Υπερηχητική λύση του E. Coli

Τα βακτήρια E. coli είναι τα βακτήρια που χρησιμοποιούνται συχνότερα στη μικροβιολογία και τη βιοτεχνολογία.
Οι υπερηχητικές συσκευές διάσπασης κυττάρων παρέχουν αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα για τη λύση του E. coli.
Η έντονη αλλά με ακρίβεια ελεγχόμενη σπηλαίωση και οι διατμητικές δυνάμεις οδηγούν σε πλήρη διάσπαση και υψηλές αποδόσεις εκχύλισης (π.χ. πρωτεϊνών, DNA).

Γιατί η υπερηχητική διάσπαση κυττάρων E. coli είναι η προτιμώμενη μέθοδος;

Οι υπερηχητικοί ομογενοποιητές ή οι υπερηχητικές συσκευές με καθετήρα προσφέρουν αρκετά πλεονεκτήματα για τη λύση του E. coli, καθώς οι έντονοι υπέρηχοι διασπούν αποτελεσματικά τα κυτταρικά τοιχώματα και τις μεμβράνες. Οι υπερηχητικές συσκευές με καθετήρα χρησιμοποιούνται ευρέως για τη λύση του E. coli για τους ακόλουθους λόγους:

Αποτελεσματική διάσπαση των κυτταρικών τοιχωμάτων: Το E. coli διαθέτει ένα ημιάκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα που αποτελείται από πεπτιδογλυκάνη, το οποίο μπορεί να είναι δύσκολο να διασπαστεί με παραδοσιακές μεθόδους λύσης. Μια υπερηχητική συσκευή με καθετήρα παράγει έντονα υπερηχητικά κύματα που δημιουργούν φυσαλίδες σπηλαίωσης στο υγρό που περιβάλλει τα κύτταρα. Όταν αυτές οι φυσαλίδες καταρρέουν, δημιουργούν πίδακες υγρού υψηλής ταχύτητας και κρουστικά κύματα που προκαλούν μηχανική διάσπαση των κυτταρικών τοιχωμάτων, απελευθερώνοντας αποτελεσματικά κυτταρικά συστατικά, όπως βιομόρια.

Ενισχυμένη διείσδυση: Τα υπερηχητικά κύματα που παράγονται από τον καθετήρα / το σονοτρόδιο μπορούν να διεισδύσουν βαθιά στο δείγμα, φτάνοντας σε μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων E. coli και υποβάλλοντάς τα σε ομοιόμορφη επεξεργασία. Αυτό συμβάλλει στη διασφάλιση πιο ομοιόμορφης λύσης σε ολόκληρο το δείγμα, με αποτέλεσμα υψηλότερη αποτελεσματικότητα διάσπασης κυττάρων.

Μειωμένος χρόνος επεξεργασίας: Η ενέργεια που παρέχεται από την υπερηχητική συσκευή με καθετήρα είναι ιδιαίτερα συγκεντρωμένη και εντοπισμένη, οδηγώντας σε ταχεία και αποτελεσματική κυτταρική λύση. Σε σύγκριση με άλλες μεθόδους, όπως η μηχανική διάσπαση με σφαιρίδια ή η ενζυμική λύση, η υπερήχηση μπορεί να επιτύχει λύση του E. coli μέσα σε λίγα λεπτά ή ακόμη και δευτερόλεπτα. Ενώ πολλές εναλλακτικές τεχνικές, όπως η κατάψυξη και απόψυξη, απαιτούν αρκετούς κύκλους επεξεργασίας, η υπερηχητική λύση ανοίγει τα κύτταρα σε ένα μόνο στάδιο της διαδικασίας.

Έλεγχος θερμοκρασίας: Οι υπερηχητικές συσκευές τελευταίας τεχνολογίας είναι εξοπλισμένες με αισθητήρες θερμοκρασίας και έξυπνο λογισμικό, το οποίο επιτρέπει τον καθορισμό μέγιστης θερμοκρασίας διεργασίας. Η υπερηχητική συσκευή διακόπτει αυτόματα τη λειτουργία της όταν επιτευχθεί το όριο θερμοκρασίας και ξεκινά τη διαδικασία υπερήχησης όταν επιτευχθεί μια καθορισμένη τιμή θερμοκρασίας. Η ψύξη των δειγμάτων σε λουτρό πάγου είναι μια απλή μέθοδος για τη διατήρηση χαμηλής θερμοκρασίας του δείγματος και την αποτροπή της υποβάθμισής του λόγω θερμότητας.

Δυνατότητα κλιμάκωσης: Οι υπερηχητικές συσκευές με καθετήρα διατίθενται σε διάφορα μεγέθη, από συσκευές χειρός έως βιομηχανικά μοντέλα μεγάλης κλίμακας. Αυτό τις καθιστά κατάλληλες για την επεξεργασία μικρών όγκων στο εργαστήριο ή για κλιμάκωση σε μεγαλύτερες εφαρμογές βιοεπεξεργασίας, π.χ. παραγωγή εμβολίων ή βιοσύνθεση μορίων.

Ευελιξία: Οι υπερηχητικές συσκευές μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορες εφαρμογές πέρα από την κυτταρική λύση, όπως ο κατακερματισμός DNA μέσω διάτμησης, η εκχύλιση πρωτεϊνών, η ομογενοποίηση ιστών, η διασπορά νανοσωματιδίων και η γαλακτωματοποίηση. Επομένως, η επένδυση σε μια υπερηχητική συσκευή με καθετήρα προσφέρει ευελιξία σε ερευνητικά ή βιομηχανικά περιβάλλοντα.

Οι συσκευές υπερήχων τύπου καθετήρα, όπως η UP200St, είναι αξιόπιστοι ομογενοποιητές ιστών και διασπαστές κυττάρων και, ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται ευρέως για την προετοιμασία δειγμάτων στη γενετική, π.χ. για τη λύση του E.coli

Η εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα E.coli πραγματοποιείται αποτελεσματικά με τον υπερηχητικό καθετήρα UP200St

Η υπερηχητική συσκευή με καθετήρα προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα για τη λύση του E. coli. Ο αξιόπιστος και ακριβής έλεγχος των παραμέτρων της υπερηχητικής διεργασίας επιτρέπει τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων λειτουργίας, όπως η ισχύς, η διάρκεια και ο χειρισμός του δείγματος, για την επίτευξη των επιθυμητών αποτελεσμάτων.

Αυτός ο οδηγός εξηγεί ποιος τύπος συσκευής υπερήχων είναι καταλληλότερος για τις εργασίες προετοιμασίας δειγμάτων σας, όπως η λύση, η κυτταρική διάρρηξη, η απομόνωση πρωτεϊνών και ο κατακερματισμός DNA και RNA σε εργαστήρια, στην ανάλυση και στην έρευνα. Επιλέξτε τον ιδανικό τύπο συσκευής υπερήχων για την εφαρμογή σας, τον όγκο και τον αριθμό των δειγμάτων και τον ρυθμό επεξεργασίας. Η Hielscher Ultrasonics διαθέτει τον ιδανικό ομογενοποιητή υπερήχων για εσάς!

Ο υπερηχητικός κατακερματισμός DNA χρησιμοποιείται συχνά ως στάδιο προετοιμασίας δειγμάτων στην αλληλούχηση νέας γενιάς (NGS)

Ηλεκτροφορητικές αναλύσεις γονιδιωματικού DNA του E. coli EDL933 που υποβλήθηκε σε υπερήχηση για 0 – 15 min. Το L υποδηλώνει τον δείκτη μοριακού μεγέθους DNA.
(μελέτη και εικόνα: ©Basselet et al. 2008)

Διάσπαση κυττάρων με χρήση υπερηχητικής σπηλαίωσης

Οι υπερηχητικοί ομογενοποιητές τύπου καθετήρα λειτουργούν με περίπου 20.000 κύκλους ανά δευτερόλεπτο (στα 20kHz) και προκαλούν σπηλαίωση σε υγρά ή εναιωρήματα. Η ακουστική σπηλαίωση δημιουργεί μικροσκοπικές περιοχές με πιέσεις παρόμοιες με εκείνες του κενού και υψηλές θερμοκρασίες, οι οποίες διαρρηγνύουν τα κύτταρα. Παρόλο που οι θερμοκρασίες μπορεί να φτάσουν αρκετές χιλιάδες βαθμούς Κελσίου, οι όγκοι σπηλαίωσης είναι τόσο μικροί ώστε δεν προκαλούν σημαντική θέρμανση κατά τη διεργασία. Η ακουστική σπηλαίωση και οι διατμητικές δυνάμεις που δημιουργούνται από τους υπερήχους διατρυπούν ή διαρρηγνύουν την κυτταρική μεμβράνη βακτηριακών κυττάρων όπως αυτά του E.coli. Οι συσκευές υπερήχων Hielscher επιτρέπουν τον ακριβή έλεγχο παραμέτρων της διεργασίας, όπως η ένταση των υπερήχων, το πλάτος ταλάντωσης, η εισροή ενέργειας και η θερμοκρασία. Έτσι, η διεργασία υπερηχητικής λύσης μπορεί να προσαρμοστεί βέλτιστα στον τύπο κυττάρου, στην κυτταροκαλλιέργεια και στον στόχο της διεργασίας.

Πλεονεκτήματα της υπερηχητικής λύσης

ακριβής έλεγχος της λύσης (ένταση, πλάτος ταλάντωσης, θερμοκρασία)
αξιόπιστα, αναπαραγώγιμα αποτελέσματα
βέλτιστη προσαρμογή σε συγκεκριμένα δείγματα
έλεγχος θερμοκρασίας
για δείγματα από πολύ μικρά έως πολύ μεγάλα (από µL έως λίτρα)
αμιγώς μηχανική επεξεργασία
φιλική προς τον χρήστη, ασφαλής λειτουργία
γραμμική κλιμάκωση από το εργαστήριο στην παραγωγή

Η συσκευή υπερήχων VialTweeter επιτρέπει την ταυτόχρονη προετοιμασία δειγμάτων σε έως και 10 φιαλίδια υπό τις ίδιες συνθήκες διεργασίας. (Κάντε κλικ για μεγέθυνση!)

VialTweeter για υπερηχητική λύση

Υπερηχητικός ομογενοποιητής έναντι άλλων τεχνικών λύσης

Ενώ η χημική και η ενζυμική λύση μπορεί να παρουσιάζουν προβλήματα – καθώς η χημική λύση μπορεί να αλλοιώσει τις πρωτεϊνικές δομές και να δημιουργήσει προβλήματα καθαρισμού, ενώ η ενζυμική λύση απαιτεί μεγάλους χρόνους επώασης και δεν είναι αναπαραγώγιμη – η διάσπαση με υπερήχους αποτελεί μια προηγμένη, ταχεία μέθοδο διάσπασης κυττάρων.
Η υπερηχητική λύση βασίζεται αποκλειστικά σε μηχανικές δυνάμεις. Δεν προστίθενται χημικές ουσίες· η υπερήχηση διαρρηγνύει το κυτταρικό τοίχωμα μέσω διατμητικών δυνάμεων. Η χημική λύση μπορεί να αλλοιώσει την πρωτεϊνική δομή και να δημιουργήσει προβλήματα καθαρισμού. Η ενζυμική διάσπαση απαιτεί μεγάλους χρόνους επώασης και δεν είναι αναπαραγώγιμη. Η υπερηχητική διάσπαση βακτηριακών κυττάρων E.coli είναι ταχεία, απλή, αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη. Γι’ αυτό οι συσκευές υπερήχων Hielscher χρησιμοποιούνται σε βιολογικά και βιοχημικά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο για την προετοιμασία δειγμάτων, προαναλυτικές διαδικασίες, διαγνωστικές εξετάσεις in vitro και ποικίλες δοκιμασίες.

Γενικές συστάσεις για την υπερηχητική λύση

Η υπερήχηση είναι η δημοφιλέστερη τεχνική για τη λύση πολύ μικρών, μεσαίων και μεγάλων ποσοτήτων κυτταρικών εναιωρημάτων – από πικολίτρα έως και 100L/hr (με χρήση υπερηχητικού κελιού ροής). Τα κύτταρα υφίστανται λύση μέσω διάτμησης στο υγρό και σπηλαίωσης. Το DNA επίσης κατακερματίζεται μέσω διάτμησης κατά την υπερήχηση, επομένως δεν είναι απαραίτητη η προσθήκη DNase στο κυτταρικό εναιώρημα.

Έλεγχος θερμοκρασίας κατά την υπερηχητική λύση του E.coli
Με την προψύξη του δείγματος και τη διατήρησή του σε πάγο κατά την υπερήχηση, μπορεί να αποτραπεί εύκολα η θερμική αποικοδόμηση του δείγματος.
Ιδανικά, τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται παγωμένα κατά τη λύση, αλλά για τα περισσότερα δείγματα αρκεί η θερμοκρασία να μην υπερβαίνει τη θερμοκρασία της καλλιέργειας ή του ιστού προέλευσης. Επομένως, συνιστάται η διατήρηση του εναιωρήματος σε πάγο και η υπερήχηση με αρκετούς σύντομους παλμούς υπερήχων διάρκειας 5–10 sec και παύσεις διάρκειας 10–30 sec. Κατά τις παύσεις, η θερμότητα μπορεί να απομακρυνθεί, ώστε να αποκατασταθεί χαμηλή θερμοκρασία. Για μεγαλύτερα κυτταρικά δείγματα διατίθενται διάφοροι αντιδραστήρες κελιού ροής με μανδύες ψύξης.
Διαβάστε εδώ αναλυτικές συμβουλές και συστάσεις για επιτυχή υπερηχητική λύση!

Πρωτόκολλα για την υπερηχητική παρασκευή προϊόντων λύσης του E. coli

Οι ερευνητές χρησιμοποιούν υπερηχητικούς ομογενοποιητές Hielscher για τη διάσπαση κυττάρων E.coli. Παρακάτω μπορείτε να βρείτε διάφορα δοκιμασμένα και αποδεδειγμένα πρωτόκολλα λύσης του E.coli με χρήση υπερηχητικών ομογενοποιητών Hielscher για ποικίλες εφαρμογές που σχετίζονται με το E. coli.

Κυτταρική ανάπτυξη, διασταυρούμενη σύνδεση και παρασκευή κυτταρικών εκχυλισμάτων E. coli με χρήση υπερήχων

Για το ChIP-Chip της SeqA και της RNA πολυμεράσης, το E. coli MG1655 ή MG1655 ΔseqA καλλιεργήθηκε στους 37°C μέχρι οπτική πυκνότητα OD₆₀₀ περίπου 0,15 σε 50 ml LB (+ 0,2% γλυκόζη), προτού προστεθούν 27 μl φορμαλδεΰδης (37%) ανά ml θρεπτικού μέσου (τελική συγκέντρωση 1%). Η διασταυρούμενη σύνδεση πραγματοποιήθηκε με αργή ανάδευση (100 rpm) σε θερμοκρασία δωματίου για 20 min και ακολούθησε διακοπή της αντίδρασης με 10 ml γλυκίνης 2,5 M (τελική συγκέντρωση 0,5 M). Για τα πειράματα θερμικού σοκ, το E. coli MG1655 καλλιεργήθηκε σε 65 ml θρεπτικού μέσου LB στους 30°C έως ότου επιτευχθεί OD₆₀₀ περίπου 0,3. Στη συνέχεια, 30 ml καλλιέργειας μεταφέρθηκαν σε προθερμασμένη φιάλη στους 43°C και η υπόλοιπη ποσότητα διατηρήθηκε στους 30°C. Η διασταυρούμενη σύνδεση και η διακοπή της αντίδρασης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, με τη διαφορά ότι τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 30 ή 43°C για 5 min πριν συνεχιστεί η αργή ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό TBS (pH7.5). Μετά την επαναιώρηση σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (10 mM Tris (pH 8,0), 20% σακχαρόζη, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml λυσοζύμη) και την επώαση στους 37°C για 30 min, ακολούθησε προσθήκη 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος IP και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπερήχηση πάνω σε πάγο, 12 φορές για 30 sec με διαλείμματα 30 sec, χρησιμοποιώντας τον υπερηχητικό επεξεργαστή Hielscher UP400St με ρύθμιση ισχύος 100%. Μετά από φυγοκέντρηση για 10 min στα 9000 g, κλάσματα των 800 μl από το υπερκείμενο αποθηκεύτηκαν στους -20°C. (Waldminghaus 2010)

Υπερπαραγωγή και καθαρισμός ενζύμων με υπερηχητικό καθετήρα

Για την υπερπαραγωγή πρωτεϊνών με ετικέτα δεκαϊστιδίνης (His10), το E. coli BL21(DE3) μετασχηματίστηκε με κατασκευές pET19b. Μια προκαλλιέργεια που είχε αναπτυχθεί κατά τη διάρκεια της νύχτας συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και το 1% χρησιμοποιήθηκε για τον ενοφθαλμισμό μιας καλλιέργειας έκφρασης. Τα κύτταρα που έφεραν το pET19mgtB καλλιεργήθηκαν στους 22°C έως ότου η οπτική πυκνότητα στα 600 nm (OD600) φτάσει το 0,7. Η καλλιέργεια μεταφέρθηκε στους 17°C και η έκφραση επάχθηκε με 100 μM IPTG. Μετά από 16 h, η καλλιέργεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 7.500 × g στους 4°C. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) 50 mM με 0,3 M NaCl σε pH 7,4 και διασπάστηκαν με υπερήχηση, χρησιμοποιώντας σονοτρόδιο μικροάκρου S2 στη συσκευή υπερήχων Hielscher UP200St, με κύκλο 0,5 και πλάτος 75%.
Η υπερπαραγωγή της GtfC με ετικέτα δεκαϊστιδίνης επάχθηκε στους 37°C σε OD₆₀₀ 0,6 με 100 μM IPTG. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 h, συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση όπως αναφέρεται παραπάνω για την MgtB.
Τα ακατέργαστα κυτταρικά εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 × g και στους 4°C για την καθίζηση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Τα διαυγασμένα εκχυλίσματα φορτώθηκαν σε στήλες HisTrap FF Crude του 1-ml χρησιμοποιώντας σύστημα ÄKTAprime Plus. Τα ένζυμα καθαρίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για βαθμιδωτή έκλουση πρωτεϊνών με ετικέτα His. Τα διαλύματα των εκλουσμένων πρωτεϊνών υποβλήθηκαν δύο φορές σε διαπίδυση έναντι 1.000 όγκων PBS 50 mM, pH 7,4, με 0,3 M NaCl στους 4°C. Ο καθαρισμός αναλύθηκε με SDS-PAGE 12%. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford χρησιμοποιώντας Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Υπερηχητική εκχύλιση πρωτεΐνης από βακτήρια E. coli
Μια πρωτεΐνη ενδιαφέροντος που χρησιμοποιείται ως δόλωμα (στην προκειμένη περίπτωση, η MTV1 του Arabidopsis thaliana) συντήκεται με μια ετικέτα GST και εκφράζεται σε κύτταρα Escherichia coli (E. coli) BL21.

Πάρτε από ένα ίζημα GST-MTV1 και GST (που αντιστοιχεί σε 50 ml βακτηριακής καλλιέργειας) και επαναιωρήστε το καθένα σε 2,5 mL παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης.
Χρησιμοποιήστε μια συσκευή υπερήχων UP100H (εξοπλισμένη με σονοτρόδιο μικροάκρου MS3 για μικρούς όγκους περίπου 2–5mL) για να διασπάσετε τα βακτηριακά κύτταρα μέχρι να υποστούν λύση, η οποία υποδεικνύεται από τη μειωμένη αδιαφάνεια και το αυξημένο ιξώδες. Αυτό πρέπει να πραγματοποιείται πάνω σε πάγο και συνιστάται υπερήχηση κατά διαστήματα (π.χ. υπερήχηση για 10 sec ακολουθούμενη από παύση 10 sec πάνω σε πάγο και ούτω καθεξής). Πρέπει να δίνεται προσοχή ώστε η υπερήχηση να μην πραγματοποιείται με υπερβολικά υψηλή ένταση. Εάν παρατηρηθεί αφρισμός ή σχηματισμός λευκού ιζήματος, η ένταση πρέπει να μειωθεί.
Μεταφέρετε το διάλυμα των βακτηρίων που έχουν υποστεί λύση σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης των 1,5 mL και φυγοκεντρήστε στους 4°C, στα 16.000 x g για 20 min.

Οι καθετήρες υπερήχων χρησιμοποιούν τις δυνάμεις της ακουστικής σπηλαίωσης για τη διάσπαση κυττάρων και την εκχύλιση μορίων και DNA από E.coli.

Οι συσκευές υπερήχων τύπου καθετήρα, όπως η UP400St, χρησιμοποιούν την αρχή λειτουργίας της ακουστικής σπηλαίωσης για την αποτελεσματική λύση του E.coli.

Ανάλυση έκφρασης και καθαρισμός ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με υπερήχηση

Το ίζημα E. coli υποβλήθηκε σε υπερήχηση με τη συσκευή υπερήχων UP100H της Hielscher. Για τον σκοπό αυτό, το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) και ψύχθηκε σε πάγο για 10 min. Στη συνέχεια, το κυτταρικό εναιώρημα υποβλήθηκε σε υπερήχηση με 10 σύντομους παλμούς διάρκειας 10 s, με διάστημα 30 s μετά από κάθε παλμό για ψύξη. Τέλος, τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με υπερφυγοκέντρηση στους 4°C για 15 min στις 14.000 rpm. Για την επιβεβαίωση της έκφρασης της rPR, το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12% και αναλύθηκε με SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωση Western. Ο καθαρισμός της rPR πραγματοποιήθηκε με ρητίνη Ni2+-NTA (Invitrogen, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε αυτό το στάδιο χρησιμοποιήθηκε μέθοδος καθαρισμού υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες. Η καθαρότητα της καθαρισμένης πρωτεΐνης αξιολογήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12% και επακόλουθη χρώση με κυανό του Coomassie. Η συγκέντρωση της καθαρισμένης πρωτεΐνης μετρήθηκε με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Αυτό το βίντεο παρουσιάζει το κυπελλοειδές ηχοτρόδιο υπερήχων ισχύος 200 βατ για διασπορά, ομογενοποίηση, εκχύλιση ή απαέρωση εργαστηριακών δειγμάτων.

Υπερηχητικοί ομογενοποιητές για τη λύση E. coli

Η Hielscher Ultrasonics σχεδιάζει, κατασκευάζει και προμηθεύει υπερηχητικούς ομογενοποιητές υψηλών επιδόσεων για την αξιόπιστη και αποτελεσματική λύση βακτηρίων E. coli και άλλων τύπων κυττάρων, ιστών και κυτταροκαλλιεργειών.
Η ευρεία γκάμα ανιχνευτών υπερήχων, καθώς και συστημάτων έμμεσης υπερήχησης, μας επιτρέπει να σας προσφέρουμε τον ιδανικό υπερηχητικό ομογενοποιητή ιστών για την εφαρμογή σας στη διάσπαση κυττάρων και την εκχύλιση.

Σχεδιασμός, κατασκευή και συμβουλευτική – Ποιότητα κατασκευής από τη Γερμανία

Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι γνωστές για τα υψηλότερα πρότυπα ποιότητας και σχεδιασμού τους. Το έξυπνο λογισμικό, το εύχρηστο μενού, οι προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις και η αυτόματη καταγραφή δεδομένων είναι μερικά μόνο από τα χαρακτηριστικά των συσκευών υπερήχων της Hielscher. Η ανθεκτικότητα και η ευκολία χειρισμού επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των συσκευών υπερήχων μας σε ερευνητικές και βιοτεχνολογικές εγκαταστάσεις. Ακόμη και οι αντίξοες συνθήκες και τα απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από τις συσκευές υπερήχων της Hielscher.

Η Hielscher Ultrasonics είναι εταιρεία πιστοποιημένη κατά ISO και δίνει ιδιαίτερη έμφαση σε συσκευές υπερήχων υψηλών επιδόσεων που διαθέτουν τεχνολογία αιχμής και ευκολία χρήσης. Φυσικά, οι συσκευές υπερήχων της Hielscher συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις CE και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συσκευών υπερήχων μας:

Όγκος παρτίδας	Παροχή	Συνιστώμενες συσκευές
πλάκες πολλαπλών βοθρίων / μικροτιτλοδότησης	n.a.	UIP400MTP
CupHorn για φιαλίδια ή ποτήρι ζέσεως	n.a.	Υπερηχητικό CupHorn
υπερηχητικός μικροαντιδραστήρας ροής	n.a.	GDmini2
έως 10 φιαλίδια με 0,5 έως 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 έως 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 έως 500mL	10 έως 200mL/min	UP100H
10 έως 2000mL	20 έως 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 έως 20L	0,2 έως 4L/min	UIP2000hdT
10 έως 100L	2 έως 10L/min	UIP4000
n.a.	10 έως 100L/min	UIP16000
n.a.	μεγαλύτερη	συστοιχία συσκευών UIP16000

Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!

Ζητήστε περισσότερες πληροφορίες

Χρησιμοποιήστε την παρακάτω φόρμα για να ζητήσετε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τους ομογενοποιητές ιστών και τις συσκευές διάρρηξης κυττάρων με υπερήχους, τις εφαρμογές λύσης και τις τιμές. Θα χαρούμε να συζητήσουμε μαζί σας τη διαδικασία σας και να σας προσφέρουμε έναν ομογενοποιητή υπερήχων που ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις σας!

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου (υποχρεωτική)

Αριθμός τηλεφώνου

Όνομα

Ενδιαφέρον

Το βίντεο παρουσιάζει το σύστημα προετοιμασίας δειγμάτων με υπερήχους UIP400MTP, το οποίο επιτρέπει την αξιόπιστη προετοιμασία δειγμάτων σε οποιεσδήποτε τυποποιημένες πλάκες πολλαπλών βοθρίων με χρήση υπερήχων υψηλής έντασης. Τυπικές εφαρμογές του UIP400MTP είναι η κυτταρική λύση, ο κατακερματισμός DNA, RNA και χρωματίνης, καθώς και η εκχύλιση πρωτεϊνών.

Πρόσθετα πρωτόκολλα για την υπερηχητική λύση E. coli

Πρωτεΐνες τροποποιημένες με αλλισίνη σε E. coli με χρήση υπερηχητικού VialTweeter

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε σουλφυδρυλομάδες με δοκιμασία 5,5′-διθειοδις(2-νιτροβενζοϊκού οξέος) (DTNB)
Μια ολονύκτια καλλιέργεια E. coli MG1655 χρησιμοποιήθηκε για τον ενοφθαλμισμό ελάχιστου θρεπτικού μέσου MOPS (1:100). Η καλλιέργεια αναπτύχθηκε αερόβια μέχρι να επιτευχθεί A600 0,4. Η καλλιέργεια χωρίστηκε σε τρεις καλλιέργειες των 15-ml για υποβολή σε καταπόνηση. Μια καλλιέργεια χωρίς επεξεργασία χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας. Στη μία από τις δύο υπόλοιπες καλλιέργειες προστέθηκε αλλισίνη 0,79 mM (128 μg ml-1) και στην άλλη διαμίδιο 1 mM. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 15 min. Από κάθε καλλιέργεια συλλέχθηκαν 5 ml με φυγοκέντρηση (8.525 × g, 4°C, 10 min). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, αποθηκευμένο υπό αναερόβιες συνθήκες πριν από τη χρήση) και φυγοκεντρήθηκαν (13.000 × g, 4°C, 10 min). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (PBS με 6 mM υδροχλωρικού γουανιδινίου, pH 7,4) πριν από τη διάσπασή τους στους 4°C με υπερήχηση (VialTweeter – συσκευή υπερήχησης, Hielscher GmbH, Γερμανία) (3 × 1 min). Τα κυτταρικά υπολείμματα κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε κυψελίδα QS-macro 3,5-ml (10 mm) με μαγνητική ράβδο ανάδευσης και αναμείχθηκε με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Η απορρόφηση των δειγμάτων παρακολουθήθηκε στα 412 nm με φασματοφωτόμετρο Jasco V-650 εξοπλισμένο με θερμοστατούμενη υποδοχή κυψελίδας PSC-718, σε θερμοκρασία δωματίου. Προστέθηκαν 100μl διαλύματος διθειοδις(2-νιτροβενζοϊκού οξέος) 3 mM. Η απορρόφηση παρακολουθήθηκε μέχρι να φτάσει σε κορεσμό. Η συγκέντρωση των θειολών υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον συντελεστή μοριακής απορρόφησης ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 για το θειο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ (TNB). Οι κυτταρικές συγκεντρώσεις θειολών υπολογίστηκαν με βάση όγκο κυττάρων E. coli 6,7 × 10^-15 λίτρων και κυτταρική πυκνότητα A600 = 0,5 (που ισοδυναμεί με 1 × 10⁸ κύτταρα ml^-1 καλλιέργειας). (Müller et al. 2016)

Προσδιορισμός γλουταθειόνης in vivo με χρήση υπερηχητικού διασπαστή κυττάρων

Το E.coli MG1655 καλλιεργήθηκε σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο MOPS σε συνολικό όγκο 200ml μέχρι να επιτευχθεί A600 0,5. Η καλλιέργεια χωρίστηκε σε καλλιέργειες των 50-ml για επεξεργασία πρόκλησης καταπόνησης. Μετά από 15 min επώασης με 0,79 mM αλισίνης, 1 mM διαμιδίου ή διμεθυλοσουλφοξειδίου (μάρτυρας), τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 4.000g στους 4°C για 10 min. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα KPE πριν από την επαναιώρηση των ιζημάτων σε 700µl ρυθμιστικού διαλύματος KPE. Για την αποπρωτεΐνωση, προστέθηκαν 300l σουλφοσαλικυλικού οξέος 10% (w/v) πριν από τη διάσπαση των κυττάρων με υπερήχηση (3 x 1 min· συσκευή υπερήχησης VialTweeter ). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση (30 min, 13.000g, 4°C). Οι συγκεντρώσεις σουλφοσαλικυλικού οξέος μειώθηκαν στο 1% με την προσθήκη 3 όγκων ρυθμιστικού διαλύματος KPE. Οι μετρήσεις ολικής γλουταθειόνης και GSSG πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι κυτταρικές συγκεντρώσεις γλουταθειόνης υπολογίστηκαν με βάση όγκο κυττάρων E. coli 6,7×10^-15 λίτρων και κυτταρική πυκνότητα A600 0,5 (που ισοδυναμεί με 1×10⁸ κύτταρα ml^-1 καλλιέργειας). Οι συγκεντρώσεις GSH υπολογίστηκαν με αφαίρεση του 2[GSSG] από την ολική γλουταθειόνη. (Müller et al. 2016)

Έκφραση ανθρώπινης mAspAT σε E. coli με χρήση υπερηχητικού ομογενοποιητή

Μία μεμονωμένη αποικία E. coli BL21 (DE3) που έφερε τον φορέα έκφρασης τοποθετήθηκε σε 30 mL θρεπτικού μέσου Luria-Bertani (LB) που περιείχε 100μg/mL αμπικιλλίνης και στη συνέχεια καλλιεργήθηκε στους 37ºC μέχρι η οπτική πυκνότητα (OD₆₀₀) να φτάσει το 0,6. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 4.000 × g για 10 min και επαναιωρήθηκαν σε 3L φρέσκου θρεπτικού μέσου LB που περιείχε 100μg/mL αμπικιλλίνης.
Στη συνέχεια, η πρωτεϊνική έκφραση επάχθηκε με 1 mM ισοπροπυλο-β-ᴅ-1-θειογαλακτοπυρανοσίδης (IPTG) για 20 h στους 16ºC. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 8.000 × g για 15 min και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Από καλλιέργεια 3 L ελήφθησαν περίπου 45g κυττάρων (υγρό βάρος). Μετά τη φυγοκέντρηση, τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 40 mL (για καλλιέργεια 1 L) παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης A και υποβλήθηκαν σε λύση με υπερήχηση σε θερμοκρασία πάγου, χρησιμοποιώντας τον υπερηχητικό διασπαστή κυττάρων Hielscher UP400St. Το κυτταρικό λύμα φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 15 min ώστε να διαχωριστούν τα διαλυτά (υπερκείμενο) και τα κατακρημνισμένα (ίζημα) κλάσματα. (Jiang et al. 2015)

Σχετικά θέματα

Χρήσιμες πληροφορίες

E.coli

Το Escherichia coli (E. coli) είναι ένα αρνητικό κατά Gram, προαιρετικά αναερόβιο, ραβδόμορφο, κολοβακτηριοειδές βακτήριο του γένους Escherichia, το οποίο απαντάται συνήθως στο κατώτερο τμήμα του εντέρου των θερμόαιμων οργανισμών (ενδόθερμων). Υπάρχει μεγάλος αριθμός στελεχών (ή υποτύπων) E. coli με ποικίλα χαρακτηριστικά. Τα περισσότερα στελέχη E. coli είναι αβλαβή για τον άνθρωπο, π.χ. τα στελέχη B και K-12, τα οποία χρησιμοποιούνται συνήθως για ερευνητικές εφαρμογές σε εργαστήρια. Ωστόσο, ορισμένα στελέχη είναι επιβλαβή και μπορούν να προκαλέσουν σοβαρή νόσο.
Το E. coli διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη σύγχρονη βιολογική μηχανική και τη βιομηχανική μικροβιολογία, καθώς είναι εύκολο να υποβληθεί σε χειρισμούς. Στις συνήθεις εργαστηριακές εφαρμογές που συχνά περιλαμβάνουν τη χρήση του E. coli συγκαταλέγονται, για παράδειγμα, η δημιουργία ανασυνδυασμένου δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) και η χρήση του ως οργανισμού μοντέλου.
Το E. coli είναι ένας εξαιρετικά ευέλικτος ξενιστής για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών και διατίθενται πολυάριθμα συστήματα έκφρασης πρωτεϊνών για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε E. coli. Με τη χρήση πλασμιδίων που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών, μπορούν να εισαχθούν γονίδια στα βακτήρια, γεγονός που επιτρέπει την παραγωγή αυτών των πρωτεϊνών σε μεγάλες ποσότητες σε βιομηχανικές διεργασίες ζύμωσης.
Τα E.coli χρησιμοποιούνται ως κυτταρικά εργοστάσια για την παραγωγή ινσουλίνης. Περαιτέρω εφαρμογές περιλαμβάνουν τη χρήση τροποποιημένων κυττάρων E. coli για την ανάπτυξη και παραγωγή εμβολίων και ακινητοποιημένων ενζύμων, την παραγωγή βιοκαυσίμων, καθώς και τη βιοαποκατάσταση.
Το στέλεχος K-12 είναι μια μεταλλαγμένη μορφή του E. coli που υπερεκφράζει το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση (ALP). Αυτή η μετάλλαξη προκύπτει λόγω ενός ελαττώματος στο γονίδιο που κωδικοποιεί διαρκώς το ένζυμο. Εάν ένα γονίδιο παράγει ένα προϊόν χωρίς καμία αναστολή, αυτό είναι γνωστό ως ιδιοσυστατική ενεργότητα. Αυτή η συγκεκριμένη μεταλλαγμένη μορφή χρησιμοποιείται για την απομόνωση και τον καθαρισμό του ενζύμου ALP.
Τα βακτήρια E. coli χρησιμοποιούνται επίσης ευρέως ως κυτταρικά εργοστάσια. Τροποποιημένα μικρόβια (π.χ. βακτήρια) και φυτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως τα λεγόμενα κυτταρικά εργοστάσια. Αυτά τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα παράγουν μόρια, χημικές ουσίες, πολυμερή, πρωτεΐνες και άλλες ουσίες, που χρησιμοποιούνται, για παράδειγμα, στη φαρμακευτική βιομηχανία, τη βιομηχανία τροφίμων και τη χημική βιομηχανία. Για την απελευθέρωση των μορίων που παράγονται στο εσωτερικό τέτοιων κυττάρων τροποποιημένων μέσω βιολογικής μηχανικής, η υπερηχητική λύση αποτελεί συνήθη μέθοδο διάσπασης των κυτταρικών τοιχωμάτων και μεταφοράς των ουσιών στόχων στο περιβάλλον υγρό. Διαβάστε περισσότερα για τη λύση κυττάρων τροποποιημένων μέσω βιολογικής μηχανικής!

Διατμητικός κατακερματισμός DNA με υπερήχους

Η χρήση διατμητικών δυνάμεων των υπερήχων αποτελεί συνήθη μέθοδο για την απελευθέρωση μορίων, οργανιδίων και πρωτεϊνών από το εσωτερικό των κυττάρων, καθώς και για τη θραύση των κλώνων DNA σε τμήματα. Η ακουστική σπηλαίωση διασπά τα κυτταρικά τοιχώματα και τις μεμβράνες, ώστε να εξαχθεί DNA από τα κύτταρα και να δημιουργηθούν θραύσματα μήκους περίπου 600 – 800 bp, το οποίο είναι ιδανικό για ανάλυση.
Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα για τους υπερηχητικούς ομογενοποιητές για τον κατακερματισμό DNA!

Βιβλιογραφία / Αναφορές

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Υπέρηχοι υψηλής απόδοσης! Η γκάμα προϊόντων της Hielscher καλύπτει ολόκληρο το φάσμα, από τη συμπαγή εργαστηριακή συσκευή υπερήχων και τις επιτραπέζιες μονάδες έως τα πλήρως βιομηχανικά συστήματα υπερήχων.

Η Hielscher Ultrasonics κατασκευάζει υπερηχητικούς ομογενοποιητές υψηλών επιδόσεων από εργαστηριακή έως βιομηχανική κλίμακα.