Λύση δειγμάτων Drosophila Melanogaster με υπερήχους

Η Drosophila melanogaster χρησιμοποιείται ευρέως στα εργαστήρια ως οργανισμός μοντέλο. Ως εκ τούτου, πρέπει να εκτελούνται συχνά βήματα προαναλυτικής προετοιμασίας, όπως η λύση, η κυτταρική διάρρηξη, η εκχύλιση πρωτεϊνών και η διάτμηση του DNA δειγμάτων Drosophila melanogaster. Οι διασπαστές υπερήχων είναι αξιόπιστοι και αποδοτικοί και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εύκολη εκτέλεση διαφόρων εργασιών, όπως η λύση, η εκχύλιση πρωτεϊνών ή ο κατακερματισμός του DNA, μόνο με τη ρύθμιση των παραμέτρων της διεργασίας υπερήχων. Οι ομογενοποιητές υπερήχων αποτελούν επομένως ευέλικτα εργαλεία με ευρύ φάσμα εφαρμογών.

Λύση και εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους

Η λύση, η διαλυτοποίηση κυττάρων, η ομογενοποίηση ιστών και η εκχύλιση πρωτεϊνών αποτελούν τυπικές εργασίες για τους διασπαστές υπερήχων στα βιολογικά εργαστήρια. Οι διασπαστές υπερήχων και οι συσκευές κυτταρικής διάρρηξης είναι κατάλληλοι για την ομογενοποίηση ζωικών ιστών, εντόμων (π.χ. Drosophila melanogaster, C. elegans) ή φυτικών δειγμάτων. Περαιτέρω εφαρμογές της κατεργασίας με υπερήχους είναι η λύση κυτταρικών εναιωρημάτων και ιζημάτων, καθώς και η εκχύλιση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών.
Η λύση και η εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους είναι εξαιρετικά αξιόπιστες και αναπαραγώγιμες διεργασίες, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν βάσει καθιερωμένων πρωτοκόλλων. Καθώς η ένταση της διεργασίας υπερήχων μπορεί να ρυθμιστεί με ακρίβεια μέσω παραμέτρων της κατεργασίας με υπερήχους, όπως το πλάτος, η κυκλική / παλμική λειτουργία, η θερμοκρασία και ο όγκος του δείγματος, τα πρωτόκολλα, αφού αποδειχθεί η αποτελεσματικότητά τους, μπορούν να επαναλαμβάνονται με το ίδιο αποτέλεσμα κάθε φορά.

Κατακερματισμός DNA και RNA με υπερήχους

Μετά την κυτταρική λύση και την εκχύλιση πρωτεϊνών, ένα συνηθισμένο απαιτούμενο βήμα στην προετοιμασία δειγμάτων είναι η διάτμηση και ο κατακερματισμός του DNA, του RNA και της χρωματίνης, π.χ. πριν από την ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP). Ο κατακερματισμός του DNA και του RNA μπορεί να επιτευχθεί αξιόπιστα μέσω της διάσπασης, με φυσικές δυνάμεις, των ομοιοπολικών δεσμών που συγκρατούν το DNA. Με τη χρήση φυσικής διάτμησης, όπως η κατεργασία με υπερήχους, αρχικά διασπώνται οι αλυσίδες του DNA και στη συνέχεια το DNA κατακερματίζεται σε μικρότερα τμήματα.
Ο κατακερματισμός του DNA με υπερήχους είναι αξιόπιστος και αποδοτικός για τη διάτμηση του DNA σε ένα επιθυμητό μήκος, π.χ. 500bp (ζεύγη βάσεων). Στα κύρια πλεονεκτήματα του κατακερματισμού του DNA με υπερήχους περιλαμβάνεται ο ακριβής έλεγχος των παραμέτρων και της έντασης της διεργασίας υπερήχων. Οι παράμετροι της διεργασίας υπερήχων μπορούν να προσαρμοστούν με την ακριβή ρύθμιση της έντασης, των κύκλων και του χρόνου κατεργασίας με υπερήχους. Αυτό καθιστά δυνατή τη δημιουργία των επιθυμητών μεγεθών DNA, ενώ το επιδιωκόμενο μήκος DNA μπορεί να παραχθεί και να αναπαραχθεί αξιόπιστα. Η διάτμηση του DNA με υπερήχους είναι επίσης ιδανική για τη δημιουργία θραυσμάτων DNA υψηλού μοριακού βάρους.

Πρωτόκολλα για τη λύση της Drosophila melanogaster με υπερήχους

Παρακάτω μπορείτε να βρείτε διάφορα πρωτόκολλα για τη λύση, την εκχύλιση πρωτεϊνών και τον κατακερματισμό DNA ή χρωματίνης δειγμάτων Drosophila με υποβοήθηση υπερήχων.

Λύση με υπερήχους για τη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης με διασταυρούμενη σύνδεση (CLIP)

Η δοκιμασία CLIP εκτελέστηκε όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως, με ορισμένες τροποποιήσεις. Περίπου 20 mg ωοθηκών από θηλυκά άτομα άγριου τύπου ηλικίας 0 έως 1 ημέρας υποβλήθηκαν σε διασταυρούμενη σύνδεση με UV (3 × 2000 μJ/cm2), ομογενοποιήθηκαν επί πάγου σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM σακχαρόζη, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors χωρίς EDTA, 1 mM PMSF) εμπλουτισμένου με 300 U RNAseOUT και τοποθετήθηκαν επί πάγου για 30 min. Το ομογενοποίημα υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους επί πάγου, στο 80% της ισχύος, πέντε φορές με παλμούς διάρκειας 20 s και διάλειμμα 60 s μεταξύ τους, χρησιμοποιώντας τον επεξεργαστή υπερήχων Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) και φυγοκεντρήθηκε (16.000 × g για 5 min στους 4°C). Το διαλυτό εκχύλισμα υποβλήθηκε σε προκαταρκτικό καθαρισμό με 20 μl Protein-G dynabeads για 20 min στους 4°C. Μετά την αφαίρεση δειγμάτων για ανοσοαποτύπωση και ποσοτικό προσδιορισμό του RNA εισόδου (1%), η HP1 ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα anti-HP1 9A9 από 450 μl προκαθαρισμένου εκχυλίσματος με επώαση για 4 h με 50 μl Protein-G dynabeads. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν 4 φορές με RCB. Για την έκλουση των ανοσοκατακρημνισμένων RNA, τα σφαιρίδια που είχαν κατακαθίσει βράστηκαν σε 100 μL UltraPure DEPC-treated Water για 5 min. Στο υπερκείμενο που ανακτήθηκε για την παρασκευή RNA προστέθηκαν 900 μL Qiazol Reagent. Το καθαρισμένο RNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για τη σύνθεση cDNA με χρήση oligo dT, τυχαίων εξαμερών και αντίστροφης μεταγραφάσης SuperScript III, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.
(Cassale et al. 2019)

Λύση με υπερήχους για τη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης

Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Menet, με μικρές τροποποιήσεις. Περίπου 20 mg ωοθηκών από θηλυκά άτομα άγριου τύπου ηλικίας 0–1 ημέρας ομογενοποιήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος NEB (10 mM HEPES-Na σε pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na σε pH 8, 0,5 mM EDTA-Na σε pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM σπερμιδίνης, 0,15 mM σπερμίνης, 1× Complete Protease Inhibitors χωρίς EDTA) με ομογενοποιητή / διασπορέα εμβάπτισης για 1 min (στις 3000 rpm). Το ομογενοποίημα μεταφέρθηκε σε προψυγμένο γυάλινο ομογενοποιητή Dounce και εφαρμόστηκαν 15 πλήρεις διαδρομές με γουδοχέρι στενής εφαρμογής. Στη συνέχεια, οι ελεύθεροι πυρήνες φυγοκεντρήθηκαν στα 6000xg για 10 min στους 4°C. Τα ιζήματα που περιείχαν πυρήνες επαναιωρήθηκαν σε 1 mL NEB και φυγοκεντρήθηκαν στα 20.000 × g για 20 min σε βαθμίδωση σακχαρόζης (0,65 mL σακχαρόζης 1,6 M σε NEB, 0,35 mL σακχαρόζης 0,8 M σε NEB). Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1 mL NEB με φορμαλδεΰδη σε τελική συγκέντρωση 1%. Οι πυρήνες υποβλήθηκαν σε διασταυρούμενη σύνδεση για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου και η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 1/10 του όγκου γλυκίνης 1,375 M. Οι πυρήνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 6000 × g για 5 min. Οι πυρήνες πλύθηκαν δύο φορές σε 1 mL NEB και επαναιωρήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (15 mM HEPES-Na σε pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA σε pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% δεοξυχολικού νατρίου, 0,1% SDS, 0,5% N-λαυροϋλοσαρκοσίνης και 1× Complete Protease Inhibitors χωρίς EDTA). Οι πυρήνες υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιώντας έναν επεξεργαστή υπερήχων Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) έξι φορές, με 20 s λειτουργίας και 1 min σε πάγο. Οι πυρήνες που είχαν υποβληθεί σε κατεργασία με υπερήχους φυγοκεντρήθηκαν στα 13.000 × g για 4 min στους 4°C. Το μεγαλύτερο μέρος της χρωματίνης που είχε υποβληθεί σε κατεργασία με υπερήχους είχε μήκος 500 έως 1000 ζευγών βάσεων (bp). Για κάθε ανοσοκατακρήμνιση, 15 μg χρωματίνης επωάστηκαν παρουσία 10 μg μονοκλωνικού αντισώματος HP1 9A9 (3 h στους 4°C σε περιστρεφόμενο τροχό). Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 μl dynabeads protein G και η επώαση συνεχίστηκε κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C. Τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν και τα δείγματα πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (κάθε πλύση για 15 min στους 4 °C) και δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl σε pH 8). Η χρωματίνη εκλούστηκε από τα σφαιρίδια σε δύο στάδια· πρώτα σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl σε pH 8) στους 65°C για 15 min και ακολούθησαν φυγοκέντρηση και ανάκτηση του υπερκειμένου. Το υλικό των σφαιριδίων εκχυλίστηκε εκ νέου σε 100 μl TE + 0,67% SDS. Το συνδυασμένο έκλουσμα (200 μl) επωάστηκε κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 65°C για την αναστροφή των διασταυρούμενων συνδέσεων και υποβλήθηκε σε κατεργασία με 50 μg/ml RNaseA για 15 min στους 65°C και με 500 μg/ml πρωτεϊνάσης K για 3 h στους 65°C. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε εκχύλιση με φαινόλη–χλωροφόρμιο και κατακρήμνιση με αιθανόλη. Το DNA επαναιωρήθηκε σε 25 μl νερού. Για τη μεγιστοποίηση των μοριακών αναλύσεων με το ανοσοκατακρημνισμένο DNA, τα υποψήφια γονίδια ενισχύθηκαν ανά ζεύγη μέσω ενός βελτιστοποιημένου πρωτοκόλλου duplex-PCR, με χρήση δύο διαφορετικών συνόλων εκκινητών με παρόμοιες θερμοκρασίες τήξης σε μία μόνο αντίδραση.
(Casale et al. 2019)
 

Συσκευές κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους υψηλής απόδοσης για βιολογικά δείγματα

Η Hielscher Ultrasonics είναι ο συνεργάτης σας με πολυετή εμπειρία στις συσκευές υπερήχων υψηλής απόδοσης για κυτταρική διάρρηξη, λύση, εκχύλιση πρωτεϊνών, κατακερματισμό DNA, RNA και χρωματίνης, καθώς και για άλλα στάδια προαναλυτικής προετοιμασίας δειγμάτων. Προσφέροντας μια ολοκληρωμένη γκάμα εργαστηριακών ομογενοποιητών υπερήχων και μονάδων προετοιμασίας δειγμάτων, η Hielscher διαθέτει την ιδανική συσκευή υπερήχων για τη βιολογική εφαρμογή και τις απαιτήσεις σας.
Οι κλασικές συσκευές υπερήχων τύπου καθετήρα με μικροακίδα, όπως το UP200St (200W· δείτε την εικόνα αριστερά), ή μία από τις μονάδες προετοιμασίας δειγμάτων με υπερήχους VialTweeter ή UP200ST_TD_CupHorn με VialHolder αποτελούν δημοφιλή μοντέλα σε ερευνητικά και αναλυτικά εργαστήρια. Ο κλασικός καθετήρας υπερήχων είναι ιδανικός όταν πρέπει να υποβληθούν σε λύση, εκχύλιση ή κατακερματισμό λιγότερα δείγματα. Οι μονάδες προετοιμασίας δειγμάτων VialTweeter και UP200St_TD_CupHorn επιτρέπουν την ταυτόχρονη κατεργασία με υπερήχους έως και 10 ή 5 φιαλιδίων, αντίστοιχα.
Εάν πρέπει να υποβληθεί σε επεξεργασία μεγάλος αριθμός δειγμάτων (π.χ. πλάκες 96 βοθρίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης κ.λπ.), το UIP400MTP είναι η ιδανική διάταξη κατεργασίας με υπερήχους. Το UIP400MTP λειτουργεί σαν ένα μεγαλύτερο ηχοτρόδιο τύπου κυπέλλου, το οποίο γεμίζει με νερό και διαθέτει αρκετό χώρο για την τοποθέτηση πλακών μικροβοθρίων. Με την ισχύ ενός ισχυρού επεξεργαστή υπερήχων 400 watt, το UIP400MTP παρέχει πολύ ομοιόμορφη και έντονη κατεργασία πλακών πολλαπλών βοθρίων με υπερήχους για κυτταρική διάρρηξη, λύση δειγμάτων, διαλυτοποίηση ιζημάτων, εκχύλιση πρωτεϊνών ή διάτμηση DNA.

Ακριβής έλεγχος μέσω έξυπνου λογισμικού

Όλες οι λύσεις κατεργασίας με υπερήχους της Hielscher από 200 watt και άνω διαθέτουν ψηφιακή έγχρωμη οθόνη αφής και έξυπνο λογισμικό. Μέσω της έξυπνης καταγραφής δεδομένων, όλες οι παράμετροι της διεργασίας υπερήχων αποθηκεύονται αυτόματα ως αρχείο CSV σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD μόλις τεθεί σε λειτουργία η συσκευή υπερήχων. Αυτό καθιστά την έρευνα και την καταγραφή πολύ πιο εύχρηστες. Μετά τις δοκιμές κατεργασίας με υπερήχους ή την προετοιμασία δειγμάτων, μπορείτε εύκολα να εξετάσετε τις παραμέτρους κάθε κύκλου κατεργασίας με υπερήχους και να τις συγκρίνετε.
Μέσω του εύχρηστου μενού, μπορούν να προκαθοριστούν πολλές παράμετροι πριν από την κατεργασία με υπερήχους: Για παράδειγμα, για τον έλεγχο της θερμοκρασίας στο δείγμα και την αποτροπή της θερμικής του υποβάθμισης, μπορεί να οριστεί ένα ανώτατο όριο θερμοκρασίας του δείγματος. Ένας συνδεόμενος αισθητήρας θερμοκρασίας, ο οποίος παρέχεται μαζί με τη μονάδα υπερήχων, τροφοδοτεί τον επεξεργαστή υπερήχων με πληροφορίες για την πραγματική θερμοκρασία κατεργασίας με υπερήχους. Όταν επιτευχθεί το ανώτατο όριο θερμοκρασίας, η συσκευή υπερήχων διακόπτει προσωρινά τη λειτουργία της έως ότου επιτευχθεί το κατώτατο όριο του καθορισμένου ∆T και στη συνέχεια ξεκινά αυτόματα ξανά την κατεργασία με υπερήχους.
Εάν απαιτείται κατεργασία με υπερήχους με συγκεκριμένη εισροή ενέργειας, μπορείτε να προκαθορίσετε την τελική ενέργεια υπερήχων του κύκλου κατεργασίας. Φυσικά, η παλμική λειτουργία υπερήχων και η κυκλική λειτουργία μπορούν επίσης να ρυθμιστούν ανεξάρτητα.
Για να επαναχρησιμοποιήσετε τις πιο επιτυχημένες παραμέτρους κατεργασίας με υπερήχους, μπορείτε να αποθηκεύσετε διάφορους τρόπους κατεργασίας με υπερήχους (π.χ. χρόνο κατεργασίας με υπερήχους, ένταση, κυκλική λειτουργία κ.λπ.) ως προκαθορισμένες λειτουργίες, ώστε να μπορούν να ενεργοποιηθούν ξανά εύκολα και γρήγορα.
Για μεγαλύτερη ευκολία χειρισμού, όλες οι ψηφιακές μονάδες υπερήχων μπορούν να λειτουργούν μέσω απομακρυσμένου ελέγχου από οποιοδήποτε κοινό πρόγραμμα περιήγησης (π.χ. InternetExplorer, Safari, Chrome κ.λπ.). Η σύνδεση LAN ρυθμίζεται απλά με σύνδεση και άμεση λειτουργία και δεν απαιτεί εγκατάσταση πρόσθετου λογισμικού.
Στη Hielscher γνωρίζουμε ότι η επιτυχής κατεργασία βιολογικών δειγμάτων με υπερήχους απαιτεί ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Γι’ αυτό σχεδιάσαμε τις συσκευές υπερήχων μας ως έξυπνες συσκευές με όλες τις λειτουργίες που επιτρέπουν την αποτελεσματική, αξιόπιστη, αναπαραγώγιμη και εύχρηστη προετοιμασία δειγμάτων.

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συστημάτων υπερήχων μας, από μικροακίδες υπερήχων και κλασικούς ομογενοποιητές υπερήχων έως συσκευές υπερήχων MultiSample για την εύχρηστη, αξιόπιστη προετοιμασία πολλών δειγμάτων: