Πρωτόκολλο για αδρανοποίηση κορωνοϊού SARS-CoV-2 με υπερήχους

Το Hielscher VialTweeter είναι μια μοναδική μονάδα παρασκευής υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων, η οποία χρησιμοποιείται για την αδρανοποίηση του κοροναϊού SARS-COV-2. Το VialTweeter επιτρέπει την προετοιμασία έως και 10 φιαλιδίων δείγματος ταυτόχρονα και έτσι είναι η ιδανική μονάδα για μαζική επεξεργασία δειγμάτων.

Αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-CoV-2 με το VialTweeter

Μετά την αφαίρεση του σταθεροποιητικού, οι μονοστιβάδες πλύθηκαν τρεις φορές με φυσιολογικό ορό με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS) πριν από την απόξεση των κυττάρων σε 1mL MEM / 5% FBS και κατεργασμένα με υπερήχους (3 × 10 δευτερόλεπτα επάνω, 10 δευτερόλεπτα μακριά σε ισχύ και πλάτος 100%) χρησιμοποιώντας τον επεξεργαστή υπερήχων Hielscher UP200St με VialTweeter κατάσχεση. Τα υπερκείμενα καθαρίστηκαν με φυγοκέντρηση στα 3000 × g για 10 λεπτά. 

Διαβάστε το πλήρες πρωτόκολλο εδώ για την αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-CoV-2 από τους Welch et al. (2020) παρακάτω:

Κύτταρα και ιός

Κύτταρα Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο απαραίτητο μέσο του αετού (MEM) συμπληρωμένο με 10% (v/v) εμβρυϊκό ορό μοσχαριού (FCS). Ο ιός που χρησιμοποιήθηκε ήταν το στέλεχος hCOV-19/England/2/2020 του SARS-CoV-2, που απομονώθηκε από τον PHE από την πρώτη ομάδα ασθενών στο Ηνωμένο Βασίλειο στις 29/01/2020. Αυτός ο ιός ελήφθη στο πέρασμα 1 και χρησιμοποιήθηκε για μελέτες αδρανοποίησης στο πέρασμα 2 ή 3.
Για αντιδραστήρια και χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για την αδρανοποίηση του SARS-CoV-2 καθώς και για την απομάκρυνση της κυτταροτοξικότητας αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στην επιστημονική έκθεση των Welch et al. (2020).

Αδρανοποίηση ιών από απορρυπαντικά – Πρωτόκολλο αδρανοποίησης κορωνοϊού SARS-CoV-2 από τους Welch et al. 2020

Αδρανοποίηση SARS-CoV-2

Για εμπορικά προϊόντα, παρασκευάσματα ιών (υγρό ιστοκαλλιέργειας, τίτλοι που κυμαίνονται από 1 × 10⁶ έως 1 × 10⁸ PFU/ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις τριπλούν με αντιδραστήρια σε συγκεντρώσεις και για τους χρόνους επαφής που συνιστώνται στις οδηγίες χρήσης των παρασκευαστών, εφόσον υπάρχουν, ή για συγκεντρώσεις και χρόνους που ζητούνται ειδικά από τα εργαστήρια δοκιμών. Όπου δόθηκε ένα εύρος συγκεντρώσεων από τον κατασκευαστή, δοκιμάστηκε η χαμηλότερη αναλογία προϊόντος προς δείγμα (δηλ. η χαμηλότερη συνιστώμενη συγκέντρωση του προϊόντος δοκιμής). Τα αντιδραστήρια σωλήνων μεταφοράς δειγμάτων ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας αναλογία ενός όγκου υγρού ιστοκαλλιέργειας προς δέκα όγκους αντιδραστηρίου, εκτός εάν ο κατασκευαστής καθόρισε λόγο όγκου υγρού δείγματος προς αντιδραστήριο. Απορρυπαντικά, στερεωτικά και διαλύτες δοκιμάστηκαν στις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για τους αναφερόμενους χρόνους. Όλα τα βήματα αδρανοποίησης πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος δωματίου (18 – 25°C). Για τη δοκιμή εναλλακτικών τύπων δείγματος, ο ιός εμβολιάστηκε στην υποδεικνυόμενη μήτρα δείγματος σε αναλογία 1:9 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήρια δοκιμής όπως παραπάνω. Όλα τα πειράματα περιελάμβαναν τριπλά δείγματα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε εικονική επεξεργασία με ισοδύναμο όγκο PBS αντί του αντιδραστηρίου δοκιμής. Αμέσως μετά τον απαιτούμενο χρόνο επαφής, 1mL επεξεργασμένου δείγματος υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την κατάλληλα επιλεγμένη μήτρα διήθησης. Η αφαίρεση αντιδραστηρίου για δοκιμή αδρανοποίησης πραγματοποιήθηκε σε μεγαλύτερη μορφή στήλης περιστροφής χρησιμοποιώντας στήλες περιστροφής αφαίρεσης απορρυπαντικού Pierce 4mL (Thermo Fisher) ή γεμίζοντας κενές στήλες φυγοκέντρησης χωρητικότητας Pierce 10mL (Thermo Fisher) με SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ή Sephadex LH-20 για να δώσουν 4mL συσκευασμένες χάντρες/ρητίνη. Για καθαρισμό με φίλτρα Amicon, 2 × 500μl δείγματα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας δύο φυγοκεντρικά φίλτρα με τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως και στη συνέχεια συνενώθηκαν μεταξύ τους. Για φορμαλδεΰδη και φορμαλδεΰδη με αφαίρεση γλουταραλδεΰδης, χρησιμοποιήθηκε ένα φίλτρο με όγκο δείγματος 1× 500μl, επαναιωρήθηκε μετά από επεξεργασία σε 500μl PBS και προστέθηκε σε 400ul MEM/5% FBS. Για αδρανοποίηση μολυσμένων μονοστρώσεις, 12,5 cm² φιάλες κυττάρων Vero E6 (2.5 × 10⁶ κύτταρα/φιάλη σε 2,5mL MEM/5% FBS) μολύνθηκαν σε MOI 0,001 και επωάστηκαν σε 37°C/5% CO₂ για 24 ώρες. Το υπερκείμενο υγρό αφαιρέθηκε και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 5mL φορμαλδεΰδης ή φορμαλδεΰδης και γλουταραλδεΰδης σε θερμοκρασία δωματίου για 15 ή 60 λεπτά. Το σταθεροποιητικό αφαιρέθηκε και οι μονοστιβάδες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS πριν από την απόξεση των κυττάρων σε 1mL MEM / 5% FBS και υπερήχηση (3 × 10 δευτερόλεπτα ενεργοποίηση, 10 δευτερόλεπτα μακριά σε ισχύ και πλάτος 100%) χρησιμοποιώντας ένα UP200St με συνημμένο VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Τα υπερκείμενα καθαρίστηκαν με φυγοκέντρηση στα 3000 × g για 10 λεπτά.

Λεπτομέρειες σχετικά με το αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται για την αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-CoV-2 με το υπερηχητικό VialTweeter σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Welch et al. 2020

Το πλήρες πρωτόκολλο συμπεριλαμβανομένης της χρήσης του Hielscher VialTweeter μπορεί να βρεθεί εδώ:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Εξελιγμένοι υπερηχητικοί διαχωριστές και κυτταρικοί διαταράκτες

Το πολλαπλών δειγμάτων υπερήχων VialTweeter είναι μόνο μία από τις πολλές λύσεις υπερήχων για την προετοιμασία δειγμάτων σε βιολογικά, βιοχημικά και κλινικά εργαστήρια. Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει το ιδανικό υπερήχων dismembrator για την εφαρμογή σας, π.χ. κυτταρική λύση, κυτταρική εκχύλιση, ομογενοποίηση ιστών, διαλυτοποίηση λυμάτων, διάλυση, απαέρωση δείγματος κλπ.
Ενημερώστε μας πόσα δείγματα πρέπει να επεξεργαστείτε ανά ώρα και ημέρα, εάν προτιμάτε άμεση ή έμμεση υπερήχηση και ποιος είναι ο στόχος της θεραπείας με υπερήχους δείγματος. Θα σας προτείνουμε την πιο κατάλληλη μονάδα υπερήχων για την καθημερινή σας ρουτίνα εργασίας!
Hielscher υπερήχων »ψηφιακοί επεξεργαστές υπερήχων είναι εξοπλισμένοι με έξυπνο λογισμικό, αυτόματη καταγραφή δεδομένων, εύκολες επιλογές προ-ρύθμισης για έλεγχο θερμοκρασίας, διάρκεια υπερήχων, λειτουργία κύκλου / παλμού, καθώς και φωτισμό δείγματος και τηλεχειριστήριο προγράμματος περιήγησης. Προσπαθούμε να κάνουμε τις συσκευές υπερήχων μας όσο το δυνατόν πιο έξυπνες, έτσι ώστε η έρευνα και η ρουτίνα εργασίας σας να γίνει όσο το δυνατόν πιο βολική και επιτυχημένη.
Κάντε κλικ εδώ, για να βρείτε περισσότερες εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων των πρωτοκόλλων προετοιμασίας δείγματος υπερήχων με το VialTweeter!