Υπερηχητικός διατμητικός κατακερματισμός DNA

Κατά τον διατμητικό κατακερματισμό DNA και RNA, τα μακριά μόρια DNA κατακερματίζονται σε μικρότερα τμήματα, ένα κρίσιμο βήμα στην προετοιμασία δειγμάτων για την κατασκευή βιβλιοθηκών αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS). Ο υπερηχητικός διατμητικός κατακερματισμός DNA χρησιμοποιεί δυνάμεις ακουστικής σπηλαίωσης για τη διάσπαση του DNA ή του RNA σε θραύσματα μεγέθους από 100 bp έως 5 kb. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει τον ακριβή έλεγχο του μεγέθους των θραυσμάτων, διευκολύνοντας την προσαρμογή στο επιθυμητό μήκος DNA για βέλτιστα αποτελέσματα αλληλούχησης.

Διατμητικός κατακερματισμός DNA με υπερήχηση

Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις που βασίζονται στους υπερήχους για τον διατμητικό κατακερματισμό DNA, RNA και χρωματίνης. Επιλέξτε μια συσκευή υπερήχησης τύπου ανιχνευτή (π.χ. UP100H) για άμεση υπερήχηση με μικροακίδα ή χρησιμοποιήστε το VialTweeeter ή το υπερηχητικό cuphorn για την έμμεση προετοιμασία DNA από διάφορα δείγματα ταυτόχρονα. Η Hielscher προσφέρει την ιδανική συσκευή λαμβάνοντας υπόψη τις ανάγκες σας: είτε έχετε 1 είτε έως και 10 δείγματα, με όγκους από μικρολίτρα έως λίτρα – οι συσκευές υπερήχησης της Hielscher θα καλύψουν τις απαιτήσεις σας για την προετοιμασία θραυσμάτων DNA, RNA και χρωματίνης με το κατάλληλο μήκος. Η αναπαραγωγιμότητα, η εύκολη λειτουργία και ο ακριβής έλεγχος επιτρέπουν την κατασκευή αξιόπιστης βιβλιοθήκης για αλληλούχηση νέας γενιάς.
Σε αντίθεση με τον ενζυμικό κατακερματισμό DNA, ο υπερηχητικός διατμητικός κατακερματισμός ασκεί αμιγώς μηχανικές διατμητικές δυνάμεις χωρίς την προσθήκη χημικών ουσιών. Με την ακριβή ρύθμιση των παραμέτρων της διεργασίας, ο υπερηχητικός διατμητικός κατακερματισμός παράγει θραύσματα DNA υψηλού μοριακού βάρους (πλασμιδιακό και γονιδιωματικό DNA).
Τα καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα μπορούν να ενισχυθούν πριν ή μετά από ένα βήμα κατακερματισμού.
Οι παράμετροι υπερήχησης (ισχύς, κύκλος παλμών / ριπές, χρόνος και θερμοκρασία) μπορούν να ελέγχονται με ασφάλεια μέσω ρυθμίσεων λογισμικού.

Πρωτόκολλα υπερηχητικού διατμητικού κατακερματισμού DNA

Για τη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης

Συνοπτικά, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία διαμέτρου 60mm (400.000 ανά τρυβλίο) και διαμολύνθηκαν με RhoA siRNA (όπως περιγράφεται)· μετά από 72 h, επωάστηκαν με φορμαλδεΰδη (τελική συγκέντρωση, 1%) για 10 min στους 37°C για τη δημιουργία διασταυρούμενων δεσμών μεταξύ πρωτεϊνών και DNA. Η αντίδραση διασταυρούμενης σύνδεσης ανακόπηκε με την προσθήκη γλυκίνης 1,25 mol/L σε όγκο ίσο με το ένα δέκατο, ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 125 mmol/L. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% δεοξυχολικό, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] που περιείχε 1 mmol/L φθοριούχου φαινυλομεθυλοσουλφονυλίου, 1 Ag/mL απροτινίνης και 1 Ag/mL πεπστατίνης A και διατηρήθηκαν σε πάγο για 30 min. Στη συνέχεια, τα κυτταρικά λύματα υποβλήθηκαν σε υπερήχηση σε πάγο με μια συσκευή υπερήχησης Hielscher UP200S (3 x 40 s, πλάτος 40%, κύκλος 1· Hielscher Ultrasonics GmbH), έως ότου η διασταυρούμενα συνδεδεμένη χρωματίνη κατακερματιστεί διατμητικά, αποδίδοντας θραύσματα DNA μεταξύ 200 και 1.000 bp. Το ένα δέκατο του συνολικού λύματος χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του DNA που υπήρχε στα διάφορα δείγματα και θεωρήθηκε ως «συνολικό DNA εισόδου». Τα υπερκείμενα επωάστηκαν με εναιώρημα 50% DNA σπέρματος σολομού/πρωτεΐνης-αγαρόζης για τη μείωση του μη ειδικού υποβάθρου. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C με 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ή χωρίς αντίσωμα (αρνητικός μάρτυρας). Στα υπερκείμενα αυτά προστέθηκε NaCl 5 mol/L και ακολούθησε θέρμανση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 65°C για την αναστροφή των διασταυρούμενων δεσμών πρωτεϊνών-DNA. Τα ανοσοσυμπλέγματα υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία με πρωτεϊνάση K απαλλαγμένη από DNase και RNase, και το DNA καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης/χλωροφορμίου και κατακρήμνιση με αιθανόλη. Πραγματοποιήθηκε PCR με ειδικούς εκκινητές που αντιστοιχούσαν σε μια αλληλουχία εντός της περιοχής του υποκινητή του ανθρώπινου γονιδίου iNOS (εκκινητής p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶· εκκινητής p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Μελέτες έκφρασης της EGFP

Για τις μελέτες έκφρασης, το ανασυνδυασμένο στέλεχος L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Γερμανία), με το γονίδιο της EGFP (ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης) ενσωματωμένο στη χρωμοσωμική θέση ssu, καλλιεργήθηκε στα διάφορα θρεπτικά μέσα όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με επιπλέον προσθήκη 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Γερμανία). Κατά την καλλιέργεια, ελήφθησαν δείγματα 1 ml, φυγοκεντρήθηκαν (2000 × g, 20°C, 10 min) και πλύθηκαν με διάλυμα 0,9% NaCl. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) και αποδιασπάστηκε με υπερήχηση με τον υπερηχητικό επεξεργαστή UP400S (εφαρμογή ενέργειας ∼ 400 Ws). Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση (6000 × g, 4°C, 5 min) και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE) υπό αναγωγικές συνθήκες σύμφωνα με τη μέθοδο του Laemmli (1970), με πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 12,5%. Η έκφραση της EGFP εξετάστηκε σε καλλιέργεια υπό ανάδευση. (Fritsche et al. 2007)

Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης

Η δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης πραγματοποιήθηκε με το ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, σε διαφοροποιημένα ανθρώπινα ποδοκύτταρα σχηματίστηκαν διασταυρούμενοι δεσμοί με 1% φορμαλδεΰδη για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και η αντίδραση μονιμοποίησης διακόπηκε με την προσθήκη 0,125 M γλυκίνης για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν ξανά με παγωμένο PBS και αποξέστηκαν από το τρυβλίο. Τα κύτταρα καταβυθίστηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Μετά τη φυγοκέντρηση, οι καταβυθισμένοι πυρήνες επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα διατμητικού κατακερματισμού, επωάστηκαν σε πάγο για 30 min και η χρωματίνη κατακερματίστηκε διατμητικά με υπερήχηση, π.χ. με τον UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Γερμανία) σε ισχύ 25%, με 5 παλμούς διάρκειας 20 sec ο καθένας, σε πάγο, σε θραύσματα περίπου 200–600 bp. Η διατμητικά κατακερματισμένη χρωματίνη στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε και συλλέχθηκε το υπερκείμενο. Για τις ανοσοκατακρημνίσεις, 60 μl χρωματίνης επωάστηκαν με 1 μg αντισωμάτων έναντι των Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ΗΠΑ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο) ή NF-κB p50 (Abcam), ή με IgG κουνελιού (Zymed Laboratories) ως αρνητικό μάρτυρα, καθ’ όλη τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C με ήπια περιστροφή. Τα ανοσοσυμπλέγματα που ήταν δεσμευμένα σε μαγνητικά σφαιρίδια συλλέχθηκαν με μαγνητική βάση, πλύθηκαν σχολαστικά και οι διασταυρούμενοι δεσμοί πρωτεΐνης/DNA αντιστράφηκαν, ενώ το DNA εκλούστηκε για ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου. (Ristola et al. 2009)

Προετοιμασία DNA του EHEC για ανάλυση με συστοιχίες σε μικροπλακίδια

Προετοιμασία κυτταρικών λυμάτων και εκχυλισμένων DNA
Βακτηριακά ιζήματα που είχαν εναιωρηθεί σε PBS έως την επιθυμητή τελική συγκέντρωση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον υπερηχητικό διασπαστή UP100H (Hielscher GmbH, Γερμανία) εξοπλισμένο με μικροακίδα MS1 (διαμέτρου 1mm). Η συχνότητα λειτουργίας ήταν 30 kHz και η ενεργός ισχύς εξόδου ήταν 100 W. Κατά τη λειτουργία, τα δείγματα ψύχθηκαν σε λουτρό πάγου–νερού, αναμείχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν. Τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες κυτταρομετρίας ροής, ενώ για τον μετέπειτα χειρισμό τους υποβλήθηκαν σε θερμική επεξεργασία (95°C, 5 min). Τα ακατέργαστα κυτταρικά λύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μείγμα φαινόλης:χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1). Ίσος όγκος αυτού του μείγματος προστέθηκε στο δείγμα λύματος, το διάλυμα αναδεύτηκε έντονα σε αναδευτήρα vortex για 15 s και φυγοκεντρήθηκε στα 15.000 x g για 2 min σε θερμοκρασία δωματίου (RT), περίπου 22°C. Η ανώτερη υδατική φάση που περιείχε το γονιδιωματικό DNA διαχωρίστηκε προσεκτικά και συλλέχθηκε σε νέο αποστειρωμένο σωληνάριο Eppendorf.
Στη συνέχεια, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχηση για τον κατακερματισμό του DNA. Το στάδιο της υπερήχησης πραγματοποιήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω. Για την αξιολόγηση των επιδράσεων του κατακερματισμού στο γονιδιωματικό DNA, τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.
(…) Τα δείγματα που είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε υπερήχηση για 2,5 min υποβλήθηκαν σε στάδιο εκχύλισης μετά τη θερμική επεξεργασία και τη φυγοκέντρηση. Το απελευθερωμένο DNA εκχυλίστηκε δύο φορές με μείγμα φαινόλης:χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης και κατόπιν υποβλήθηκε σε δεύτερη υπερήχηση για 0 – 15 min. Χρησιμοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης για τον προσδιορισμό της κατανομής μεγέθους του DNA που υποβλήθηκε σε υπερηχητικό κατακερματισμό μετά την εκχύλιση (Εικ. επάνω δεξιά). Ο έντονος κατακερματισμός του DNA ήταν εμφανής από την παρουσία διάχυτου επιχρίσματος DNA αντί για ζώνες υψηλού μοριακού βάρους, οι οποίες εξαλείφθηκαν από τα δείγματα που υποβλήθηκαν σε υπερήχηση για 2,5 min ή περισσότερο. Η υπερήχηση μεγαλύτερης διάρκειας μείωσε σταδιακά τα μήκη των θραυσμάτων σε περίπου 150 – 600 bp, ενώ η υπερήχηση για 15 min αποδόμησε περαιτέρω αυτά τα θραύσματα, όπως φαίνεται κυρίως από το ανώτερο τμήμα του διάχυτου επιχρίσματος. Έτσι, το μέσο μέγεθος των θραυσμάτων DNA μειωνόταν σταδιακά με τον χρόνο υπερήχησης και η επεξεργασία διάρκειας 5 min επέτρεψε τη λήψη θραυσμάτων DNA με τα καταλληλότερα μεγέθη για δοκιμασίες σε μικροσυστοιχίες. Τελικά, καθιερώθηκε η διαδικασία προετοιμασίας του αναλύτη DNA που περιλάμβανε αρχικά 2 min υπερηχητικής επεξεργασίας, εκχύλιση DNA (2×) και επακόλουθη υπερήχηση διάρκειας 5 min. (Basselet et al. 2008)

Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP)

Τα κύτταρα HEK293 καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και μονιμοποιήθηκαν με 2 mM γλουταρικού δισουκινιμιδυλίου για 45 min σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Η χρωματίνη υποβλήθηκε σε διασταυρούμενη σύνδεση για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου με χρήση 1% (v/v) φορμαλδεΰδης και πλύθηκε δύο φορές με παγωμένο PBS. Η αντίδραση διασταυρούμενης σύνδεσης διακόπηκε με επώαση με γλυκίνη σε τελική συγκέντρωση 0,125 M για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση με θρυψίνη, τα κύτταρα αποξέστηκαν από το τρυβλίο κυτταροκαλλιέργειας και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl και 0,5% (v/v) Nonidet P-40), επωάστηκε σε πάγο για 10 min και ομογενοποιήθηκε με ομογενοποιητή Dounce. Στη συνέχεια, οι πυρήνες καταβυθίστηκαν με φυγοκέντρηση (3500 x g, 5 min, 4 °C) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα πυρήνων (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA και 1% (w/v) SDS). Οι πυρήνες διασπάστηκαν με υπερήχηση με τρεις παλμούς διάρκειας 20 s ο καθένας σε μια συσκευή υπερήχησης UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) με ρύθμιση κύκλου 0,5 και πλάτος 30%, παράγοντας θραύσματα γονιδιωματικού DNA με το μεγαλύτερο μέρος τους να έχει μέγεθος 200 – 1000 bp. Για τη ChIP, 50g DNA αραιώθηκαν κατά 4 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα ανοσοκατακρήμνισης (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 και 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Ανάλυση τροποποιήσεων ιστονών με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP)

Συνοπτικά, 6 x 10⁶ κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και υποβλήθηκαν σε διασταυρούμενη σύνδεση στην πλάκα καλλιέργειας για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου παρουσία 0,5% φορμαλδεΰδης. Η αντίδραση διασταυρούμενης σύνδεσης διακόπηκε με την προσθήκη 0,125 M γλυκίνης. Όλα τα επόμενα στάδια πραγματοποιήθηκαν στους 48°C. Όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα είχαν προψυχθεί και περιείχαν αναστολείς πρωτεασών (Complete Mini, Roche). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια αποξέστηκαν. Τα ιζήματα που συλλέχθηκαν διαλύθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) και υποβλήθηκαν σε υπερήχηση σε ψυχρό λουτρό αιθανόλης για 10 κύκλους με πλάτος 100%, χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό επεξεργαστή UP50H (Hielscher, Teltow, Γερμανία). Ο κατακερματισμός της χρωματίνης απεικονίστηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Τα θραύσματα που προέκυψαν είχαν μέγεθος στην περιοχή 200–500pb. Η διαλυτή χρωματίνη ελήφθη με φυγοκέντρηση των δειγμάτων που είχαν υποβληθεί σε υπερήχηση στα 14.000g για 10 min στους 48°C. Το διαλυτό κλάσμα αραιώθηκε 1/10 σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), στη συνέχεια κατανεμήθηκε σε κλάσματα και αποθηκεύτηκε στους 80°C μέχρι τη χρήση. (Rodriguez et al. 2008)