Υπερήχων λύση του Ε. Coli
- Τα βακτήρια E. coli είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα βακτήρια στη μικροβιολογία και τη βιοτεχνολογία.
- Υπερήχων διαταράκτες κυττάρων παρέχουν αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα για τη λύση του E. coli.
- Η έντονη αλλά με ακρίβεια ελεγχόμενη σπηλαίωση και οι δυνάμεις διάτμησης έχουν ως αποτέλεσμα πλήρη διάσπαση και υψηλές αποδόσεις εκχύλισης (π.χ. πρωτεΐνες, DNA).
Γιατί είναι υπερήχων κυτταρική διαταραχή του E. coli η προτιμώμενη μέθοδος?
Υπερήχων ομογενοποιητές ή καθετήρα-τύπου υπερήχων προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα για τη λύση E. coli ως έντονη υπερήχων διαταράσσει αποτελεσματικά τα κυτταρικά τοιχώματα και μεμβράνες. Οι υπερήχων τύπου καθετήρα χρησιμοποιούνται ευρέως για τη λύση E. coli για τους ακόλουθους λόγους:
Η εκχύλιση πρωτεΐνης από κύτταρα E.coli πραγματοποιείται αποτελεσματικά με το υπερηχητικός καθετήρας UP200St
Ο υπερηχητικός τύπος καθετήρα προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα για τη λύση E. coli. Ο αξιόπιστος και ακριβής έλεγχος των παραμέτρων διαδικασίας υπερήχων επιτρέπει τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων λειτουργίας όπως η ισχύς, η διάρκεια και ο χειρισμός δειγμάτων για την επίτευξη των επιθυμητών αποτελεσμάτων.
Ηλεκτροφορητικές αναλύσεις του γονιδιωματικού DNA του E. coli EDL933 που υποβάλλονται σε 0 – 15 λεπτά υπερήχους. Το L δείχνει τη σκάλα DNA.
Κυτταρική διαταραχή χρησιμοποιώντας υπερήχων σπηλαίωση
Οι ομογενοποιητές τύπου υπερήχων λειτουργούν με περίπου 20.000 κύκλους ανά δευτερόλεπτο (στα 20kHz) και προκαλούν σπηλαίωση σε υγρά ή εναιωρήματα. Ακουστική σπηλαίωση, μικροσκοπικές περιοχές πιέσεων που μοιάζουν με κενό και υψηλές θερμοκρασίες που διασπούν τα κύτταρα. Αν και οι θερμοκρασίες μπορεί να φτάσουν αρκετές χιλιάδες βαθμούς Κελσίου, οι όγκοι σπηλαίωσης είναι τόσο μικροί που δεν θερμαίνουν σημαντικά τη διαδικασία. Οι ακουστικές σπηλαίωση που παράγονται από υπερήχους και οι δυνάμεις διάτμησης διατρυπούν ή σπάνε την κυτταρική μεμβράνη βακτηριακών κυττάρων όπως το E.coli. Hielscher υπερήχων επιτρέπουν τον ακριβή έλεγχο των παραμέτρων της διαδικασίας, όπως υπερήχων ένταση, πλάτος, εισροή ενέργειας, και τη θερμοκρασία. Με αυτόν τον τρόπο, η διαδικασία λύσης υπερήχων μπορεί να προσαρμοστεί βέλτιστα στον τύπο κυττάρου, την κυτταρική καλλιέργεια και τον στόχο της διαδικασίας.
- ακριβής έλεγχος της λύσης (ένταση, πλάτος, θερμοκρασία)
- αξιόπιστα, αναπαραγώγιμα αποτελέσματα
- βέλτιστη προσαρμογή σε συγκεκριμένα δείγματα
- Έλεγχος θερμοκρασίας
- για πολύ μικρά έως πολύ μεγάλα δείγματα (μL προς λίτρα)
- Καθαρά μηχανική επεξεργασία
- φιλική προς το χρήστη, ασφαλή λειτουργία
- γραμμική κλιμάκωση από το εργαστήριο στην παραγωγή
VialTweeter για υπερηχητική λύση
Υπερήχων ομογενοποιητή vs άλλες τεχνικές λύσης
Ενώ η χημική και ενζυματική λύση μπορεί να είναι προβληματική – Δεδομένου ότι η χημική λύση μπορεί να μεταβάλει τις πρωτεϊνικές δομές και να εισαγάγει προβλήματα καθαρισμού και η ενζυματική λύση απαιτεί μεγάλους χρόνους επώασης και δεν είναι αναπαραγώγιμη – Υπερήχων διαταραχή είναι μια εξελιγμένη, γρήγορη μέθοδος διαταραχής κυττάρων.
Η λύση με υπερήχους βασίζεται μόνο σε μηχανικές δυνάμεις. Δεν προστίθενται χημικές ουσίες, υπερήχηση σπάει το κυτταρικό τοίχωμα με δυνάμεις διάτμησης. Η χημική λύση μπορεί να μεταβάλει τη δομή των πρωτεϊνών και να εισαγάγει προβλήματα καθαρισμού. Η ενζυματική διαταραχή απαιτεί μεγάλους χρόνους επώασης και δεν είναι αναπαραγώγιμη. Υπερήχων κυτταρική διαταραχή των κυττάρων βακτηρίων E.coli είναι γρήγορη, απλή, αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο Hielscher υπερήχων χρησιμοποιούνται σε βιολογικά και βιοχημικά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο για την προετοιμασία δειγμάτων, προ-αναναλυτικά, in-vitro διαγώνια και πολλαπλές δοκιμασίες.
Γενικές συστάσεις για υπερηχητική λύση
Κατεργασία με υπερήχους είναι η πιο δημοφιλής τεχνική για τη λύση πολύ μικρών, μεσαίων και μεγάλων ποσοτήτων κυτταρικών εναιωρημάτων – από pico-λίτρα έως 100L? hr (χρησιμοποιώντας ένα υπερηχητικό κύτταρο ροής). Τα κύτταρα λύονται με υγρή διάτμηση και σπηλαίωση. Το DNA κόβεται επίσης κατά τη διάρκεια της υπερήχησης, επομένως δεν είναι απαραίτητο να προστεθεί DNase στο κυτταρικό εναιώρημα.
Έλεγχος θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της υπερηχητικής λύσης E.coli
Με την προψύξη του δείγματος και τη διατήρηση του δείγματος κατά τη διάρκεια υπερήχων σε πάγο, η θερμική υποβάθμιση του δείγματος δείγματος μπορεί εύκολα να αποφευχθεί.
Στην ιδανική περίπτωση, τα δείγματα θα πρέπει να διατηρούνται παγωμένα κατά τη διάρκεια της λύσης, αλλά για τα περισσότερα δείγματα αρκεί η θερμοκρασία να μην αυξάνεται πάνω από τη θερμοκρασία της καλλιέργειας ή της πηγής ιστού. Ως εκ τούτου, συνιστάται, να κρατήσει το εναιώρημα σε πάγο και να υπερήχων με αρκετές σύντομες παλμούς υπερήχων 5-10 sec και παύσεις 10-30 sec. Κατά τη διάρκεια των παύσεων, η θερμότητα μπορεί να διαλυθεί για να αποκατασταθεί μια χαμηλή θερμοκρασία. Για μεγαλύτερα δείγματα κυψελών, διατίθενται διάφοροι αντιδραστήρες κυψελών ροής με ψυκτικά μπουφάν.
Διαβάστε εδώ λεπτομερείς συμβουλές και συστάσεις για μια επιτυχημένη λύση υπερήχων!
Πρωτόκολλα για την υπερηχητική παρασκευή των λυμάτων E. coli
Οι ερευνητές χρησιμοποιούν Hielscher υπερήχων ομογενοποιητές για E.coli κυτταρική διαταραχή. Παρακάτω μπορείτε να βρείτε διάφορα δοκιμασμένα και αποδεδειγμένα πρωτόκολλα για τη λύση E.coli χρησιμοποιώντας Hielscher ομογενοποιητές υπερήχων για διάφορες εφαρμογές που σχετίζονται με το E. coli.
Κυτταρική ανάπτυξη, Crosslinking και προετοιμασία των εκχυλισμάτων κυττάρων E. coli χρησιμοποιώντας υπερήχους
Για την πολυμεράση SeqA και RNA, το ChIP-Chip E. coli MG1655 ή MG1655 ΔseqA αναπτύχθηκε στους 37°C σε OD600 περίπου 0,15 σε 50 ml LB (+0,2% γλυκόζη) πριν προστεθούν 27 μl φορμαλδεΰδης (37%) ανά ml μέσου (τελική συγκέντρωση 1%). Η διασταυρούμενη σύνδεση πραγματοποιήθηκε σε αργή ανακίνηση (100 rpm) σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά ακολουθούμενη από σβέση με 10 ml γλυκίνης 2,5 M (τελική συγκέντρωση 0,5 M). Για πειράματα θερμικού σοκ, το E. coli MG1655 καλλιεργήθηκε σε μέσο 65 ml LB στους 30 ° C σε OD600 περίπου 0,3. Στη συνέχεια, 30 ml καλλιέργειας μεταφέρθηκαν σε προθερμασμένη φιάλη στους 43°C και το υπόλοιπο διατηρήθηκε στους 30°C. Η διασταυρούμενη σύνδεση και η απόσβεση ήταν όπως περιγράφηκε παραπάνω, εκτός από το ότι τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 30 ή 43 ° C για 5 λεπτά πριν από περαιτέρω αργή ανακίνηση σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν δύο φορές με κρύο TBS (pH7.5). Μετά την επαναιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 1 ml (10 mM Tris (pH 8,0), 20% σακχαρόζη, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg? ml λυσοζύμης) και επώαση στους 37 ° C για 30 λεπτά ακολουθούμενη από προσθήκη 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος IP, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο με 12 φορές 30 sec και 30 sec διαλείμματα χρησιμοποιώντας τον επεξεργαστή υπερήχων Hielscher UP400St σε ρύθμιση ισχύος 100%. Μετά από φυγοκέντρηση επί 10 λεπτά στα 9000 g, 800 μl υποπολλαπλάσια του υπερκείμενου υγρού αποθηκεύτηκαν στους -20°C. (Waldminghaus 2010)
Υπερπαραγωγή και καθαρισμός ενζύμων με υπερηχητικό καθετήρα
Για την υπερπαραγωγή πρωτεϊνών με ετικέτα δεκαχιστιδίνης (His10), το E. coli BL21(DE3) μετασχηματίστηκε με δομές pET19b. Μια ολονύκτια προκαλλιέργεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και το 1% χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό μιας καλλιέργειας έκφρασης. Τα κύτταρα που έφεραν pET19mgtB αναπτύχθηκαν στους 22°C μέχρι οπτικής πυκνότητας στα 600 nm (OD600) 0,7. Η καλλιέργεια μεταφέρθηκε στους 17°C και προκλήθηκε από 100 μM IPTG. Μετά από 16 ώρες, η καλλιέργεια συγκομίστηκε με φυγοκέντρηση στα 7.500 × g στους 4°C. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 50 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) με 0,3 M NaCl σε pH 7,4 και διαταράχθηκαν με υπερήχους με ένα sonotrode μικρο-άκρης S2 στον υπερηχητικό Hielscher UP200St σε κύκλο 0,5 και πλάτος 75%.
Η υπερπαραγωγή GtfC με ετικέτα δεκαχιστιδίνης προκλήθηκε στους 37°C σε OD600 0,6 με 100 μM IPTG. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 4 ώρες, συλλέχθηκαν και λύθηκαν όπως αναφέρθηκε παραπάνω για το MgtB.
Crude cell extracts were centrifuged at 15,000 × g and 4°C to sediment the cell debris. The clarified extracts were loaded on 1-ml HisTrap FF Crude columns using an ÄKTAprime Plus system. The enzymes were purified according to the manufacturer’s protocol for gradient elution of His-tagged proteins. Eluted protein solutions were dialyzed twice against 1,000 volumes of 50 mM PBS, pH 7.4, with 0.3 M NaCl at 4°C. The purification was analyzed by 12% SDS-PAGE. The concentration of protein was determined by the Bradford method using Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Υπερήχων εκχύλιση πρωτεΐνης από βακτήρια E. coli
Μια ενδιαφέρουσα πρωτεΐνη δολώματος (στην περίπτωση αυτή, MTV1 του Arabidopsis thaliana) συγχωνεύεται σε μια ετικέτα GST και εκφράζεται σε κύτταρα BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Πάρτε ένα σφαιρίδιο GST-MTV1 και GST (που αντιστοιχεί σε 50 ml βακτηριακής καλλιέργειας) και επαναιωρήστε το καθένα σε 2,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος ψυχρής εκχύλισης.
- Χρησιμοποιήστε έναν υπερηχητικό UP100H (εξοπλισμένο με MS3 microtip-sonotrode για μικρούς όγκους περίπου 2-5mL) για να διαταράξετε τα βακτηριακά κύτταρα μέχρι να λυθούν, γεγονός που υποδεικνύεται από μειωμένη αδιαφάνεια και αυξημένο ιξώδες. Αυτό πρέπει να διεξάγεται σε πάγο και συνιστάται η υπερήχηση σε διαστήματα (π.χ. 10 sec υπερήχηση ακολουθούμενη από παύση 10 sec στον πάγο και ούτω καθεξής). Πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να μην υπερήχους με πολύ υψηλή ένταση. Εάν ανιχνευθεί αφρισμός ή σχηματισμός λευκού ιζήματος, η ένταση πρέπει να μειωθεί.
- Το διάλυμα λυμένου βακτηρίου μεταφέρεται σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml και φυγοκεντρείται στους 4°C, 16.000 x g για 20 λεπτά.
Υπερήχων τύπου καθετήρα όπως το UP400St χρησιμοποιήστε την αρχή λειτουργίας της ακουστικής σπηλαίωσης για την αποτελεσματική λύση του E.coli.
Ανάλυση έκφρασης και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κατεργασία με υπερήχους
Το σφαιρίδιο E. coli υπερήχων με τον υπερηχητικό Hielscher UP100H. Για το σκοπό αυτό, το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) και ψύχθηκε σε πάγο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, το κυτταρικό εναιώρημα υποβλήθηκε σε υπερήχους με 10 σύντομες εκρήξεις των 10 δευτερολέπτων ακολουθούμενο από διάστημα 30 δευτερολέπτων για ψύξη. Τέλος, τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με υπερφυγοκέντρηση στους 4 ° C για 15 λεπτά στις 14000 σ.α.λ. Για την επιβεβαίωση της έκφρασης rPR, το υπερκείμενο υγρό λειτουργούσε με 12% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και αναλύθηκε με SDS-PAGE και Western blotting. Ο καθαρισμός του rPR έγινε χρησιμοποιώντας ρητίνη Ni2+-NTA (Invitrogen, ΗΠΑ) σύμφωνα με τον οδηγό του κατασκευαστή. Σε αυτό το στάδιο, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος φυσικού καθαρισμού. Η καθαρότητα της καθαρισμένης πρωτεΐνης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση στη γέλη πολυακρυλαμιδίου 12% και επακόλουθη χρώση μπλε Coomassie. Η συγκέντρωση καθαρισμένης πρωτεΐνης μετρήθηκε με κιτ ανάλυσης πρωτεΐνης Micro BCA (PIERCE, ΗΠΑ). (Azarnezhad et al. 2016)
Υπερήχων ομογενοποιητές για E. coli Lysis
Hielscher Υπέρηχοι σχεδιάζει, κατασκευάζει και προμηθεύει υψηλής απόδοσης ομογενοποιητές υπερήχων για την αξιόπιστη και αποτελεσματική λύση των βακτηρίων E. coli και άλλων τύπων κυττάρων, ιστών και κυτταρικών καλλιεργειών.
Το ευρύ χαρτοφυλάκιο των υπερήχων ανιχνευτές καθώς και έμμεση συστήματα υπερήχων μας επιτρέπει να σας προσφέρουμε τον ιδανικό ομογενοποιητή ιστών υπερήχων για την κυτταρική διαταραχή και την εφαρμογή εξαγωγής.
Σχεδιασμός, Κατασκευή και Συμβουλευτική – Ποιότητα Made in Germany
Hielscher υπερήχων είναι γνωστή για την υψηλότερη ποιότητα και τα πρότυπα σχεδιασμού τους. Έξυπνο λογισμικό, διαισθητικό μενού, προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις και αυτόματο πρωτόκολλο δεδομένων είναι μόνο μερικά χαρακτηριστικά των υπερήχων Hielscher. Η ευρωστία και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των υπερήχων μας σε ερευνητικές και βιοτεχνολογικές εγκαταστάσεις. Ακόμη και τραχιές συνθήκες και απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από Hielscher υπερήχων.
Hielscher Υπέρηχοι είναι μια πιστοποιημένη εταιρεία ISO και δίνουν ιδιαίτερη έμφαση σε υψηλής απόδοσης υπερήχων που διαθέτουν state-of-the-art τεχνολογία και φιλικότητα προς το χρήστη. Φυσικά, Hielscher υπερήχων είναι CE συμβατό και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων μας:
| Όγκος παρτίδας | Ροή | Προτεινόμενες συσκευές |
|---|---|---|
| πλάκες πολλαπλών φρεατίων? μικροτιτλοδότησης | μ.δ. | UIP400MTP |
| CupHorn για φιαλίδια ή ποτήρι ζέσεως | μ.δ. | Υπερήχων CupHorn |
| Υπερηχητικός αντιδραστήρας μικρο-ροής | μ.δ. | GDmini2 |
| έως 10 φιαλίδια με 0,5 έως 1,5 ml | μ.δ. | VialTweeter |
| 0.5 έως 1.5mL | μ.δ. | VialTweeter |
| 1 έως 500mL | 10 έως 200mL/min | UP100Η |
| 10 έως 2000mL | 20 έως 400mL? λεπτό | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 έως 20L | 0.2 έως 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 έως 100L | 2 έως 10L? λεπτό | UIP4000 |
| μ.δ. | 10 έως 100L? λεπτό | UIP16000 |
| μ.δ. | μεγαλύτερου | σύμπλεγμα UIP16000 |
Επικοινωνήστε μαζί μας!? Ρωτήστε μας!
Πρόσθετα πρωτόκολλα για υπερήχων E. coli Lysis
Allicin-τροποποιημένες πρωτεΐνες στο E. coli χρησιμοποιώντας ένα υπερήχων VialTweeter
Προσδιορισμός περιεκτικότητας σε σουλφυδρύλιο με δοκιμασία 5,5′-διθειόβις(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB)
Μια ολονύκτια καλλιέργεια E. coli MG1655 χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό του ελάχιστου μέσου MOPS (1:100). Η καλλιέργεια καλλιεργήθηκε αερόβια μέχρι να επιτευχθεί ένα A600 0,4. Η καλλιέργεια χωρίστηκε σε τρεις καλλιέργειες των 15 ml για θεραπεία του στρες. Μια μη επεξεργασμένη καλλιέργεια χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. 0,79 mM αλικίνη (128 μg ml-1) ή 1 mM διαμιδίου προστέθηκε σε μία από τις υπόλοιπες δύο καλλιέργειες η καθεμία. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 15 λεπτά. 5 ml από κάθε καλλιέργεια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (8.525 × g, 4°C, 10 min). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, αποθηκευμένο αναερόβια πριν από τη χρήση) και φυγοκεντρήθηκαν (13.000 × g, 4°C, 10 λεπτά). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (PBS με 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) πριν από τη διακοπή στους 4 ° C με υπερήχους (VialTweeter υπερήχων, Hielscher GmbH, Γερμανία) (3 × 1 λεπτό). Τα κυτταρικά υπολείμματα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (13.000 × g, 4 °C, 15 λεπτά). Το υπερκείμενο υγρό μεταφέρθηκε σε κυψελίδα QS-μακρο των 3,5 ml (10 mm) με μαγνητική ράβδο ανάδευσης και αναμίχθηκε με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Η απόσβεση των δειγμάτων παρακολουθήθηκε στα 412 nm με φασματοφωτόμετρο Jasco V-650 εξοπλισμένο με τον υποδοχέα κυψελών ελεγχόμενης θερμοκρασίας PSC-718 σε θερμοκρασία δωματίου. Προστέθηκαν 100μl διαλύματος 3 mM dithiobis(2-νιτροβενζοϊκό οξύ). Η εξαφάνιση παρακολουθούνταν μέχρι να φτάσει στον κορεσμό. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης θειόλης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον συντελεστή απόσβεσης ε412 = 13.700 μ-1 εκατοστόμετρο-1 για το θειο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ (TNB). Οι κυτταρικές συγκεντρώσεις θειόλης υπολογίστηκαν με βάση έναν όγκο κυττάρων E. coli 6,7 × 10-15 λίτρο και πυκνότητα κυττάρων A600 = 0,5 (ισοδύναμη με 1 × 108 κύτταρα ml-1 πολιτισμός). (Müller κ.ά. 2016)
Προσδιορισμός γλουταθειόνης in vivo χρησιμοποιώντας θραυστήρα κυττάρων υπερήχων
Το E.coli MG1655 καλλιεργήθηκε σε ελάχιστο μέσο MOPS σε συνολικό όγκο 200ml έως ότου επιτευχθεί A600 0,5. Η καλλιέργεια χωρίστηκε σε καλλιέργειες των 50 ml για θεραπεία του στρες. Μετά από 15 λεπτά επώασης με 0,79 mM αλικίνη, 1 mM διαμίδιο ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (έλεγχος), τα κύτταρα συλλέχθηκαν στα 4.000g στους 4°C για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα KPE πριν από την επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 700μl ρυθμιστικού διαλύματος KPE. Για την αποπρωτεΐνωση, 300l 10% (w? v) σουλφοσαλικυλικού οξέος προστέθηκαν πριν από τη διαταραχή των κυττάρων με υπερήχους (3 x 1 min; VialTweeter υπερήχων). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση (30 λεπτά, 13.000g, 4°C). Οι συγκεντρώσεις σουλφοσαλικυλικού οξέος μειώθηκαν στο 1% με την προσθήκη 3 όγκων ρυθμιστικού διαλύματος KPE. Οι μετρήσεις της ολικής γλουταθειόνης και της GSSG πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι κυτταρικές συγκεντρώσεις γλουταθειόνης υπολογίστηκαν με βάση όγκο κυττάρων E. coli 6,7×10-15 λίτρο και πυκνότητα κυψελών A600 0,5 (ισοδύναμη με 1×108 κύτταρα ml-1 πολιτισμός). Οι συγκεντρώσεις GSH υπολογίστηκαν αφαιρώντας 2[GSSG] από την ολική γλουταθειόνη. (Müller κ.ά. 2016)
Έκφραση του ανθρώπινου mAspAT στο E. coli χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή υπερήχων
Η μοναδική αποικία του E. coli BL21 (DE3) που φιλοξενεί τον φορέα έκφρασης σε 30 mL μέσου Luria-Bertani (LB) που περιέχει 100μg/mL αμπικιλλίνης, και στη συνέχεια καλλιεργείται στους 37ºC μέχρι την οπτική πυκνότητα (OD600) έφθασε σε 0,6. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 4.000 × g για 10 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε 3L φρέσκο μέσο LB που περιείχε 100μg/mL αμπικιλλίνη.
Στη συνέχεια, η έκφραση πρωτεΐνης προκλήθηκε με 1 mM ισοπροπυλίου β-ᴅ-1-θειογαλακτοπυρανοζίτη (IPTG) για 20 ώρες στους 16ºC. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 8.000 × g για 15 λεπτά και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Α (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Ελήφθησαν κατά προσέγγιση κύτταρα 45g (υγρού βάρους) από καλλιέργεια 3 L. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 40 mL (για καλλιέργεια 1 L) παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης Α και λύθηκε με υπερήχους σε παγωμένη θερμοκρασία χρησιμοποιώντας τον υπερηχητικό θραυστήρα κυττάρων Hielscher UP400St. Η κυτταρική λύση φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 σ.α.λ. για 15 λεπτά για να διαχωριστούν τα διαλυτά (υπερκείμενο υγρό) και τα κατακρημνισμένα (σφαιρίδια) κλάσματα. (Jiang et al. 2015)
Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζετε
Ε.Coli
Το Escherichia coli (E. coli) είναι ένα gram-αρνητικό, προαιρετικά αναερόβιο, ραβδοειδές, κολοβακτηρίδιο του γένους Escherichia που βρίσκεται συνήθως στο κατώτερο έντερο των θερμόαιμων οργανισμών (endotherms). Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός στελεχών E. coli (ή υποτύπων) με ποικίλα χαρακτηριστικά. Τα περισσότερα στελέχη E. coli είναι αβλαβή για τον άνθρωπο, π.χ. στελέχη Β και Κ-12 που χρησιμοποιούνται συνήθως για ερευνητικές εφαρμογές σε εργαστήρια. Ωστόσο, ορισμένα στελέχη είναι επιβλαβή και μπορούν να προκαλέσουν σοβαρή ασθένεια.
Το E. coli παίζει σημαντικό ρόλο στη σύγχρονη βιολογική μηχανική και τη βιομηχανική μικροβιολογία, δεδομένου ότι τα βακτήρια είναι εύκολο να χειριστούν. Κοινές εργαστηριακές εφαρμογές που περιλαμβάνουν συχνά τη χρήση E. coli, π.χ. για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου δεσοξυριβονουκλεϊνικού οξέος (DNA) ή για να δράσει ως πρότυπος οργανισμός.
Το E. coli είναι ένας πολύ ευέλικτος ξενιστής για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών και πολλαπλά συστήματα έκφρασης πρωτεϊνών είναι διαθέσιμα για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στο E. coli. Χρησιμοποιώντας πλασμίδια που επιτρέπουν την έκφραση υψηλού επιπέδου πρωτεΐνης, τα γονίδια μπορούν να εισαχθούν στα βακτήρια, γεγονός που επιτρέπει την παραγωγή τέτοιων πρωτεϊνών σε μεγάλες ποσότητες σε διαδικασίες βιομηχανικής ζύμωσης.
Τα E.coli χρησιμοποιούνται ως κυτταρικά εργοστάσια για την παραγωγή ινσουλίνης. Άλλες εφαρμογές περιλαμβάνουν τη χρήση τροποποιημένων κυττάρων E. coli για την ανάπτυξη και παραγωγή εμβολίων και ακινητοποιημένων ενζύμων, για την παραγωγή βιοκαυσίμων, καθώς και για βιοαποκατάσταση.
Το στέλεχος K-12 είναι μια μεταλλαγμένη μορφή του E. coli που υπερεκφράζει το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση (ALP). Αυτή η μετάλλαξη συμβαίνει λόγω ενός ελαττώματος στο γονίδιο που κωδικοποιεί συνεχώς το ένζυμο. Εάν ένα γονίδιο παράγει ένα προϊόν χωρίς καμία αναστολή, αυτό είναι γνωστό ως συστατική δραστηριότητα. Αυτή η συγκεκριμένη μεταλλαγμένη μορφή χρησιμοποιείται για την απομόνωση και τον καθαρισμό του ενζύμου ALP.
Τα βακτήρια E. coli χρησιμοποιούνται επίσης ευρέως ως κυτταρικά εργοστάσια. Τα τροποποιημένα μικρόβια (π.χ. βακτήρια) και τα φυτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως λεγόμενα εργοστάσια κυττάρων. Αυτά τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα παράγουν μόρια, χημικά, πολυμερή, πρωτεΐνες και άλλες ουσίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται για παράδειγμα στη φαρμακευτική, τροφική και χημική βιομηχανία. Προκειμένου να απελευθερωθούν τα μόρια που παράγονται στο εσωτερικό τέτοιων βιομηχανικών κυττάρων, η λύση με υπερήχους είναι μια κοινή μέθοδος για τη διατάραξη των κυτταρικών τοιχωμάτων και τη μεταφορά των ουσιών-στόχων στο περιβάλλον υγρό. Διαβάστε περισσότερα για τη λύση των βιο-βιομηχανικών κυττάρων!
Υπερήχων DNA διάτμηση
Υπερήχων δυνάμεις διάτμησης είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται συνήθως για να απελευθερώσει μόρια, οργανίδια και πρωτεΐνες από το εσωτερικό του κυττάρου, καθώς και να σπάσει κλώνους DNA σε κομμάτια. Η ακουστική σπηλαίωση σπάει τα κυτταρικά τοιχώματα και τις μεμβράνες για να εξαγάγει DNA από κύτταρα και να δημιουργήσει θραύσματα περίπου 600 – 800 bp σε μήκος, το οποίο είναι ιδανικό για ανάλυση.
Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα σχετικά με τους ομογενοποιητές υπερήχων για τον κατακερματισμό του DNA!
Βιβλιογραφία? Αναφορές
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.