Πρωτόκολλο για την αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-CoV-2 με υπερήχηση

Ο Hielscher VialTweeter είναι μια μοναδική υπερηχητική μονάδα προετοιμασίας πολλαπλών δειγμάτων, η οποία χρησιμοποιείται για την αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-COV-2. Ο VialTweeter επιτρέπει την ταυτόχρονη προετοιμασία έως και 10 φιαλιδίων δείγματος και αποτελεί έτσι την ιδανική μονάδα για μαζική επεξεργασία δειγμάτων.

Αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-CoV-2 με τον VialTweeter

Μετά την αφαίρεση του μονιμοποιητικού, οι μονοστιβάδες πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS) πριν από την απόξεση των κυττάρων σε 1mL MEM/5% FBS και υποβλήθηκαν σε υπερήχηση (3 × 10 δευτερόλεπτα λειτουργία, 10 δευτερόλεπτα παύση στο 100% της ισχύος και του πλάτους) με χρήση του υπερηχητικού επεξεργαστή Hielscher UP200St με VialTweeter ως εξάρτημα. Τα υπερκείμενα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 3000 × g για 10 λεπτά. Διαβάστε εδώ παρακάτω το πλήρες πρωτόκολλο για την αδρανοποίηση του κορωνοϊού SARS-CoV-2 από τους Welch et al. (2020):

Κύτταρα και ιός

Κύτταρα Vero E6 (Vero C1008· ATCC CRL-1586) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο θρεπτικό μέσο Eagle (MEM) εμπλουτισμένο με 10% (v/v) εμβρυϊκό ορό μόσχου (FCS). Ο ιός που χρησιμοποιήθηκε ήταν το στέλεχος SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, το οποίο απομονώθηκε από την PHE από την πρώτη συστάδα ασθενών στο Ηνωμένο Βασίλειο στις 29/01/2020. Ο ιός αυτός ελήφθη στο πέρασμα 1 και χρησιμοποιήθηκε για μελέτες αδρανοποίησης στο πέρασμα 2 ή 3.
Για τα αντιδραστήρια και τις χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν για την αδρανοποίηση του SARS-CoV-2, καθώς και για την απομάκρυνση της κυτταροτοξικότητας των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στην επιστημονική αναφορά των Welch et al. (2020).

Αδρανοποίηση ιού με απορρυπαντικά – Πρωτόκολλο αδρανοποίησης του κορωνοϊού SARS-CoV-2 από τους Welch et al. 2020

Αδρανοποίηση του SARS-CoV-2


Για τα εμπορικά προϊόντα, τα παρασκευάσματα ιού (υγρό ιστοκαλλιέργειας, με τίτλους που κυμαίνονταν από 1 × 10⁶ έως 1 × 10⁸ PFU/ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε τριπλά δείγματα με αντιδραστήρια σε συγκεντρώσεις και για χρόνους επαφής που συνιστώνται στις οδηγίες χρήσης του κατασκευαστή, όπου αυτές ήταν διαθέσιμες, ή σε συγκεντρώσεις και χρόνους που ζητήθηκαν ειδικά από τα εργαστήρια δοκιμών. Όπου ο κατασκευαστής έδινε ένα εύρος συγκεντρώσεων, δοκιμάστηκε η χαμηλότερη αναλογία προϊόντος προς δείγμα (δηλ. η χαμηλότερη συνιστώμενη συγκέντρωση του δοκιμαζόμενου προϊόντος). Τα αντιδραστήρια των σωληναρίων μεταφοράς δειγμάτων δοκιμάστηκαν με αναλογία ενός όγκου υγρού ιστοκαλλιέργειας προς δέκα όγκους αντιδραστηρίου, εκτός αν ο κατασκευαστής καθόριζε αναλογία όγκων υγρού δείγματος προς αντιδραστήριο. Τα απορρυπαντικά, τα μονιμοποιητικά και οι διαλύτες δοκιμάστηκαν στις αναφερόμενες συγκεντρώσεις για τους αναφερόμενους χρόνους. Όλα τα στάδια αδρανοποίησης πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος δωματίου (18 – 25°C). Για τη δοκιμή εναλλακτικών τύπων δειγμάτων, ο ιός προστέθηκε στην αναφερόμενη μήτρα δείγματος σε αναλογία 1:9 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τα δοκιμαζόμενα αντιδραστήρια όπως παραπάνω. Όλα τα πειράματα περιλάμβαναν τριπλά δείγματα ελέγχου με εικονική επεξεργασία, με ισοδύναμο όγκο PBS στη θέση του δοκιμαζόμενου αντιδραστηρίου. Αμέσως μετά τον απαιτούμενο χρόνο επαφής, 1mL του επεξεργασμένου δείγματος υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την κατάλληλα επιλεγμένη μήτρα διήθησης. Η απομάκρυνση των αντιδραστηρίων για τις δοκιμές αδρανοποίησης πραγματοποιήθηκε σε μεγαλύτερη μορφή στήλης φυγοκέντρησης με στήλες Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) ή με πλήρωση κενών στηλών φυγοκέντρησης Pierce χωρητικότητας 10mL (Thermo Fisher) με SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ή Sephadex LH-20, ώστε να προκύψουν 4mL συμπυκνωμένων σφαιριδίων/ρητίνης. Για τον καθαρισμό με φίλτρα Amicon, δείγματα 2 × 500μl καθαρίστηκαν με δύο φίλτρα φυγοκέντρησης σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως και στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν μαζί. Για την απομάκρυνση της φορμαλδεΰδης και της φορμαλδεΰδης με γλουταραλδεΰδη, χρησιμοποιήθηκε ένα φίλτρο με όγκο δείγματος 1× 500μl, το οποίο μετά την επεξεργασία επαναιωρήθηκε σε 500μl PBS και προστέθηκε σε 400ul MEM/5% FBS. Για την αδρανοποίηση μολυσμένων μονοστιβάδων, φιάλες 12,5 cm² κυττάρων Vero E6 (2,5 × 10⁶ κύτταρα/φιάλη σε 2,5mL MEM/5% FBS) μολύνθηκαν με MOI 0,001 και επωάστηκαν στους 37°C/5% CO₂ για 24 ώρες. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 5mL φορμαλδεΰδης, ή φορμαλδεΰδης και γλουταραλδεΰδης, σε θερμοκρασία δωματίου για 15 ή 60 λεπτά. Το μονιμοποιητικό αφαιρέθηκε και οι μονοστιβάδες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS πριν από την απόξεση των κυττάρων σε 1mL MEM/5% FBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπερήχηση (3 × 10 δευτερόλεπτα λειτουργίας, 10 δευτερόλεπτα παύσης στο 100% της ισχύος και του πλάτους) με χρήση ενός UP200St με εξάρτημα VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Τα υπερκείμενα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 3000 × g για 10 λεπτά.


Λεπτομέρειες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν για την αδρανοποίηση του κορονοϊού SARS-CoV-2 με τον υπερηχητικό VialTweeter σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Welch et al. 2020

Το πλήρες πρωτόκολλο, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης του Hielscher VialTweeter, είναι διαθέσιμο εδώ:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Εξελιγμένοι υπερηχητικοί διαμελιστές και διασπαστές κυττάρων

Ο πολυδειγματικός υπερηχητής VialTweeter είναι μόνο μία από τις πολλές υπερηχητικές λύσεις για την προετοιμασία δειγμάτων σε βιολογικά, βιοχημικά και κλινικά εργαστήρια. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει τον ιδανικό υπερηχητικό διαμελιστή για την εφαρμογή σας, π.χ. λύση κυττάρων, εκχύλιση κυττάρων, ομογενοποίηση ιστών, διαλυτοποίηση λυσάτων, διάλυση, απαέρωση δειγμάτων κ.λπ.
Ενημερώστε μας πόσα δείγματα πρέπει να επεξεργάζεστε ανά ώρα και ανά ημέρα, αν προτιμάτε άμεση ή έμμεση υπερήχηση και ποιος είναι ο στόχος της υπερηχητικής επεξεργασίας των δειγμάτων. Θα σας προτείνουμε την πλέον κατάλληλη υπερηχητική μονάδα για την καθημερινή σας εργασία!
Οι ψηφιακοί υπερηχητικοί επεξεργαστές της Hielscher Ultrasonics είναι εξοπλισμένοι με έξυπνο λογισμικό, αυτόματη καταγραφή δεδομένων, εύκολες επιλογές προρρύθμισης για τον έλεγχο της θερμοκρασίας, τη διάρκεια της υπερήχησης και τη λειτουργία κύκλου/παλμού, καθώς και με φωτισμό δείγματος και απομακρυσμένο έλεγχο μέσω προγράμματος περιήγησης. Προσπαθούμε να κάνουμε τις υπερηχητικές μας συσκευές όσο το δυνατόν πιο έξυπνες, ώστε η έρευνα και η καθημερινή σας εργασία να γίνονται όσο το δυνατόν πιο βολικές και επιτυχημένες.
Κάντε κλικ εδώ, για να βρείτε περισσότερες εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων πρωτοκόλλων υπερηχητικής προετοιμασίας δειγμάτων με τον VialTweeter!