Υπερήχων DNA διάτμηση

• Κατά τη διάρκεια της διάτμησης DNA και RNA, τα μόρια DNA διασπώνται σε μικρότερα κομμάτια. Ο κατακερματισμός DNA / RNA είναι ένα από τα σημαντικά βήματα προετοιμασίας δειγμάτων που απαιτούνται για τη δημιουργία βιβλιοθηκών για αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS).
• Υπερήχων διάτμηση DNA χρησιμοποιεί τις δυνάμεις της ακουστικής σπηλαίωσης για να σπάσει το DNA ή RNA σε κομμάτια των 100 – 5kb bp.
• Η διάτμηση με υπερήχους επιτρέπει τον ακριβή κατακερματισμό του DNA και την προσαρμογή στο επιθυμητό μήκος DNA.

Διάτμηση DNA χρησιμοποιώντας υπερήχους

Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες λύσεις με βάση υπερήχους για διάτμηση DNA, RNA και χρωματίνης. Επιλέξτε ανάμεσα σε υπερήχους τύπου καθετήρα (π.χ. UP100H) για άμεση υπερήχηση χρησιμοποιώντας ένα microtip, ή χρησιμοποιήστε το VialTweeeter ή το υπερηχητικό cuphorn για έμμεση προετοιμασία DNA διαφόρων δειγμάτων ταυτόχρονα. Hielscher προσφέρει την ιδανική συσκευή λαμβάνοντας υπόψη τις ανάγκες σας: είτε έχετε 1 ή έως και 10 δείγματα, όγκους από μικρολίτρα έως λίτρα όγκους – Hielscher υπερήχων επεξεργαστές είναι διαθέσιμα για να καλύψουν τις απαιτήσεις σας για την προετοιμασία θραύσματα DNA, RNA και χρωματίνης στο σωστό μήκος. Η αναπαραγωγιμότητα, η εύκολη λειτουργία και ο ακριβής έλεγχος επιτρέπουν μια αξιόπιστη βιβλιοθήκη για αλληλουχία επόμενης γενιάς.
Σε αντίθεση με τον ενζυματικό κατακερματισμό του DNA, η διάτμηση υπερήχων εφαρμόζει καθαρές μηχανικές δυνάμεις διάτμησης χωρίς την προσθήκη χημικών ουσιών. Με τον ακριβή καθορισμό των παραμέτρων της διαδικασίας, η διάτμηση υπερήχων παράγει θραύσματα DNA υψηλού μοριακού βάρους (πλασμίδιο και γονιδιωματικό DNA).
Τα καθαρισμένα νουκλεϊνικά οξέα μπορούν να ενισχυθούν πριν ή μετά από ένα στάδιο κατακερματισμού.
Οι παράμετροι υπερήχων (ισχύς, κύκλος παλμού / εκρήξεις, χρόνος και θερμοκρασία) μπορούν να ελεγχθούν με ασφάλεια μέσω ρυθμίσεων λογισμικού.

Πρωτόκολλα για διάτμηση DNA υπερήχων

Για δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης

Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία διαμέτρου 60 χιλιοστών (400.000 ανά πιάτο) και μεταγγίστηκαν με RhoA siRNA (όπως περιγράφεται). Μετά από 72 ώρες, επωάστηκαν με φορμαλδεΰδη (τελική συγκέντρωση, 1%) για 10 λεπτά στους 37°C για να συνδέσουν τις πρωτεΐνες με το DNA. Η αντίδραση διασύνδεσης σβήστηκε με την προσθήκη ενός δεκάτου όγκου 1,25 mol / L γλυκίνης, δίνοντας 125 mmol / L τελική συγκέντρωση. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης ραδιοανοσοκατακρήμνισης [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% δεοξυχολικό, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0)] που περιείχε 1 mmol / L φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 1 Ag / mL απροτινίνη και 1 Ag / mL πεπστατίνη Α και διατηρήθηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης κυττάρων υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο με ένα Hielscher UP200S υπερήχων υπερήχων (3 x 40 s, πλάτος 40%, κύκλος 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) έως ότου οι διασταυρούμενες χρωματίνες κόπηκαν για να δώσουν θραύσματα DNA μεταξύ 200 και 1.000 bp. Το ένα δέκατο ολόκληρου του προϊόντος λύσης χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ποσότητας DNA που υπάρχει σε διαφορετικά δείγματα και θεωρήθηκε ως “συνολικό DNA εισόδου”. Τα υπερκείμενα αγγείασαν με σπέρμα σολομού DNA/πρωτεΐνη αγαρόζη-50% πολτό για να μειωθεί το μη ειδικό υπόβαθρο. Η ανοσοκατακρήμνιση στη συνέχεια έγινε κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C με 5 Ag αντι-NF-nB p65 (Upstate) ή χωρίς αντίσωμα (αρνητικός έλεγχος). Αυτά τα υπερκείμενα συμπληρώθηκαν με 5 mol / L NaCl και θερμάνθηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 65 ° C για να επανέλθουν οι διασταυρούμενοι δεσμοί πρωτεΐνης-DNA. Τα ανοσοσύμπλοκα υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ χωρίς DNase και RNase και το DNA καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης/χλωροφορμίου και καθίζηση αιθανόλης. Η PCR έγινε με ειδικούς εκκινητές που αντιστοιχούν σε μια αλληλουχία εντός της περιοχής υποκινητή του ανθρώπινου γονιδίου iNOS (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier κ.ά., 2008)

Μελέτες έκφρασης EGFP

Για μελέτες έκφρασης, το ανασυνδυασμένο στέλεχος L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Γερμανία) με το γονίδιο EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), χρωμοσωμικό SSU ενσωματωμένο, καλλιεργήθηκε στα διάφορα μέσα όπως περιγράφηκε προηγουμένως και επιπλέον συμπληρώθηκε με 100 mg l^-1 Νουρσεοτριχίνη (Jena Bioscience, Γερμανία). Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, ελήφθησαν δείγματα 1 ml, φυγοκεντρήθηκαν (2000 × g, 20°C, 10 λεπτά) και πλύθηκαν με διάλυμα NaCl 0,9%. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) και αποσυντέθηκε με ηχοποίηση με τον επεξεργαστή υπερήχων UP400S (εφαρμογή ενέργειας ∼ 400 Ws). Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση (6000 × g, 4°C, 5 min) και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλοθειικού νατρίου – πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) υπό αναγωγικές συνθήκες σύμφωνα με τη μέθοδο Laemmli (1970) με πηκτές πολυακρλαμιδίου 12,5%. Η έκφραση του EGFP εξετάστηκε σε ταραγμένη καλλιέργεια. (Fritsche et al. 2007)

ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης

Η δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ChIP-IT^ΥΔ Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με κάποιες τροποποιήσεις. Εν συντομία, διαφοροποιημένα ανθρώπινα υποκύτταρα διασυνδέθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και η αντίδραση σταθεροποίησης σταμάτησε με την προσθήκη 0,125 M γλυκίνης για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλένονταν ξανά με παγωμένο PBS και ξύνονταν από το πιάτο. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Μετά τη φυγοκέντρηση, οι σφαιροποιημένοι πυρήνες επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα διάτμησης, επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά και η χρωματίνη διατμήθηκε με υπερήχους, π.χ. UP100Η (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Γερμανία) σε ισχύ 25% 5 παλμούς των 20 sec ο καθένας σε πάγο σε θραύσματα περίπου 200-600 bp. Η διατμημένη χρωματίνη στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε και συλλέχθηκε το υπερκείμενο υγρό. Για ανοσοκατακρήμνιση, 60 μl χρωματίνης επωάστηκαν με 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ή NF-κB p50 (Abcam) αντισώματα ή με IgG κουνελιού (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), ως αρνητικό μάρτυρα, κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C με ήπια περιστροφή. Τα ανοσοσύμπλοκα που συνδέονται με μαγνητικά σφαιρίδια συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μια μαγνητική βάση, πλύθηκαν εκτενώς και οι διασταυρώσεις πρωτεΐνης/DNA αντιστράφηκαν και το DNA εκλούστηκε για ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο. (Ristola et al. 2009)

Προετοιμασία DNA EHEC για ανάλυση συστοιχίας τσιπ

Διάταξη προϊόντων κυτταρικής λύσης και εκχυλισμένων DNA
Βακτηριακά σφαιρίδια αιωρούμενα σε PBS στην επιθυμητή τελική συγκέντρωση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαταράκτης υπερήχων UP100H (Hielscher GmbH, Γερμανία) εξοπλισμένο με microtip MS1 (διαμέτρου 1mm). Η συχνότητα λειτουργίας ήταν 30 kHz και η πραγματική ισχύς εξόδου ήταν 100 W. Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας, τα δείγματα ψύχθηκαν σε λουτρό παγωμένου νερού, αναμίχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν. Τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες κυτταρομετρίας ροής, ενώ για μεταγενέστερο χειρισμό, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε θερμική επεξεργασία (95°C, 5 λεπτά). Τα προϊόντα λύσης ακατέργαστων κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μείγμα φαινόλης:χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1). Ίσος όγκος αυτού του μείγματος προστέθηκε στο δείγμα λύσης, το διάλυμα στροβιλίστηκε ζωηρά για 15 δευτερόλεπτα και φυγοκεντρήθηκε στα 15.000 x g επί 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) περίπου 22°C. Η κορυφαία υδατική φάση που περιέχει το γονιδιωματικό DNA διαχωρίστηκε προσεκτικά και συλλέχθηκε σε ένα νέο αποστειρωμένο σωλήνα Eppendorf.
Στη συνέχεια, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους για να κατακερματιστεί το DNA. Το βήμα υπερήχων πραγματοποιήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες όπως περιγράφεται παραπάνω. Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις κατακερματισμού στο γονιδιωματικό DNA, τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης.
(…) Τα δείγματα που είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε υπερήχους για 2,5 λεπτά υποβλήθηκαν σε στάδιο εκχύλισης μετά από θερμική επεξεργασία και φυγοκέντρηση. Το DNA που απελευθερώθηκε εκχυλίστηκε δύο φορές με μείγμα φαινόλης: χλωροφορμίου: ισοαμυλικής αλκοόλης και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε δεύτερη υπερήχηση για 0 - 15 λεπτά. Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κατανομής μεγέθους του DNA που υποβλήθηκε σε υπερηχητικό κατακερματισμό μετά την εκχύλιση (Εικ. στην επάνω δεξιά πλευρά). Το εξαιρετικά κατακερματισμένο DNA ήταν εμφανές από την παρουσία ενός επιχρίσματος DNA και όχι από ζώνες υψηλού μοριακού βάρους που εξαλείφθηκαν από δείγματα με υπερήχους για 2,5 λεπτά ή περισσότερο. Μακρύτερη υπερήχηση μείωσε σταδιακά τα μήκη θραυσμάτων σε περίπου 150 - 600 bp, και υπερήχηση για 15 λεπτά υποβάθμισε περαιτέρω αυτά τα θραύσματα, όπως μπορεί να φανεί κυρίως από το πάνω μέρος του επιχρίσματος. Έτσι, το μέσο μέγεθος θραυσμάτων DNA μειώθηκε σταδιακά με το χρόνο υπερήχων και η θεραπεία 5 λεπτών επέτρεψε να ληφθούν τα μεγέθη θραυσμάτων DNA που είναι πιο κατάλληλα για δοκιμασίες συστοιχίας τσιπ. Επιτέλους, καθιερώθηκε η διαδικασία προετοιμασίας της αναλυτέας ουσίας DNA που περιλαμβάνει τα πρώτα 2 λεπτά θεραπείας με υπερήχους, την εκχύλιση DNA (2×) και την επακόλουθη υπερήχηση 5 λεπτών. (Basselet et al. 2008)

Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP)

Τα κύτταρα HEK293 καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω και σταθεροποιήθηκαν με 2 mM disuccinimidyl-glutarate για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Η χρωματίνη διασυνδέθηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας 1% (v/v) φορμαλδεΰδης και πλύθηκε δύο φορές με παγωμένο PBS. Η αντίδραση διασύνδεσης διακόπηκε με επώαση με γλυκίνη σε τελική συγκέντρωση 0,125 M για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση με θρυψίνη, τα κύτταρα αποξέστηκαν από το τρυβλίο κυτταροκαλλιέργειας και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl και 0.5% (v/v) Nonidet P-40), επωάστηκε σε πάγο για 10 λεπτά και ομογενοποιήθηκε με ομογενοποιητή Dounce. Στη συνέχεια, οι πυρήνες σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (3500 x g, 5 min, 4 °C) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα πυρήνων (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA και 1% (w/v) SDS). Οι πυρήνες διαταράχθηκαν από υπερήχους με τρεις παλμούς 20-s σε ένα UP50H υπερήχων (Hielscher Ultraschall Technologie) σε ρύθμιση κύκλου 0,5 και πλάτους 30%, δίνοντας θραύσματα γονιδιωματικού DNA με μέγεθος όγκου 200 – 1000 bp. Για το ChIP, 50g DNA αραιώθηκαν 4 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα ανοσοκατακρήμνισης (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 και 0,01% (w/v) SDS). (Weiske κ.ά. 2006)

Ανάλυση τροποποίησης ιστόνης με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP)

Εν συντομία, 6 x 10⁶ Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και διασταυρώθηκαν στην πλάκα καλλιέργειας για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου παρουσία φορμαλδεΰδης 0,5%. Η αντίδραση διασύνδεσης σταμάτησε με την προσθήκη 0,125 Μ γλυκίνης. Όλα τα επόμενα βήματα πραγματοποιήθηκαν στους 48°C. Όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα ήταν προψυγμένα και περιείχαν αναστολείς πρωτεάσης (Complete Mini, Roche). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια ξύστηκαν. Τα συλλεχθέντα σφαιρίδια διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 1 ml (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) και υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε ψυχρό λουτρό αιθανόλης για 10 κύκλους σε πλάτος 100% χρησιμοποιώντας ένα UP50H υπερήχων (Hielscher, Teltow, Γερμανία). Ο κατακερματισμός της χρωματίνης απεικονίστηκε σε 1% γέλη αγαρόζης. Τα θραύσματα που ελήφθησαν ήταν στην περιοχή 200-500pb. Η διαλυτή χρωματίνη ελήφθη με φυγοκέντρηση των δειγμάτων με υπερήχους στα 14.000g για 10 λεπτά στους 48°C. Το διαλυτό κλάσμα αραιώθηκε κατά 1/10 σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) και στη συνέχεια διαδόθηκε και αποθηκεύτηκε στους 80°C μέχρι τη χρήση. (Rodriguez et al. 2008)