Υπερηχητική προετοιμασία δείγματος για τις δοκιμασίες ELISA

Elisa – Ανοσοπροσροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο

Elisa σημαίνει ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία και είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική βιοχημικής ανάλυσης της κατηγορίας των ligand-δεσμευτικές δοκιμασίες. Στο ELISA, προστίθεται ένα υγρό δείγμα σε μια σταθερή στερεά φάση με ειδικές ιδιότητες σύνδεσης. Κανονικά, η σταθερή στερεά φάση εφαρμόζεται ως επικάλυψη σε μια πλάκα καλά ή πλάκα ELISA. Στη συνέχεια, διάφορα υγρά αντιδραστήρια προστίθενται διαδοχικά, επωάζονται και πλένονται, έτσι ώστε τελικά μια οπτική αλλαγή (π.χ. ανάπτυξη χρώματος από το προϊόν μιας ενζυμικής αντίδρασης) εμφανίζεται στο τελικό υγρό στο πηγάδι. Η οπτική αλλαγή επιτρέπει τη μέτρηση της ποσότητας του αναλύτη με “ανάγνωση". Για την ποσοτική ανάγνωση, χρησιμοποιείται φασματοφωτόμετρο, φθορόμετρο ή φωτιστικό για την ανίχνευση και μέτρηση της έντασης του εκπεμπόμενου φωτός. Η ευαισθησία της ανίχνευσης επηρεάζεται από την ενίσχυση του σήματος κατά τη διάρκεια των αναλυτικών αντιδράσεων. Δεδομένου ότι οι αντιδράσεις ενζύμων διερευνώνται καλά και αξιόπιστες διαδικασίες ενίσχυσης, τα ένζυμα χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία του σήματος. Τα ένζυμα συνδέονται με τα αντιδραστήρια ανίχνευσης σε σταθερές αναλογίες για να καταστεί δυνατή η ακριβής ποσοτικός προσδιορισμός, γεγονός που εξηγεί επίσης την ονομασία "ενζυμική" ανοσοπροσροφητική δοκιμασία.
Καθώς οι δοκιμασίες ELISA εκτελούνται σε πλάκες μικροτιτήρη / πλάκες 96-well, είναι γνωστή ως τεχνική δοκιμασίας με βάση την πλάκα και χρησιμοποιείται π.χ. σε κλινικές in vitro διαγνωστικές, ερευνητικές, ανάπτυξη φαρμάκων κ.λπ.
Η τεχνική ELISA χρησιμοποιείται συχνά ως διαγνωστικό εργαλείο στην ιατρική, τη βιοτεχνολογία, την παθολογία των φυτών και αποτελεί επίσης σημαντική μέτρηση ποιοτικού ελέγχου σε πολλές βιομηχανίες.

Υπερηχητική προετοιμασία δείγματος πριν από την ELISA

Πριν από τη δοκιμασία ELISA μπορεί να πραγματοποιηθεί, τα δείγματα απαιτούν βήματα προετοιμασίας τέτοια κυτταρική λύση και εκχύλιση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, DNA, RNA κ.λπ. Το πλεονέκτημα της υπερηχητικής λύσης κυττάρων και της απομόνωσης πρωτεϊνών είναι η υψηλή αποδοτικότητα, η αξιοπιστία και η αναπαραγωγιμότητα του. Όλοι αυτοί οι παράγοντες είναι σημαντικοί για την απόκτηση διαγνωστικών και ερευνητικών αποτελεσμάτων υψηλής ποιότητας

Πρωτόκολλο για την προ-ELISA υπερηχητική λύση κυττάρων

• Για κυτταρικές καλλιέργειες: Πριν από τη λύση των υπερηχητικών κυττάρων, τα κύτταρα φυγοκέντρησης για 5 λεπτά σε 270 x g σε ένα μικροκεντρικό. Αφαιρέστε το υπερκείμενο με αναρρόφηση και επαναιωρούμε τα κύτταρα σε 30 – 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος RIPA. Στη συνέχεια, επωάστε το σφαιρίδιο κυττάρων στον πάγο για 30 λεπτά.
• Τώρα, το δείγμα κυττάρων είναι έτοιμο για την υπερηχητική λύση:
  Χρησιμοποιήστε έναν υπερηχητικό καθετήρα τύπου (π.χ. Uf200 ः t με καθετήρα S26d2) ή μια συσκευή πολλαπλών δειγμάτων υπερήχων (π.χ. VialTweeter για ταυτόχρονη υπερήχηση έως 10 φιαλιδίων ή το UIP400MPT για πλάκες μικροτιτλοτέρας / πλάκες 96 φρεατίων) ανάλογα με την ποσότητα των δειγμάτων που πρέπει να προετοιμάσετε.
  Για την υπερήχηση τύπου καθετήρα ενός μόνο δείγματος, τοποθετήστε τα κύτταρα σε σωλήνες μικροκεντροχείωσης 1,5 mL.
• Προ-ρυθμίστε τη διάρκεια υπερήχων σας, συνολική εισροή ενέργειας, λειτουργία κύκλου και / ή τα όρια θερμοκρασίας στο ψηφιακό μενού του ultrasonicator. Αυτό εξασφαλίζει εξαιρετικά αξιόπιστη υπερήχηση και επαναληψιμότητα.
• Ενέστε το sonotrode και ενεργοποιήστε τη συσκευή υπερήχων. Μετακινήστε απαλά το μικρο-άκρο του υπερηχητικού καθετήρα μέσω του δείγματος για να υπερήχηση του δείγματος ομοιόμορφα.
  Για τα περισσότερα κύτταρα, υπερήχων λύση θα ολοκληρωθεί μετά από 2 -4 κύκλους των 10 sec υπερήχηση.
• Μετά την υπερήχηση, αφαιρέστε το sonotrode από το δείγμα. Τα δείγματα πρέπει να επωάζονται στον πάγο επί 5 λεπτά. Στη συνέχεια, φυγοκεντρείται σε 10.000 x g για 20 λεπτά για να σφαιρίδιο τα συντρίμμια. Μεταφέρετε τα υπερναττικά σε νέο σωλήνα μικροκεντροποίησης. Ετικέτα των αναλύτη και κατάστημα σε -20°C.
• Το υπερηχητικό sonotrode μπορεί να καθαριστεί με το σκούπισμα σωστά με το οινόπνευμα ή sonicate σε ένα ποτήρι που γεμίζουν με το οινόπνευμα, π.χ. αιθανόλη 70%. Όλοι οι υπερηχητικοί ανιχνευτές που γίνονται από το τιτάνιο είναι αυτόκλειστοι.

Για ομογενικά ιστών:

• Ξεπλύνετε τον ιστό με παγωμένο PBS (0,01M, pH=7.4) για να αφαιρέσετε καλά το υπερβολικό αίμα αιμόλυσης.
• Ζυγίστε τον ιστό (νεφρό, καρδιά, πνεύμονας, σπλήνα κ.λπ.) και το macerate σε μικρά κομμάτια, τα οποία ομογενοποιούνται σε PBS. Ο απαιτούμενος όγκος PBS σχετίζεται με το βάρος του ιστού. Κατά κανόνα, 1g ιστού απαιτεί περίπου 9mL PBS. Συνιστάται να προσθέσετε κάποιο αναστολέα πρωτεάσης στο PBS. (Το ρυθμιστικό διάλυμα RIPA ή υποτονικής λύσης που περιέχει το κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά.)
• Ανάλογα με το μέγεθος του ιστού, μια σύντομη θεραπεία δίνης (περίπου 1-2 λεπτά σε 15 δευτερόλεπτα παλμούς) μπορεί να είναι χρήσιμη για την προ-θεραπεία του ιστού.
• Τοποθετήστε ένα μικρο-άκρο, π.χ. S26d2, στον υπερηχητικό σας. Τοποθετήστε το σωλήνα δείγματος με τον ιστό σε ένα λουτρό πάγου.
• Υπερήχηση του δείγματος με ultrasonicator σας, π.χ. UP200St (80% πλάτος) για 1 λεπτό σε λειτουργία παλμού (15sec, 15sec παύση). Κρατήστε το δείγμα στο λουτρό πάγου.
• Στη συνέχεια, τα ομογενή φυγοκεντρούνται για να αποκτήσουν συγκεκριμένες ομάδες (κυτταροσόλη, πυρηνική, μιτοχονδριακή ή λυσοσωμική) προκειμένου να εμπλουτιστεί η πρωτεΐνη για ανάλυση. Με τη φυγοκέντρηση του δείγματος για 5 λεπτά σε 5000×g, ανακτάται το υπερκείμενο.

Αξιόπιστος έλεγχος θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της υπερήχησης

Η θερμοκρασία είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που επηρεάζει τη διαδικασία και είναι ιδιαίτερα σημαντικός για τη θεραπεία βιολογικών δειγμάτων, π.χ. για την πρόληψη της θερμικής υποβάθμισης των πρωτεϊνών. Καθώς όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας του δείγματος, η υπερήχηση δημιουργεί θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελεγχθεί καλά όταν χρησιμοποιείτε τις συσκευές Hielscher Ultrasonics. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας κατά την προετοιμασία τους με ένα υπερηχητικό καθετήρα τύπου ή το VialTweeter προ-αναλυτικά.

1. Παρακολούθηση της θερμοκρασίας του δείγματος: Όλοι οι ψηφιακοί επεξεργαστές υπερήχων Hielscher είναι εξοπλισμένοι με ένα έξυπνο λογισμικό και έναν αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στη συσκευή υπερήχων (π.χ. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) και τοποθετήστε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε έναν από τους σωλήνες δείγματος. Μέσω ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του επεξεργαστή υπερήχων ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας για την υπερήχηση του δείγματός σας. Ο υπερηχητικός παράγοντας θα σταματήσει αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και θα σταματήσει μέχρι να μειωθεί η θερμοκρασία του δείγματος στη χαμηλότερη τιμή της καθορισμένης θερμοκρασίας ∆. Στη συνέχεια, η υπερήχηση ξεκινά αυτόματα και πάλι. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την υποβάθμιση που προκαλείται από τη θερμότητα.
2. Όσον αφορά την υπερηχητική μονάδα πολλαπλών δειγμάτων VialTweeter, το μπλοκ τιτανίου, το οποίο περιέχει τους σωλήνες δείγματος, μπορεί να προψυχωθεί. Τοποθετήστε το μπλοκ VialTweeter (μόνο το sonotrode χωρίς μετατροπέα!) στο ψυγείο ή τον καταψύκτη για να προψύξετε το μπλοκ τιτανίου βοηθά στην αναβολή της αύξησης της θερμοκρασίας του δείγματος. Εάν είναι δυνατόν, το ίδιο το δείγμα μπορεί να προψυκτιστεί πάρα πολύ.
3. Χρησιμοποιήστε ένα λουτρό πάγου ή ξηρό πάγο για να κρυώσει κατά τη διάρκεια υπερήχηση. Τοποθετήστε το δείγμα σωλήνα σας (ες) κατά τη διάρκεια υπερήχηση σε ένα λουτρό πάγου. Για το VialTweeter, χρησιμοποιήστε ένα ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter στον ξηρό πάγο έτσι ώστε η θερμότητα μπορεί να διαλύσει γρήγορα.

Οι πελάτες σε όλο τον κόσμο χρησιμοποιούν το Hielscher καθετήρα-ultrasonicators, καθώς και το multi-δείγμα υπερήχων μονάδες VialTweeter και UIP400MTP για την καθημερινή εργασία προετοιμασίας του δείγματος τους σε βιολογικά, βιοχημικά, ιατρικά και κλινικά εργαστήρια. Το ευφυές λογισμικό και ο έλεγχος θερμοκρασίας των επεξεργαστών Hielscher, η θερμοκρασία ελέγχεται αξιόπιστα και η θερμότητα-προκληθείσα υποβάθμιση δειγμάτων αποφεύχθηκε. Υπερήχων προετοιμασία δείγματος με Hielscher υπερήχων λύσεις προσφέρει εξαιρετικά αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα!