Προετοιμασία δειγμάτων με υπερήχους για δοκιμασίες ELISA

Δοκιμασίες όπως η ELISA χρησιμοποιούνται ευρέως για διαγνωστικές εξετάσεις in vitro, ανίχνευση πρωτεϊνών που σχετίζονται με ασθένειες και έλεγχο ποιότητας (π.χ. παρακολούθηση αλλεργιογόνων τροφίμων). Η προετοιμασία δειγμάτων με υπερήχους είναι μια ταχεία, αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη τεχνική για τη λύση κυττάρων και την απομόνωση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, DNA, RNA και οργανιδίων. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις υπερήχων για την εύκολη προετοιμασία μεμονωμένων δειγμάτων, πολλαπλών φιαλιδίων, καθώς και πλακών μικροτιτλοδότησης και πλακών 96 βοθρίων.

ELISA – Ενζυμοσυνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία

Το ELISA σημαίνει ενζυμοσυνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία και είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική βιοχημικής ανάλυσης που ανήκει στην κατηγορία των δοκιμασιών δέσμευσης προσδετών. Στην ELISA, ένα υγρό δείγμα προστίθεται σε μια στατική στερεή φάση με ειδικές ιδιότητες δέσμευσης. Συνήθως, η στατική στερεή φάση εφαρμόζεται ως επίστρωση σε μια πλάκα βοθρίων ή πλάκα ELISA. Στη συνέχεια, προστίθενται διαδοχικά διάφορα υγρά αντιδραστήρια, επωάζονται και εκπλένονται, ώστε τελικά να προκύψει μια οπτική μεταβολή (π.χ. ανάπτυξη χρώματος από το προϊόν μιας ενζυμικής αντίδρασης) στο τελικό υγρό του βοθρίου. Η οπτική μεταβολή επιτρέπει τη μέτρηση της ποσότητας της αναλυόμενης ουσίας μέσω της λεγόμενης ποσοτικής «ανάγνωσης». Για την ποσοτική ανάγνωση, χρησιμοποιείται φασματοφωτόμετρο, φθορισμόμετρο ή λουμινόμετρο για την ανίχνευση και τη μέτρηση της έντασης του διερχόμενου φωτός. Η ευαισθησία ανίχνευσης επηρεάζεται από την ενίσχυση του σήματος κατά τις αναλυτικές αντιδράσεις. Επειδή οι ενζυμικές αντιδράσεις είναι καλά μελετημένες και αξιόπιστες διεργασίες ενίσχυσης, χρησιμοποιούνται ένζυμα για τη δημιουργία του σήματος. Τα ένζυμα συνδέονται με τα αντιδραστήρια ανίχνευσης σε σταθερές αναλογίες, ώστε να επιτρέπεται η ακριβής ποσοτικοποίηση, γεγονός που εξηγεί και τον όρο «ενζυμοσυνδεδεμένη» ανοσοπροσροφητική δοκιμασία.
Καθώς οι δοκιμασίες ELISA εκτελούνται σε πλάκες μικροτιτλοδότησης / πλάκες 96 βοθρίων, η ELISA είναι γνωστή ως τεχνική δοκιμασίας σε πλάκα και χρησιμοποιείται π.χ. στην κλινική διαγνωστική in vitro, στην έρευνα, στην ανάπτυξη φαρμάκων κ.λπ. για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση αντισωμάτων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών και ορμονών.
Η τεχνική ELISA χρησιμοποιείται συχνά ως διαγνωστικό εργαλείο στην ιατρική, στη βιοτεχνολογία και στη φυτοπαθολογία και αποτελεί επίσης σημαντική μέτρηση ελέγχου ποιότητας σε πολλούς βιομηχανικούς κλάδους.

Προετοιμασία δειγμάτων με υπερήχους πριν από την ELISA

Πριν από την εκτέλεση της δοκιμασίας ELISA, τα δείγματα απαιτούν στάδια προετοιμασίας, όπως λύση κυττάρων και εκχύλιση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, DNA, RNA κ.λπ. Το πλεονέκτημα της λύσης κυττάρων και της απομόνωσης πρωτεϊνών με υπερήχους είναι η υψηλή αποδοτικότητα, η αξιοπιστία και η αναπαραγωγιμότητά τους. Όλοι αυτοί οι παράγοντες είναι σημαντικοί για την επίτευξη διαγνωστικών και ερευνητικών αποτελεσμάτων υψηλής ποιότητας

Πρωτόκολλο λύσης κυττάρων με υπερήχους πριν από την ELISA

• Για κυτταροκαλλιέργειες: Πριν από τη λύση κυττάρων με υπερήχους, φυγοκεντρήστε τα κύτταρα για 5 λεπτά στα 270 x g σε μικροφυγόκεντρο. Απομακρύνετε το υπερκείμενο με αναρρόφηση και επαναιωρήστε τα κύτταρα σε 30 – 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος RIPA. Στη συνέχεια, επωάστε το κυτταρικό ίζημα σε πάγο για 30 λεπτά.
• Το κυτταρικό δείγμα είναι πλέον έτοιμο για λύση με υπερήχους:
  Χρησιμοποιήστε μια συσκευή υπερήχων τύπου καθετήρα (π.χ. UP200Ht με καθετήρα S26d2) ή μια συσκευή υπερήχων για πολλαπλά δείγματα (π.χ. VialTweeter για ταυτόχρονη κατεργασία με υπερήχους έως και 10 φιαλιδίων ή το UIP400MPT για πλάκες μικροτιτλοδότησης / πλάκες 96 βοθρίων), ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων που χρειάζεται να προετοιμάσετε.
  Για την κατεργασία ενός μεμονωμένου δείγματος με υπερήχους τύπου καθετήρα, τοποθετήστε τα κύτταρα σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης των 1,5 mL.
• Προρυθμίστε τη διάρκεια κατεργασίας με υπερήχους, τη συνολική εισαγόμενη ενέργεια, τη λειτουργία κύκλων ή/και τα όρια θερμοκρασίας στο ψηφιακό μενού της συσκευής υπερήχων. Αυτό εξασφαλίζει εξαιρετικά αξιόπιστη κατεργασία με υπερήχους και επαναληψιμότητα.
• Εισαγάγετε το ηχοτρόδιο και ενεργοποιήστε τη συσκευή υπερήχων. Μετακινήστε απαλά το μικροάκρο του καθετήρα υπερήχων μέσα στο δείγμα, ώστε η κατεργασία του δείγματος με υπερήχους να είναι ομοιόμορφη.
  Για τα περισσότερα κύτταρα, η λύση με υπερήχους θα ολοκληρωθεί μετά από 2–4 κύκλους κατεργασίας με υπερήχους διάρκειας 10 sec.
• Μετά την κατεργασία με υπερήχους, αφαιρέστε το ηχοτρόδιο από το δείγμα. Τα δείγματα θα πρέπει να επωαστούν σε πάγο για 5 min. Στη συνέχεια, φυγοκεντρήστε στα 10.000 x g για 20 min, ώστε τα υπολείμματα να σχηματίσουν ίζημα. Μεταφέρετε τα υπερκείμενα υγρά σε νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης. Επισημάνετε τις προς ανάλυση ουσίες και αποθηκεύστε στους -20°C.
• Το ηχοτρόδιο υπερήχων μπορεί να καθαριστεί σκουπίζοντάς το σχολαστικά με αλκοόλη ή υποβάλλοντάς το σε κατεργασία με υπερήχους μέσα σε ποτήρι ζέσεως γεμάτο με αλκοόλη, π.χ. αιθανόλη 70%. Όλοι οι καθετήρες υπερήχων που είναι κατασκευασμένοι από τιτάνιο μπορούν να αποστειρωθούν σε αυτόκαυστο.

• Ξεπλύνετε τον ιστό με παγωμένο PBS (0,01M, pH=7,4), ώστε να απομακρυνθεί πλήρως η περίσσεια αιμολυμένου αίματος.
• Ζυγίστε τον ιστό (νεφρός, καρδιά, πνεύμονας, σπλήνας κ.λπ.) και πολτοποιήστε τον σε μικρά τεμάχια, τα οποία ομογενοποιούνται σε PBS. Ο απαιτούμενος όγκος PBS εξαρτάται από το βάρος του ιστού. Κατά κανόνα, 1g ιστού απαιτεί περίπου 9mL PBS. Συνιστάται η προσθήκη κάποιου αναστολέα πρωτεασών στο PBS. (Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ρυθμιστικό διάλυμα RIPA ή υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει μείγμα αναστολέων πρωτεασών και φωσφατασών.)
• Ανάλογα με το μέγεθος του ιστού, μια σύντομη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex (περίπου 1–2 min. με παλμούς διάρκειας 15 sec.) μπορεί να είναι χρήσιμη για την προκατεργασία του ιστού.
• Προσαρμόστε ένα μικροάκρο, π.χ. S26d2, στη συσκευή υπερήχων σας. Τοποθετήστε το σωληνάριο δείγματος που περιέχει τον ιστό σε λουτρό πάγου.
• Υποβάλετε το δείγμα σε κατεργασία με τη συσκευή υπερήχων σας, π.χ. UP200St (πλάτος ταλάντωσης 80%), για 1 min. σε παλμική λειτουργία (15sec λειτουργία, 15sec παύση). Διατηρήστε το δείγμα στο λουτρό πάγου.
• Στη συνέχεια, τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρούνται για τη λήψη συγκεκριμένων κλασμάτων (κυτταροπλασματικών, πυρηνικών, μιτοχονδριακών ή λυσοσωμικών), με σκοπό τον εμπλουτισμό της πρωτεΐνης προς ανάλυση. Με φυγοκέντρηση του δείγματος για 5 λεπτά στα 5000×g, συλλέγεται το υπερκείμενο υγρό.

Αξιόπιστος έλεγχος θερμοκρασίας κατά την κατεργασία με υπερήχους

Η θερμοκρασία είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που επηρεάζει τη διεργασία και έχει ιδιαίτερη σημασία για την επεξεργασία βιολογικών δειγμάτων, π.χ. για την αποφυγή της θερμικής αποδόμησης των πρωτεϊνών. Όπως όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων, η κατεργασία με υπερήχους παράγει θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελέγχεται αποτελεσματικά κατά τη χρήση των συσκευών της Hielscher Ultrasonics. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας κατά την προαναλυτική προετοιμασία τους με συσκευή υπερήχων τύπου καθετήρα ή με το VialTweeter.

1. Παρακολούθηση της θερμοκρασίας του δείγματος: Όλοι οι ψηφιακοί επεξεργαστές υπερήχων της Hielscher είναι εξοπλισμένοι με έξυπνο λογισμικό και συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στη συσκευή υπερήχων (π.χ., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών φρεατίων) και εισαγάγετε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε ένα από τα σωληνάρια δείγματος. Μέσω της ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του επεξεργαστή υπερήχων ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας για την κατεργασία του δείγματός σας με υπερήχους. Η συσκευή υπερήχων θα σταματήσει αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και θα παραμείνει σε παύση έως ότου η θερμοκρασία του δείγματος μειωθεί στην κατώτερη τιμή του καθορισμένου εύρους θερμοκρασίας ∆. Στη συνέχεια, η κατεργασία με υπερήχους ξεκινά ξανά αυτόματα. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την αποδόμηση που προκαλείται από τη θερμότητα.
2. Όσον αφορά τη μονάδα υπερήχων VialTweeter για πολλαπλά δείγματα, το μπλοκ τιτανίου που συγκρατεί τα σωληνάρια δειγμάτων μπορεί να προψυχθεί. Τοποθετήστε το μπλοκ του VialTweeter (μόνο το ηχοτρόδιο χωρίς τον μετατροπέα!) στο ψυγείο ή στον καταψύκτη για να προψύξετε το μπλοκ τιτανίου, κάτι που βοηθά στην καθυστέρηση της αύξησης της θερμοκρασίας του δείγματος. Εάν είναι δυνατόν, μπορεί να προψυχθεί και το ίδιο το δείγμα.
3. Χρησιμοποιήστε λουτρό πάγου ή ξηρό πάγο για ψύξη κατά την κατεργασία με υπερήχους. Τοποθετήστε το σωληνάριο ή τα σωληνάρια των δειγμάτων σας σε λουτρό πάγου κατά την κατεργασία με υπερήχους. Για το VialTweeter, χρησιμοποιήστε έναν ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter πάνω στον ξηρό πάγο, ώστε η θερμότητα να μπορεί να απομακρύνεται γρήγορα.

Πελάτες σε όλο τον κόσμο χρησιμοποιούν τις συσκευές υπερήχων τύπου ακίδας της Hielscher, καθώς και τις μονάδες κατεργασίας πολλαπλών δειγμάτων με υπερήχους VialTweeter και UIP400MTP, για την καθημερινή προετοιμασία δειγμάτων σε βιολογικά, βιοχημικά, ιατρικά και κλινικά εργαστήρια. Με το έξυπνο λογισμικό και τον έλεγχο θερμοκρασίας των επεξεργαστών της Hielscher, η θερμοκρασία ελέγχεται αξιόπιστα και αποφεύγεται η υποβάθμιση των δειγμάτων λόγω θερμότητας. Η προετοιμασία δειγμάτων με τις λύσεις υπερήχων της Hielscher παρέχει εξαιρετικά αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα!
Διαβάστε περισσότερα για την κατεργασία με υπερήχους υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας με τη συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών βοθρίων για αναλυτικές δοκιμασίες!