας εξωκυττάριων κυστιδίων (EV)
- Εργαστήρια ανοσολογίας και κυτταρικής βιολογίας
- Ομάδες μεταφραστικής έρευνας
- Ομάδες βιοεπιστημών που επεκτείνονται από την προετοιμασία μεμονωμένων δειγμάτων σε ροές εργασίας υψηλότερης διεκπεραιωτικής ικανότητας
Προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας για ανάλυση του πρωτεώματος εξωκυττάριων κυστιδίων
Τι είναι η πρωτεωμική shotgun;
Η πρωτεωμική shotgun έχει καταστεί κεντρική αναλυτική στρατηγική για τον χαρακτηρισμό σύνθετων βιολογικών δειγμάτων, από ολικά κυτταρικά λύματα και εκχυλίσματα ιστών έως καθαρισμένα οργανίδια, εξωκυττάρια κυστίδια και κλινικά δείγματα μικρής αρχικής ποσότητας. Το βασικό της πλεονέκτημα έγκειται στον συνδυασμό της πέψης πρωτεϊνών, της υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με διαδοχική φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας και της υπολογιστικής συναγωγής της ταυτότητας των πρωτεϊνών από τα πεπτίδια. Ωστόσο, η ποιότητα του τελικού συνόλου δεδομένων του πρωτεώματος καθορίζεται πολύ πριν το δείγμα φτάσει στο φασματόμετρο μάζας. Η αποτελεσματική διάρρηξη του δείγματος, η διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών, η απομάκρυνση παρεμβαλλόμενων ουσιών, η αναπαραγώγιμη ενζυμική πέψη και η αξιόπιστη ανάκτηση πεπτιδίων είναι όλες καθοριστικές για το βάθος κάλυψης και την ποσοτική αξιοπιστία.
Για τους ερευνητές της πρωτεωμικής και τα εργαστήρια βιοεπιστημών που εργάζονται με περιορισμένα ή πολύτιμα δείγματα, η προετοιμασία των δειγμάτων αποτελεί συχνά το στάδιο που περιορίζει τη συνολική απόδοση.
Το UIP400MTP εξασφαλίζει αξιόπιστη προετοιμασία δειγμάτων και εύκολη ενσωμάτωση στις υπάρχουσες εργαστηριακές ροές εργασίας
Η πρόκληση των εξωκυττάριων κυστιδίων στην πρωτεωμική
Τα εξωκυτταρικά κυστίδια (EVs), για παράδειγμα, αποτελούν μια ιδιαίτερα απαιτητική κατηγορία δειγμάτων. Είναι σωματίδια νανοκλίμακας που περιβάλλονται από μεμβράνη, είναι πλούσια σε λιπίδια και χαρακτηρίζονται από σχετικά χαμηλή απόδοση σε πρωτεΐνες και υψηλή πιθανότητα συμπαράσυρσης λιπιδίων, αλάτων, απορρυπαντικών, πρωτεϊνών ορού και άλλων συστατικών της μήτρας του δείγματος. Αυτά τα χαρακτηριστικά μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της πέψης, τη χρωματογραφική απόδοση, τη σταθερότητα του ηλεκτροψεκασμού και την ταυτοποίηση πεπτιδίων. Επομένως, μια ροή εργασίας προετοιμασίας για την πρωτεωμική των EV πρέπει να είναι αρκετά δραστική ώστε να διαρρηγνύει τις δομές των κυστιδίων και να διαλυτοποιεί το πρωτεϊνικό φορτίο τους, παραμένοντας παράλληλα συμβατή με την επακόλουθη ενζυμική πέψη και ανάλυση LC-MS/MS.
Σε αυτό το πλαίσιο, η κατεργασία με υπερήχους που είναι συμβατή με μικροπλάκες προσφέρει μια πρακτική προσέγγιση για αναπαραγώγιμη, παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων. Τα μοντέλα συσκευών υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP (400 W) και UIP550MTP (550 W) της Hielscher έχουν σχεδιαστεί για την κατεργασία δειγμάτων με υπερήχους σε πλάκες πολλαπλών βοθρίων και δοχεία μικρού όγκου, υποστηρίζοντας ροές εργασίας με μεγαλύτερη διεκπεραιωτική ικανότητα από τις συμβατικές συσκευές υπερήχων με έναν ανιχνευτή. Για τα εργαστήρια πρωτεωμικής, αυτή η διάταξη είναι ελκυστική επειδή μπορεί να μειώσει τη μεταβλητότητα των χειροκίνητων χειρισμών, να βελτιώσει την παράλληλη κατεργασία πολλαπλών δειγμάτων και να ενσωματωθεί πιο φυσικά σε αλληλουχίες προετοιμασίας δειγμάτων που βασίζονται σε πλάκες.
Ενδεικτική ροή εργασίας
Μια πρόσφατη ροή εργασίας πρωτεωμικής εξωκυτταρικών κυστιδίων στη μελέτη της βιολογίας των κυττάρων Th17 που καθοδηγείται από την PLA2G12A παρέχει ένα χρήσιμο, εργαστηριακά δοκιμασμένο παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο η συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP μπορεί να ενσωματωθεί στην προετοιμασία δειγμάτων για πρωτεωμική shotgun. Σε αυτή τη σειρά μελετών, τα δείγματα EV υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση του πρωτεώματος με κατεργασία με μεθανόλη, κατεργασία με υπερήχους με το UIP400MTP, φυγοκέντρηση, ξήρανση, πέψη με θρυψίνη/Lys-C και υγρή χρωματογραφία (LC) νανοροής συζευγμένη με διαδοχική φασματομετρία μάζας (MS) υψηλής διακριτικής ικανότητας. Η βιολογική μελέτη δημοσιεύθηκε το 2026 από τη Mochizuki-Ono και τους συνεργάτες της, και η πρωτεωμική ανάλυση συνέβαλε στον χαρακτηρισμό του τρόπου με τον οποίο η PLA2G12A μεταβάλλει τις πρωτεΐνες του φορτίου των EV στο πλαίσιο παθογόνων αποκρίσεων των Τ κυττάρων.
Συσκευή υπερήχων για πλάκες 96 βοθρίων UIP400MTP για εκχύλιση πρωτεϊνών με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα
Συσκευή υπερήχων: Συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP
Αρχική ποσότητα: Ποσότητα EV ισοδύναμη με 5 µg πρωτεΐνης
Πέψη: Θρυψίνη/Lys-C
Μέθοδος μέτρησης: Nano-LC-MS/MS / πρωτεωμική DIA
Οδηγίες βήμα προς βήμα: Προετοιμασία δειγμάτων EV με τη βοήθεια του UIP400MTP για πρωτεωμική shotgun
Αυτή η ροή εργασίας περιγράφει μια μέθοδο προετοιμασίας δειγμάτων εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV) μικρής αρχικής ποσότητας για πρωτεωμική shotgun με χρήση της συσκευής υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP. Βασίζεται σε μια δημοσιευμένη ροή εργασίας πρωτεωμικής EV, στην οποία τα δείγματα EV κανονικοποιήθηκαν, ξηράνθηκαν, υποβλήθηκαν σε κατεργασία με μεθανόλη και υπερήχους, σε πέψη με θρυψίνη/Lys-C και σε οξίνιση, και αναλύθηκαν με nano-LC-MS/MS.
Η διαδικασία προορίζεται για ερευνητές πρωτεωμικής και εργαστήρια βιοεπιστημών που προετοιμάζουν EV ή άλλα βιολογικά δείγματα μικρού όγκου, πλούσια σε λιπίδια, για πρωτεωμική shotgun με προσέγγιση bottom-up.
Επισκόπηση της ροής εργασίας
| Στάδιο | Σκοπός | Κύριο αποτέλεσμα |
|---|---|---|
| Προετοιμασία EV | Απομονώστε, πλύνετε και ποσοτικοποιήστε τα δείγματα EV | Κανονικοποιημένη αρχική ποσότητα EV |
| Ξήρανση δειγμάτων | Απομακρύνετε το υγρό πριν από την επεξεργασία με τη βοήθεια διαλύτη | Ξηραμένο υλικό EV |
| Κατεργασία με μεθανόλη | Υποστηρίξτε τη διάρρηξη του πλούσιου σε λιπίδια υλικού EV | Δείγμα διαβρεγμένο με μεθανόλη |
| Κατεργασία με υπερήχους με το UIP400MTP | Ενισχύστε τη διάρρηξη, την εκχύλιση και την ομογενοποίηση | Επεξεργασμένο δείγμα EV |
| Πέψη | Παράγετε πεπτίδια από τις πρωτεΐνες των EV | Πεπτιδικό προϊόν πέψης με θρυψίνη/Lys-C |
| Ανάλυση LC-MS/MS | Διαχωρίστε, ανιχνεύστε και ποσοτικοποιήστε τα πεπτίδια | Σύνολο πρωτεωμικών δεδομένων |
| Ανάλυση δεδομένων | Ταυτοποιήστε και ποσοτικοποιήστε τα πεπτίδια και τις πρωτεΐνες | Αποτελέσματα σε επίπεδο πρωτεϊνών |
Πρωτόκολλο βήμα προς βήμα
| Βήμα | Οδηγία | Κρίσιμες παράμετροι |
|---|---|---|
| 1 | Προετοιμάστε καθαρισμένα δείγματα EV χρησιμοποιώντας την καθιερωμένη ροή εργασίας απομόνωσης του εργαστηρίου. | Απομακρύνετε κύτταρα, υπολείμματα και κύριες προσμείξεις πριν από την προετοιμασία για πρωτεωμική ανάλυση. |
| 2 | Ποσοτικοποιήστε την περιεκτικότητα των EV σε πρωτεΐνες, για παράδειγμα με δοκιμασία BCA. | Κανονικοποιήστε όλα τα δείγματα ώστε να έχουν ίση αρχική ποσότητα σε ισοδύναμα πρωτεΐνης. |
| 3 | Μεταφέρετε ποσότητα EV ισοδύναμη με 5 µg πρωτεΐνης σε καθαρά σωληνάρια PCR ή συμβατά σωληνάρια μικρού όγκου. | Χρησιμοποιήστε σωληνάρια χαμηλής δέσμευσης όπου υπάρχει ανησυχία για απώλεια δείγματος. |
| 4 | Ξηράνετε πλήρως τα δείγματα EV. | Αποφύγετε την υπερθέρμανση· επιβεβαιώστε ότι δεν παραμένει ορατό υγρό. |
| 5 | Προσθέστε 25 µL μεθανόλης σε κάθε ξηραμένο δείγμα EV. | Βεβαιωθείτε ότι το ξηραμένο υλικό έχει διαβραχεί πλήρως. |
| 6 | Υποβάλετε τα δείγματα σε κατεργασία με υπερήχους για 3 λεπτά χρησιμοποιώντας τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP. | Χρησιμοποιήστε τις ίδιες ρυθμίσεις κατεργασίας με υπερήχους και την ίδια λογική διάταξης για όλα τα δείγματα. |
| 7 | Φυγοκεντρήστε τα δείγματα που υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους στα 19.000 × g για 20 λεπτά στους 4°C. | Αποφύγετε τη διατάραξη τυχόν ιζήματος ή αδιάλυτου υλικού μετά τη φυγοκέντρηση. |
| 8 | Αφαιρέστε προσεκτικά 20 µL από το υπερκείμενο. | Χρησιμοποιήστε την ίδια τεχνική χειρισμού με πιπέτα για όλα τα δείγματα. |
| 9 | Ξηράνετε πλήρως το υπόλοιπο υλικό του δείγματος. | Προχωρήστε απευθείας στην πέψη ή αποθηκεύστε μόνο υπό επικυρωμένες συνθήκες. |
| 10 | Προσθέστε 4 µL διαλύματος τρυψίνης/Lys-C συγκέντρωσης 100 ng/µL σε διττανθρακικό αμμώνιο 50 mM. | Παρασκευάστε φρέσκο διάλυμα ενζύμου ή χρησιμοποιήστε κατάλληλα αποθηκευμένα κλάσματα. |
| 11 | Εφαρμόστε σύντομη κατεργασία με υπερήχους για να διαλύσετε το ξηραμένο πρωτεϊνικό υλικό στο διάλυμα πέψης. | Συγκεντρώστε όλο το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου μετά την κατεργασία με υπερήχους. |
| 12 | Πραγματοποιήστε πέψη για 2 ώρες στους 37°C με ανακίνηση στις 300 rpm. | Διατηρείτε τα πώματα ερμητικά κλειστά για να αποτρέψετε την εξάτμιση. |
| 13 | Προσθέστε 1 µL TFA 1,25% για να οξινίσετε το προϊόν πέψης. | Η οξίνιση σταματά την πέψη και προετοιμάζει τα πεπτίδια για LC-MS/MS. |
| 14 | Μεταφέρετε το προϊόν πέψης σε φιαλίδια ή πλάκες συμβατά με LC-MS. | Αποφύγετε τη μεταφορά αδιάλυτων υπολειμμάτων. |
| 15 | Αναλύστε με nano-LC-MS/MS. | Χρησιμοποιήστε σταθερό όγκο έγχυσης, σταθερή βαθμίδωση LC και τις ίδιες ρυθμίσεις λήψης δεδομένων MS. |
| 16 | Επεξεργαστείτε τα πρωτογενή δεδομένα χρησιμοποιώντας λογισμικό πρωτεωμικής DIA, DDA ή στοχευμένης πρωτεωμικής, κατά περίπτωση. | Εφαρμόστε κατάλληλη βάση δεδομένων, ενζυμική ειδικότητα, ρυθμίσεις τροποποιήσεων και κατώφλια FDR. |
(πρβλ. Mochizuki-Ono et al., 2026)
Συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP
Γιατί να χρησιμοποιήσετε κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους;
Το UIP400MTP επιτρέπει την τυποποιημένη, παράλληλη κατεργασία δειγμάτων μικρού όγκου με υπερήχους. Αυτό είναι χρήσιμο όταν έχουν σημασία η αναπαραγωγιμότητα, η μικρή ποσότητα εισαγόμενου δείγματος και ο ρυθμός επεξεργασίας πολλαπλών δειγμάτων.
Χρησιμοποιήστε οποιαδήποτε τυπική μικροπλάκα! Προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας με το UIP400MTP
Η αναφερόμενη ροή εργασίας πρωτεωμικής EV χρησιμοποίησε ποσότητα EV ισοδύναμη με 5 µg πρωτεΐνης, 25 µL μεθανόλης, 3 λεπτά κατεργασίας με υπερήχους με το UIP400MTP, πέψη με τρυψίνη/Lys-C, οξίνιση με TFA και ανάλυση nano-LC-MS/MS.
Συνιστώμενα βήματα LC-MS/MS και ανάλυσης δεδομένων
Μετά την πέψη και την οξίνιση, τα δείγματα μπορούν να αναλυθούν με LC αντίστροφης φάσης νανοροής σε σύζευξη με διαδοχική φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας. Στη δημοσιευμένη ροή εργασίας, τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε σύστημα nano-LC και αναλύθηκαν με λήψη δεδομένων ανεξάρτητη από τα δεδομένα σε φασματόμετρο μάζας Orbitrap.
| Στάδιο | Σύσταση | Σκοπός |
|---|---|---|
| Φόρτωση δείγματος | Χρησιμοποιήστε παγίδα C18 ή ισοδύναμη διάταξη φόρτωσης πεπτιδίων. | Συγκεντρώνει τα πεπτίδια και απομακρύνει τους έντονα πολικούς επιμολυντές. |
| Διαχωρισμός πεπτιδίων | Χρησιμοποιήστε LC αντίστροφης φάσης νανοροής. | Βελτιώνει τον διαχωρισμό των πεπτιδίων και την ευαισθησία MS. |
| Λήψη δεδομένων MS | Χρησιμοποιήστε DIA, DDA ή στοχευμένη MS ανάλογα με τον σχεδιασμό της μελέτης. | Παράγει φασματικά δεδομένα σε επίπεδο πεπτιδίων. |
| Αναζήτηση σε βάση δεδομένων | Χρησιμοποιήστε βάση δεδομένων αναφοράς κατάλληλη για το βιολογικό είδος. | Υποστηρίζει την ταυτοποίηση πεπτιδίων και πρωτεϊνών. |
| Έλεγχος FDR | Εφαρμόστε κατώφλια ποσοστού ψευδών ανακαλύψεων για πεπτίδια και πρωτεΐνες. | Ελέγχει το επίπεδο εμπιστοσύνης της ταυτοποίησης. |
| Ποσοτικοποίηση | Εξαγάγετε πίνακες αφθονίας πεπτιδίων, πρόδρομων ιόντων και πρωτεϊνών. | Επιτρέπει τη στατιστική σύγκριση μεταξύ ομάδων. |
Κατάλογος ελέγχου ποιότητας
- Επιβεβαιώστε ότι η εισαγόμενη ποσότητα EV είναι ισοδύναμη ως προς την πρωτεΐνη σε όλα τα δείγματα.
- Χρησιμοποιήστε τυχαιοποιημένες ή ισορροπημένες διατάξεις επεξεργασίας δειγμάτων.
- Διατηρείτε σταθερούς τον όγκο μεθανόλης, τον χρόνο κατεργασίας με υπερήχους, τον χρόνο ξήρανσης και τον όγκο πέψης.
- Παρακολουθείτε την απόδοση σε πεπτίδια και τον συνολικό αριθμό ταυτοποιήσεων πρωτεϊνών.
- Ελέγχετε το ποσοστό μη πραγματοποιημένων πρωτεολυτικών τομών και την κατανομή μήκους των πεπτιδίων.
- Εξετάζετε το σχήμα των χρωματογραφικών κορυφών και την αναπαραγωγιμότητα του χρόνου κατακράτησης.
- Συμπεριλάβετε τυφλά δείγματα για την παρακολούθηση της μεταφοράς υπολειμμάτων μεταξύ αναλύσεων.
- Χρησιμοποιήστε συγκεντρωτικά δείγματα ελέγχου ποιότητας (QC) για μεγαλύτερες μελέτες.
- Αξιολογήστε τον συντελεστή μεταβλητότητας μεταξύ επαναλήψεων.
- Χρησιμοποιήστε PCA ή συναφείς μεθόδους για τον εντοπισμό επιδράσεων παρτίδας ή ακραίων δειγμάτων.
Συστάσεις καταγραφής
Κατά τη δημοσίευση ή την τεκμηρίωση αυτής της ροής εργασίας, αναφέρετε την εισαγόμενη ποσότητα EV, τον τύπο πλάκας, τον όγκο μεθανόλης, το πλάτος ταλάντωσης και τον χρόνο κατεργασίας με υπερήχους του UIP400MTP, τις συνθήκες φυγοκέντρησης, τη μέθοδο ξήρανσης, το ρυθμιστικό διάλυμα πέψης, τη συγκέντρωση ενζύμου, τον χρόνο πέψης, τις συνθήκες οξίνισης, την πλατφόρμα LC-MS/MS, τον τρόπο λήψης δεδομένων, την έκδοση λογισμικού, τη βάση δεδομένων, το κατώφλι FDR, τη μέθοδο κανονικοποίησης και τη στατιστική ροή εργασίας.
Όλες οι συσκευές κατεργασίας μικροπλακών με υπερήχους της Hielscher καταγράφουν αυτόματα σημαντικές παραμέτρους της διεργασίας, όπως το πλάτος ταλάντωσης, τη διάρκεια της κατεργασίας με υπερήχους και τη θερμοκρασία, με σήμανση ημερομηνίας και ώρας, ως αρχείο CVS στην ενσωματωμένη κάρτα SD. Η καταγραφή δεδομένων για την αναπαραγωγιμότητα και τον ποιοτικό έλεγχο δεν ήταν ποτέ ευκολότερη!
Για την πρωτεωμική DIA, χρησιμοποιείτε σταθερές ρυθμίσεις λήψης δεδομένων σε όλα τα δείγματα και συμπεριλαμβάνετε σύνθετα δείγματα ποιοτικού ελέγχου από ανάμειξη επιμέρους δειγμάτων, όπου είναι δυνατόν. Παρακολουθείτε τον αριθμό των πρόδρομων ιόντων, τη σταθερότητα του χρόνου κατακράτησης και τη μεταβλητότητα μεταξύ επαναλήψεων.
Αυτή η ροή εργασίας αποτελεί ένα εργαστηριακά δοκιμασμένο παράδειγμα για την πρωτεωμική εξωκυττάριων κυστιδίων (EV). Για άλλους τύπους δειγμάτων, βελτιστοποιήστε την αρχική ποσότητα δείγματος, τις συνθήκες του διαλύτη, τον χρόνο κατεργασίας με υπερήχους, τον όγκο πέψης και τη στρατηγική έγχυσης για LC-MS/MS πριν επεκτείνετε την εφαρμογή σε μια πλήρη μελέτη.
Η μελέτη αναλυτικά: Πρωτεωμική shotgun εξωκυττάριων κυστιδίων (EV) στη μελέτη της PLA2G12A
Η μελέτη για την PLA2G12A παρέχει ένα συγκεκριμένο παράδειγμα χρήσης του UIP400MTP σε μια ροή εργασίας πρωτεωμικής shotgun. Το βιολογικό ερώτημα ήταν πώς η εκκρινόμενη φωσφολιπάση PLA2G12A τροποποιεί τα εξωκυτταρικά κυστίδια που προέρχονται από κύτταρα Th17 και, με τον τρόπο αυτό, επηρεάζει τη διαφοροποίηση των παθογόνων Τ κυττάρων. Οι συγγραφείς έδειξαν ότι η PLA2G12A δρα στις μεμβράνες των EV παράγοντας λυσοφωσφολιπίδια, συμπεριλαμβανομένης της 1-ολεοϋλο-λυσοφωσφατιδυλαιθανολαμίνης, και ότι η επακόλουθη σηματοδότηση του λυσοφωσφατιδικού οξέος μέσω του LPA2 συμβάλλει στη διαφοροποίηση των Th17. Πέρα από τη λιπιδική σηματοδότηση, οι μελέτες εξέτασαν επίσης το φορτίο των EV, συμπεριλαμβανομένης της περιεκτικότητας σε RNA και πρωτεΐνες, καθιστώντας την πρωτεωμική shotgun σημαντικό συστατικό της στρατηγικής χαρακτηρισμού.
Στη ροή εργασίας προετοιμασίας των EV, τα κύτταρα Th17 καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε εμβρυϊκό βόειο ορό από τον οποίο είχαν απομακρυνθεί τα εξωσώματα. Τα υπερκείμενα των καλλιεργειών αρχικά φυγοκεντρήθηκαν για την απομάκρυνση των κυττάρων, διηθήθηκαν μέσω φίλτρου 0,22 µm, συμπυκνώθηκαν με υπερδιήθηση/υπερφυγοκέντρηση, πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS και ποσοτικοποιήθηκαν με δοκιμασία προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA. Αυτή η προετοιμασία των EV πριν από την πρωτεωμική ανάλυση εξασφάλισε ότι μια καθορισμένη ποσότητα υλικού EV, εκφρασμένη ως ισοδύναμο πρωτεΐνης, μπορούσε να εισαχθεί στη ροή εργασίας πρωτεωμικής.
Για την πρωτεωμική ανάλυση shotgun, οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν δείγματα EV που αντιστοιχούσαν σε 5 µg ισοδυνάμων πρωτεΐνης. Τα δείγματα αυτά ξηράνθηκαν σε σωληνάρια PCR και προστέθηκαν 25 µL μεθανόλης. Στη συνέχεια, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους για 3 λεπτά με τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP. Μετά την κατεργασία με υπερήχους, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 4°C για 20 λεπτά στα 19.000 × g. Μετά την απομάκρυνση 20 µL υπερκειμένου, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν μέχρι ξηρού. Οι πρωτεΐνες διαλύθηκαν στη συνέχεια με κατεργασία με υπερήχους σε 4 µL διαλύματος θρυψίνης/Lys-C συγκέντρωσης 100 ng/µL σε όξινο ανθρακικό αμμώνιο 50 mM. Η πέψη πραγματοποιήθηκε για 2 ώρες στους 37°C με ανακίνηση στις 300 rpm. Το προϊόν πέψης οξινίστηκε με 1 µL τριφθοροξικού οξέος 1,25% και υποβλήθηκε σε υγρή χρωματογραφία νανοροής συζευγμένη με διαδοχική φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας.
Αυτή η ροή εργασίας αναδεικνύει αρκετές χρήσιμες αρχές για την πρωτεωμική EV με μικρή αρχική ποσότητα δείγματος. Πρώτον, η αρχική ποσότητα κανονικοποιήθηκε βάσει του ισοδυνάμου πρωτεΐνης, κάτι που είναι σημαντικό κατά τη σύγκριση EV από διαφορετικούς γονότυπους ή διαφορετικές αγωγές. Δεύτερον, χρησιμοποιήθηκε μεθανόλη πριν από την κατεργασία με υπερήχους, υποστηρίζοντας τη διάρρηξη και την εκχύλιση, ενώ αποφεύχθηκαν συστήματα απορρυπαντικών που ενδέχεται να περιπλέξουν την LC-MS/MS. Τρίτον, το στάδιο κατεργασίας με υπερήχους ήταν σύντομο και τυποποιημένο, κάτι που είναι συμβατό με την παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων. Τέταρτον, η πέψη με θρυψίνη/Lys-C πραγματοποιήθηκε σε πολύ μικρό όγκο, μειώνοντας την αραίωση και υποστηρίζοντας την ανάκτηση πεπτιδίων από μικρή αρχική ποσότητα δείγματος. Τέλος, η άμεση μετάβαση από την πέψη στην οξίνιση και την LC-MS/MS ελαχιστοποίησε τα περιττά στάδια χειρισμού.
Η επακόλουθη μέθοδος LC-MS/MS χρησιμοποίησε διαχωρισμό αντίστροφης φάσης με νανοροή, συζευγμένο με φασματόμετρο μάζας Q-Exactive HF Orbitrap. Τα δείγματα παγιδεύτηκαν σε προστήλη C18 και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε αναλυτική στήλη εσωτερικής διαμέτρου 50 µm, με παροχή 200 nL/min και στους 40°C. Η βαθμιδωτή έκλουση ξεκίνησε από χαμηλή περιεκτικότητα σε οργανικό διαλύτη και έφτασε σε 35% διαλύτη B σε διάστημα 60 λεπτών, ενώ ακολούθησαν πλύση με υψηλή περιεκτικότητα σε οργανικό διαλύτη και επανεξισορρόπηση. Η λήψη δεδομένων MS πραγματοποιήθηκε σε λειτουργία θετικών ιόντων, με λήψη δεδομένων ανεξάρτητη από τα δεδομένα και διάσπαση μέσω συγκρούσεων υψηλότερης ενέργειας. Τα αρχεία πρωτογενών δεδομένων DIA αναλύθηκαν με το DIA-NN 1.8, χρησιμοποιώντας φασματική βιβλιοθήκη που είχε προβλεφθεί in silico.
Εκχύλιση πρωτεϊνών με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα με τη συσκευή υπερήχων για πλάκες 96 βοθρίων UIP400MTP
Συχνές ερωτήσεις
Ποιοι ωφελούνται περισσότερο από την κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους στην πρωτεωμική shotgun;
Η κατεργασία μικροπλακών με υπερήχους είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για εργαστήρια πρωτεωμικής που επεξεργάζονται πολλαπλά δείγματα παράλληλα, συμπεριλαμβανομένων κεντρικών εργαστηριακών μονάδων, ομάδων έρευνας του πρωτεώματος, εργαστηρίων ανοσολογίας, ομάδων μεταφραστικής έρευνας και εργαστηρίων βιοεπιστημών που μεταβαίνουν σε ροές εργασίας LC-MS/MS υψηλότερης διεκπεραιωτικής ικανότητας. Είναι ιδιαίτερα σημαντική όταν η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των δειγμάτων είναι κρίσιμη.
Γιατί να χρησιμοποιήσετε το UIP400MTP αντί για μια συμβατική συσκευή υπερήχων με καθετήρα;
Μια συμβατική συσκευή υπερήχων με καθετήρα συνήθως επεξεργάζεται ένα δείγμα κάθε φορά και απαιτεί προσεκτικό καθαρισμό μεταξύ των δειγμάτων για να μειωθεί η μεταφορά υπολειμμάτων. Τα μοντέλα συσκευών υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP και UIP550MTP υποστηρίζουν την παράλληλη κατεργασία με υπερήχους σε πλάκες ή σε διατάξεις μικρού όγκου, συμβάλλοντας στη μείωση των χειροκίνητων χειρισμών, στη βελτίωση της ομοιομορφίας και στην απλούστευση της προετοιμασίας πολλαπλών δειγμάτων. Επιτρέπουν επίσης την εύκολη ενσωμάτωση σε αυτοματοποιημένες ροές εργασίας.
Σε ποιο στάδιο της ροής εργασίας της πρωτεωμικής shotgun εντάσσεται η κατεργασία με υπερήχους;
Η κατεργασία με υπερήχους εφαρμόζεται συνήθως κατά τη φάση προετοιμασίας του δείγματος πριν από την πέψη. Μπορεί να υποστηρίξει τη διάρρηξη, την εκχύλιση, την ομογενοποίηση και την επαναδιαλυτοποίηση πριν από την ενζυμική πέψη με θρυψίνη, Lys-C ή μείγμα θρυψίνης/Lys-C.
Επιπλέον, η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να εφαρμοστεί και κατά την πέψη, ώστε να επιταχυνθεί σημαντικά η ενζυμική πέψη των πρωτεϊνών. Ανακαλύψτε τις δυνατότητες της πέψης πρωτεϊνών υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας με χρήση υπερήχων για μια γρήγορη ροή εργασίας πρωτεωμικής!
Είναι χρήσιμη η κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες για την πρωτεωμική των εξωκυττάριων κυστιδίων;
Ναι. Τα εξωκυττάρια κυστίδια είναι σωματίδια πλούσια σε λιπίδια που περιβάλλονται από μεμβράνη και των οποίων η επεξεργασία με αναπαραγώγιμο τρόπο μπορεί να είναι απαιτητική. Στις αναφερόμενες μελέτες PLA2G12A, τα δείγματα εξωκυττάριων κυστιδίων (EV) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μεθανόλη, κατεργασία με υπερήχους με το UIP400MTP, ξήρανση, πέψη με θρυψίνη/Lys-C και ανάλυση με nano-LC/MS/MS.
Ποιοι τύποι δειγμάτων μπορούν να ωφεληθούν από την κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες;
Η κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες μπορεί να είναι χρήσιμη για κυτταρικά λύματα, κλάσματα οργανιδίων, ανοσοϊζήματα, πρωτεϊνικά συσσωματώματα, δείγματα πλούσια σε μεμβράνες, εξωκυττάρια κυστίδια και άλλα βιολογικά παρασκευάσματα μικρού όγκου. Για κάθε τύπο δείγματος θα πρέπει να βελτιστοποιούνται η ένταση και η διάρκεια της κατεργασίας με υπερήχους, οι συνθήκες του διαλύτη, η ποσότητα αρχικού υλικού και η στρατηγική πέψης.
Αντικαθιστά η κατεργασία με υπερήχους την ενζυμική πέψη;
Όχι. Η κατεργασία με υπερήχους συμβάλλει στην προετοιμασία του δείγματος για πέψη, βελτιώνοντας τη διάρρηξη, την εκχύλιση ή την επαναδιαλυτοποίηση. Η πρωτεολυτική πέψη εξακολουθεί να είναι απαραίτητη για την παραγωγή πεπτιδίων για την πρωτεωμική shotgun με προσέγγιση από κάτω προς τα πάνω.
Διαβάστε περισσότερα για την υποβοηθούμενη με υπερήχους πέψη πρωτεϊνών σε ροές εργασίας πρωτεωμικής!
Είναι το UIP400MTP συμβατό με την πρωτεωμική με μικρή ποσότητα αρχικού υλικού;
Ναι, η διάταξη μικροπλάκας είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για ροές εργασίας μικρού όγκου, όπου η διατήρηση του δείγματος και η ομοιόμορφη επεξεργασία είναι σημαντικές. Στη δημοσιευμένη ροή εργασίας για EV, η προετοιμασία για πρωτεωμική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με αρχική ποσότητα EV ισοδύναμη με 5 µg πρωτεΐνης.
Μπορεί η κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες να βελτιώσει την αναπαραγωγιμότητα;
Οι συσκευές υπερήχων Hielscher υποστηρίζουν την αναπαραγωγιμότητα εφαρμόζοντας τυποποιημένες συνθήκες κατεργασίας με υπερήχους σε πολλαπλά δείγματα. Ωστόσο, και άλλοι παράγοντες, όπως η απομόνωση κυττάρων ή EV, η κανονικοποίηση της ποσότητας αρχικού υλικού, η αποδοτικότητα της πέψης, η σταθερότητα της LC-MS/MS, η επεξεργασία δεδομένων και η στατιστική ανάλυση, συμβάλλουν στη συνολική αναπαραγωγιμότητα της πρωτεωμικής.
Βελτιώνει η κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες το βάθος ταυτοποίησης των πρωτεϊνών;
Μπορεί να συμβάλει στη βελτίωση του βάθους ταυτοποίησης όταν η διάρρηξη ή η επαναδιαλυτοποίηση του δείγματος αποτελεί περιοριστικό παράγοντα. Η επίδραση εξαρτάται από τον τύπο του δείγματος, τη χημεία των πρωτεϊνών, τη στρατηγική καθαρισμού, τις συνθήκες πέψης και την απόδοση της μεθόδου LC-MS/MS.
Τι θα πρέπει να βελτιστοποιηθεί πριν από τη συστηματική χρήση της ροής εργασίας;
Οι βασικές παράμετροι περιλαμβάνουν την ποσότητα αρχικού δείγματος, τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος ή του διαλύτη, τη μορφή της πλάκας, το πλάτος ταλάντωσης και τη διάρκεια των υπερήχων, τις συνθήκες ξήρανσης, τον όγκο πέψης, τη συγκέντρωση του ενζύμου, τον χρόνο επώασης και την ποσότητα έγχυσης στην LC-MS/MS. Συνιστώνται πιλοτικές δοκιμές πριν από την εφαρμογή της ροής εργασίας σε ένα πλήρες σύνολο πειραματικών δειγμάτων.
Μπορεί αυτή η ροή εργασίας να χρησιμοποιηθεί με πρωτεωμική DIA;
Ναι. Η αναφερόμενη ροή εργασίας για EV χρησιμοποίησε λήψη δεδομένων ανεξάρτητη από τα δεδομένα, ακολουθούμενη από ανάλυση με DIA-NN. Η κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες αποτελεί μέρος της διαδικασίας προετοιμασίας του δείγματος που προηγείται της ανάλυσης και μπορεί να ενσωματωθεί σε μεθόδους πρωτεωμικής DIA, DDA ή στοχευμένης πρωτεωμικής.
Ποιοι δείκτες ποιοτικού ελέγχου θα πρέπει να παρακολουθούνται;
Οι συνιστώμενοι δείκτες ποιοτικού ελέγχου περιλαμβάνουν την απόδοση σε πεπτίδια, τον αριθμό των ταυτοποιημένων πεπτιδίων και πρωτεϊνικών ομάδων, το ποσοστό μη πραγματοποιημένων διασπάσεων, την κατανομή του μήκους των πεπτιδίων, το σχήμα των χρωματογραφικών κορυφών, τη σταθερότητα του χρόνου κατακράτησης, τον συντελεστή μεταβλητότητας των επαναλήψεων, την επιμόλυνση από προηγούμενα δείγματα και τον διαχωρισμό των βιολογικών ομάδων με PCA ή συναφείς μεθόδους.
Ποιο είναι το κύριο πλεονέκτημα της ενσωμάτωσης των μοντέλων συσκευών υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP ή UIP550MTP στην προετοιμασία δειγμάτων για πρωτεωμική;
Το κύριο πλεονέκτημα είναι η τυποποιημένη, παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων μικρού όγκου. Αυτό βοηθά τα εργαστήρια να μειώσουν τη μεταβλητότητα που οφείλεται στους χειροκίνητους χειρισμούς και να προετοιμάσουν σύνθετα βιολογικά δείγματα με μεγαλύτερη συνέπεια για πέψη, λήψη δεδομένων LC-MS/MS και ποσοτική πρωτεωμική ανάλυση.
Οι συσκευές υπερήχων μικροπλακών της Hielscher μπορούν να ενσωματωθούν απρόσκοπτα σε αυτοματοποιημένες ροές εργασίας.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Η Hielscher Ultrasonics κατασκευάζει ομογενοποιητές υπερήχων υψηλών επιδόσεων, από εργαστηριακή έως βιομηχανική κλίμακα.