Υπερήχων λύση των δειγμάτων Drosophila melanogaster

Η Drosophila melanogaster χρησιμοποιείται ευρέως στα εργαστήρια ως πρότυπος οργανισμός. Ως εκ τούτου, πρέπει να εκτελούνται συχνά προ-αναλυτικά στάδια προετοιμασίας, όπως λύση, κυτταρική διαταραχή, εκχύλιση πρωτεϊνών και διάτμηση DNA δειγμάτων Drosophila melanogaster. Οι υπερηχητικοί dismembrators είναι αξιόπιστοι και αποτελεσματικοί και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτέλεση διαφόρων καθηκόντων όπως η λύση, η εκχύλιση πρωτεϊνών ή ο κατακερματισμός του DNA άνετα, προσαρμόζοντας μόνο τις παραμέτρους της διαδικασίας υπερήχων. Οι ομογενοποιητές υπερήχων είναι έτσι ευέλικτα εργαλεία με ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών.

Υπερήχων λύση και εκχύλιση πρωτεϊνών

Λύση, διαλυτοποίηση κυττάρων, ομογενοποίηση ιστών και εκχύλιση πρωτεϊνών είναι τυπικά καθήκοντα για υπερήχων dismembrators σε βιολογικά εργαστήρια. Υπερήχων dismembrators και διαταράκτες κυττάρων είναι κατάλληλα για την ομογενοποίηση ζωικών ιστών, έντομα (π.χ., Drosophila melanogaster, C. elegans) ή φυτικά δείγματα. Οι επόμενες εφαρμογές της υπερήχων είναι η λύση των κυτταρικών εναιωρημάτων και σφαιριδίων, καθώς και η εκχύλιση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών.
Η λύση με υπερήχους και η εκχύλιση πρωτεϊνών είναι εξαιρετικά αξιόπιστες και αναπαραγώγιμες διαδικασίες, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν βάσει καθιερωμένων πρωτοκόλλων. Δεδομένου ότι η ένταση της διαδικασίας υπερήχων μπορεί να ρυθμιστεί ακριβώς μέσω παραμέτρων υπερήχων όπως πλάτος, κύκλος / παλμός τρόπος, θερμοκρασία και όγκος δείγματος, μόλις αποδεδειγμένα πρωτόκολλα μπορούν να επαναληφθούν με το ίδιο αποτέλεσμα ξανά και ξανά.

Υπερήχων DNA και RNA κατακερματισμός

Μετά την κυτταρική λύση και την εκχύλιση πρωτεϊνών, ένα κοινό απαιτούμενο βήμα στην προετοιμασία του δείγματος είναι η διάτμηση και ο κατακερματισμός του DNA, του RNA και της χρωματίνης, π.χ. πριν από την ανοσοκατακρήμνιση της χρωματίνης (ChIP). Ο κατακερματισμός του DNA και του RNA μπορεί να επιτευχθεί αξιόπιστα με το σπάσιμο των ομοιοπολικών δεσμών που συγκρατούν το DNA μαζί με φυσικές δυνάμεις. Χρησιμοποιώντας φυσική διάτμηση όπως υπερήχηση, αρχικά οι κλώνοι DNA σπάνε, τότε το DNA κατακερματίζεται σε μικρότερα κομμάτια.
Ο κατακερματισμός DNA υπερήχων είναι αξιόπιστος και αποτελεσματικός στη διάτμηση του DNA σε στοχευμένο μήκος, π.χ. 500bp (ζεύγη βάσεων). Τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα του κατακερματισμού του DNA υπερήχων περιλαμβάνουν τον ακριβή έλεγχο των παραμέτρων και της έντασης της διαδικασίας υπερήχων. Οι παράμετροι της διαδικασίας υπερήχων μπορούν να ρυθμιστούν συντονίζοντας την ένταση υπερήχων, τους κύκλους και το χρόνο με ακρίβεια. Αυτό καθιστά δυνατή τη δημιουργία επιθυμητών μεγεθών DNA και το στοχευμένο μήκος DNA μπορεί να παραχθεί αξιόπιστα καθώς και να αναπαραχθεί. Υπερήχων διάτμηση DNA είναι επίσης ιδανικό για τη δημιουργία θραυσμάτων DNA υψηλού μοριακού βάρους.

Πρωτόκολλα για υπερηχητική λύση της Drosophila melanogaster

Παρακάτω μπορείτε να βρείτε διάφορα πρωτόκολλα για την υπερηχητικά υποβοηθούμενη λύση, την εκχύλιση πρωτεϊνών και τον κατακερματισμό DNA ή χρωματίνης των δειγμάτων Drosophila.

Υπερηχητική λύση για διασταυρούμενη ανοσοκατακρήμνιση (CLIP) Δοκιμασία

Η δοκιμασία CLIP πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως με ορισμένες τροποποιήσεις. Περίπου 20 mg ωοθηκών από θηλυκά άγριου τύπου ηλικίας 0 έως 1 ημέρας διασταυρώθηκαν με υπεριώδη ακτινοβολία (3 × 2000 μJ/cm2), ομογενοποιήθηκαν σε πάγο σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM σακχαρόζη, 1 mM DTT, 1× χωρίς EDTA πλήρεις αναστολείς πρωτεάσης, 1 mM PMSF) συμπληρώθηκαν με 300 U RNAseOUT και τοποθετήθηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Το ομογενοποιημένο ήταν υπερήχων στον πάγο, σε ισχύ 80%, πέντε φορές σε ριπές 20 s με ανάπαυση 60 s μεταξύ χρησιμοποιώντας τον επεξεργαστή υπερήχων Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) και φυγοκεντρείται (16000 × g για 5 λεπτά στους 4°C). Το διαλυτό εκχύλισμα καθαρίστηκε εκ των προτέρων με 20 μl δυναμοσφαιριδίων πρωτεΐνης-G για 20 λεπτά στους 4°C. Μετά την απομάκρυνση των δειγμάτων για ανοσοκαθήλωση και ποσοτικοποίηση της εισόδου RNA (1%), η HP1 καταβυθίστηκε ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα αντι-HP1 9A9 από 450 μl προκαθαρισμένου εκχυλίσματος με επώαση επί 4 ώρες με δυναμοσφαιρίδια πρωτεΐνης-G 50 μl. Τα ανοσοιζήματα πλύθηκαν 4 φορές με RCB. Για την έκλουση των ανοσοκατακρημνισμένων RNA, οι σφαιροποιημένες χάντρες βράστηκαν σε 100 μL νερού επεξεργασμένου με UltraPure DEPC για 5 λεπτά. 900 μL αντιδραστηρίου Qiazol προστέθηκαν στο υπερκείμενο υγρό που ανακτήθηκε για την παρασκευή RNA. Το RNA που καθαρίστηκε χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για τη σύνθεση cDNA χρησιμοποιώντας oligo dT, τυχαία εξαμερή και αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript III σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.
(Cassale et al. 2019)

Υπερήχων λύση για δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης

Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Menet με μικρές τροποποιήσεις. Περίπου 20 mg ωοθηκών από θηλυκά άγριου τύπου ηλικίας 0 έως 1 ημέρας ομογενοποιήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος NEB (10 mM HEPES-Na σε pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na σε pH 8, 0,5 mM EDTA-Na σε pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM σπερμιδίνη, 0,15 mM σπερμίνη, 1× πλήρεις αναστολείς πρωτεάσης χωρίς EDTA) με ομογενοποιητή / διασκορπιστή εμβάπτισης 1 λεπτό (στις 3000 rpm). Το ομογενοποιημένο μεταφέρθηκε σε μια προψυγμένη γυάλινη αναπήδηση και εφαρμόστηκαν 15 πλήρεις κινήσεις με ένα σφιχτό γουδοχέρι. Οι ελεύθεροι πυρήνες στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 6000xg για 10 λεπτά στους 4°C. Τα σφαιρίδια που περιέχουν πυρήνες επαναιωρήθηκαν σε 1 ml NEB και φυγοκεντρήθηκαν στα 20000 × g επί 20 λεπτά σε βαθμίδα σακχαρόζης (0,65 mL 1,6 M σακχαρόζης σε NEB, 0,35 mL 0,8 M σακχαρόζης σε NEB). Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 1 mL NEB και φορμαλδεΰδης σε τελική συγκέντρωση 1%. Οι πυρήνες διασυνδέθηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και σβήστηκαν προσθέτοντας 1/10 vol 1.375 M γλυκίνης. Οι πυρήνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 6000 × g για 5 λεπτά. Οι πυρήνες πλύθηκαν δύο φορές σε 1 mL NEB και επαναιωρήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (15 mM HEPES-Na σε pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA σε pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine και 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Πυρήνες ήταν υπερήχων χρησιμοποιώντας ένα Hielscher υπερήχων επεξεργαστή UP100H (100 W, 30 kHz) έξι φορές για 20 δευτερόλεπτα και 1 λεπτό στον πάγο. Οι πυρήνες με υπερήχους φυγοκεντρήθηκαν στα 13000 × g για 4 λεπτά στους 4°C. Η πλειοψηφία της υπερήχων χρωματίνης είχε μήκος 500 έως 1000 ζεύγη βάσεων (bp). Για κάθε ανοσοκατακρήμνιση, επωάστηκαν 15 μg χρωματίνης παρουσία 10 μg μονοκλωνικού αντισώματος HP1 9A9 (3 ώρες στους 4°C σε περιστρεφόμενο τροχό). Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 μl πρωτεΐνης G δυναβιδίων και η επώαση συνεχίστηκε κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C. Τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν και τα δείγματα πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (έκαστο διάλυμα 15 λεπτά στους 4 °C) και δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl σε pH 8). Η χρωματίνη εκλούστηκε από χάντρες σε δύο στάδια. πρώτα σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl σε pH 8) στους 65°C επί 15 λεπτά, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση και ανάκτηση του υπερκείμενου υγρού. Το υλικό των σφαιριδίων επανεκχυλίστηκε σε 100 μl TE + 0,67% SDS. Το συνδυασμένο έκλουσμα (200 μl) επωάστηκε κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 65°C για να αντιστραφεί η διασταύρωση και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μg/ml RNaseA για 15 λεπτά στους 65°C και με 500 μg/ml πρωτεϊνάσης Κ για 3 ώρες στους 65°C. Τα δείγματα εκχυλίστηκαν φαινόλη-χλωροφόρμιο και καθίζησε αιθανόλη. Το DNA επαναιωρήθηκε σε 25 μl νερού. Για τη μεγιστοποίηση των μοριακών αναλύσεων με ανοσοκατακρήμνιση DNA, τα υποψήφια γονίδια ενισχύθηκαν σε ζεύγη μέσω ενός βελτιστοποιημένου πρωτοκόλλου διπλής όψης PCR χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά σύνολα εκκινητών που είχαν παρόμοιες θερμοκρασίες τήξης σε μία μόνο αντίδραση.
(Casale et al. 2019)
 

Υψηλής απόδοσης υπερηχητικοί διαταράκτες κυττάρων για βιολογικά δείγματα

Hielscher Υπέρηχοι είναι ο μακροχρόνιος συνεργάτης σας όταν πρόκειται για υπερήχους υψηλής απόδοσης για κυτταρική διαταραχή, λύση, εκχύλιση πρωτεϊνών, DNA, RNA, και κατακερματισμός χρωματίνης, καθώς και άλλα προ-αναλυτικά βήματα προετοιμασίας δείγματος. Προσφέροντας ένα ολοκληρωμένο χαρτοφυλάκιο ομογενοποιητών εργαστηρίου υπερήχων και μονάδων προετοιμασίας δειγμάτων, Hielscher έχει την ιδανική συσκευή υπερήχων για τη βιολογική εφαρμογή και τις απαιτήσεις σας.
Κλασικό υπερήχων τύπου καθετήρα με μικρο-άκρη, όπως το UP200St (200W; δείτε την εικόνα αριστερά) ή μία από τις μονάδες προετοιμασίας δειγμάτων υπερήχων VialTweeter ή UP200ST_TD_CupHorn με VialHolder είναι αγαπημένα μοντέλα σε ερευνητικά και αναλυτικά εργαστήρια. Ο κλασικός υπερηχητικός καθετήρας είναι ιδανικός, όταν προετοιμάζει λιγότερα δείγματα πρέπει να λυθούν, να εξαχθούν ή να κατακερματιστούν. Οι μονάδες προετοιμασίας δειγμάτων VialTweeter και UP200St_TD_CupHorn επιτρέπουν την ταυτόχρονη υπερήχηση έως και 10 ή 5 φιαλιδίων, αντίστοιχα.
Εάν πρέπει να υποβληθούν σε επεξεργασία μεγάλοι αριθμοί δειγμάτων (π.χ. πλάκες 96 κοιλοτήτων, τρυβλία μικροτιτλοδότησης κ.λπ.), η UIP400MTP είναι η ιδανική ρύθμιση υπερήχων. Το UIP400MTP λειτουργεί σαν ένα μεγαλύτερο cuphorn, το οποίο είναι γεμάτο με νερό και έχει αρκετό χώρο για να κρατήσει πλάκες μικρο-φρεατίων. Τροφοδοτείται από έναν ισχυρό επεξεργαστή υπερήχων 400 watt, το UIP400MTP παρέχει μια πολύ ομοιόμορφη και έντονη υπερήχηση των πλακών πολλαπλών φρεατίων, προκειμένου να διαταράξει τα κύτταρα, να λύσει δείγματα, διαλυτοποίηση σφαιρίδια, εκχύλισμα πρωτεϊνών ή διάτμηση DNA.

Ακριβής έλεγχος μέσω έξυπνου λογισμικού

Όλες οι λύσεις υπερήχων Hielscher από 200 watt και πάνω είναι εξοπλισμένες με ψηφιακή έγχρωμη οθόνη αφής και έξυπνο λογισμικό. Μέσω του έξυπνου πρωτοκόλλου δεδομένων, όλες οι παράμετροι διαδικασίας υπερήχων αποθηκεύονται αυτόματα ως αρχείο CSV σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD μόλις ξεκινήσει ο υπερηχητικός. Αυτό κάνει την έρευνα και την πρωτοκόλληση πολύ πιο βολική. Μετά τις δοκιμές υπερήχων ή την προετοιμασία δείγματος, μπορείτε απλά να αναθεωρήσετε τις παραμέτρους υπερήχων κάθε υπερήχων τρέχει και να τις συγκρίνετε.
Μέσω του διαισθητικού μενού, πολλές παράμετροι μπορούν να προρυθμιστούν πριν από την υπερήχηση: Για παράδειγμα, για τον έλεγχο της θερμοκρασίας στο δείγμα και για την πρόληψη της θερμικής υποβάθμισής του, μπορεί να οριστεί ένα ανώτατο όριο θερμοκρασίας δείγματος. Ένας pluggable αισθητήρας θερμοκρασίας, ο οποίος έρχεται με τη μονάδα υπερήχων, δίνει την ανατροφοδότηση του επεξεργαστή υπερήχων σχετικά με την πραγματική θερμοκρασία υπερήχων. Όταν επιτευχθεί το ανώτατο όριο θερμοκρασίας, η συσκευή υπερήχων σταματά μέχρι να επιτευχθεί το κατώτερο όριο του συνόλου ∆T και αρχίζει στη συνέχεια αυτόματα υπερήχων και πάλι.
Εάν απαιτείται υπερήχηση με συγκεκριμένη εισροή ενέργειας, μπορείτε να προκαθορίσετε την τελική υπερηχητική ενέργεια της διαδρομής υπερήχων. Φυσικά, υπερήχων παλμός και λειτουργία κύκλου μπορεί να ρυθμιστεί μεμονωμένα, πάρα πολύ.
Για να επαναχρησιμοποιήσετε τις πιο επιτυχημένες παραμέτρους υπερήχων σας, μπορείτε να αποθηκεύσετε διάφορους τρόπους υπερήχων (π.χ. χρόνος υπερήχων, ένταση, λειτουργία κύκλου κ.λπ.) ως προκαθορισμένες λειτουργίες, έτσι ώστε να μπορούν να ξεκινήσουν εύκολα και γρήγορα ξανά.
Για μεγαλύτερη λειτουργική ευκολία, όλες οι ψηφιακές μονάδες υπερήχων μπορούν να λειτουργήσουν μέσω τηλεχειριστηρίου προγράμματος περιήγησης σε οποιοδήποτε κοινό πρόγραμμα περιήγησης (π.χ. InternetExplorer, Safari, Chrome κ.λπ.). Η σύνδεση LAN είναι μια απλή εγκατάσταση plug-n-play και δεν απαιτεί πρόσθετη εγκατάσταση λογισμικού.
Εμείς στο Hielscher γνωρίζουμε ότι η επιτυχής υπερήχηση των βιολογικών δειγμάτων απαιτεί ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Ως εκ τούτου, σχεδιάσαμε τους υπερήχους μας ως έξυπνες συσκευές με όλα τα χαρακτηριστικά που επιτρέπουν μια αποτελεσματική, αξιόπιστη, αναπαραγώγιμη και βολική προετοιμασία δείγματος.

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερηχητικών συστημάτων μας από υπερηχητικές μικρο-άκρες και κλασικούς ομογενοποιητές υπερήχων σε υπερήχους MultiSample για την βολική, αξιόπιστη προετοιμασία πολλών δειγμάτων: