Κυτταρική λύση κυττάρων BL21 με κατεργασία με υπερήχους

Τα κύτταρα BL21 αποτελούν ένα στέλεχος E. coli που χρησιμοποιείται ευρέως σε ερευνητικά εργαστήρια, στη βιοτεχνολογία και στη βιομηχανική παραγωγή λόγω της ικανότητάς τους να εκφράζουν πρωτεΐνες με υψηλή αποδοτικότητα. Η κυτταρική διάρρηξη, η λύση και η εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους αποτελούν τη συνήθη μέθοδο για την απομόνωση και τη συλλογή των πρωτεϊνών-στόχων από το εσωτερικό των κυττάρων BL21. Η κατεργασία με υπερήχους διαρρηγνύει πλήρως το κύτταρο και απελευθερώνει όλες τις εγκλωβισμένες πρωτεΐνες, καθιστώντας διαθέσιμο το 100% της πρωτεΐνης.

Κύτταρα BL21 για έκφραση πρωτεϊνών

Το BL21 είναι ένα βακτηριακό στέλεχος E. coli με χημικά επαγόμενη ικανότητα πρόσληψης DNA, κατάλληλο για μετασχηματισμό και έκφραση πρωτεϊνών σε υψηλά επίπεδα με χρήση συστήματος επαγωγής T7 RNA πολυμεράσης-IPTG. Τα κύτταρα BL21 επιτρέπουν την έκφραση πρωτεϊνών με υψηλή αποδοτικότητα από οποιοδήποτε γονίδιο βρίσκεται υπό τον έλεγχο ενός υποκινητή T7. Το στέλεχος E. coli BL21(DE3) είναι ένα στέλεχος παραγωγής πρωτεϊνών που βασίζεται στην T7 RNA πολυμεράση, συνδυάζεται με φορείς έκφρασης που βασίζονται στον υποκινητή T7 και χρησιμοποιείται ευρέως σε εργαστήρια και στη βιομηχανία για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Στο BL21(DE3), η έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μεταγράφεται από τη χρωμοσωμικά κωδικοποιημένη T7 RNA πολυμεράση (T7 RNAP), η οποία μεταγράφει οκτώ φορές ταχύτερα από τη συμβατική RNAP της E. coli. Αυτό καθιστά το στέλεχος BL21(DE3) ιδιαίτερα αποδοτικό και το μετατρέπει σε ένα από τα πλέον προτιμώμενα κυτταρικά συστήματα έκφρασης πρωτεϊνών.

Πρωτόκολλο λύσης και εκχύλισης πρωτεϊνών από κύτταρα BL21 με υπερήχους

Η κυτταρική λύση των κυττάρων BL21 πραγματοποιείται κυρίως με κατεργασία με υπερήχους σε συνδυασμό με λαουροϋλοσαρκοσινικό νάτριο (γνωστό και ως sarkosyl) ως ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα πλεονεκτήματα της κυτταρικής διάρρηξης και της εκχύλισης πρωτεϊνών με υπερήχους έγκεινται στην αξιοπιστία, στην αναπαραγωγιμότητα, καθώς και στην απλή, ασφαλή και γρήγορη λειτουργία των συσκευών υπερήχων. Το παρακάτω πρωτόκολλο παρέχει οδηγίες βήμα προς βήμα για την κυτταρική λύση κυττάρων BL21 με υπερήχους:

• Για την απομάκρυνση των πρωτεϊνών συνοδών, τα βακτηριακά ιζήματα BL21 επαναιωρήθηκαν σε 50 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος νατρίου Tris-EDTA (STE) (αποτελούμενου από 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl με προσθήκη 100 mM PMSF).
• Στη συνέχεια, προστίθενται 500 ul λυσοζύμης (10 mg/ ml) και τα κύτταρα επωάζονται σε πάγο για 15 min.
• Έπειτα, προστίθενται 500 ul DTT και 7 ml sarkosyl (10% (w/v), παρασκευασμένου σε ρυθμιστικό διάλυμα STE).
• Είναι απαραίτητο όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα καθαρισμού να διατηρούνται παγωμένα και τα δείγματα να παραμένουν συνεχώς σε πάγο. Όλα τα στάδια καθαρισμού θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε ψυχρό θάλαμο, εφόσον είναι δυνατόν.



• Για τη λύση και την εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους, τα δείγματα υποβάλλονται σε κατεργασία με υπερήχους στη συσκευή VialTweeter MultiSample Ultrasonicator για 4 x 30 sec σε πλάτος ταλάντωσης 100%, με διάστημα 2 min μεταξύ διαδοχικών κατεργασιών με υπερήχους. Εναλλακτικά, ένας ομογενοποιητής υπερήχων τύπου καθετήρα με μικροακίδα, π.χ. ο UP200Ht με S26d2 (3 x 30 sec, παύση 2 min. μεταξύ των κύκλων υπερήχων, πλάτος ταλάντωσης 80%), μπορεί να χρησιμοποιηθεί.
• Για τα επόμενα στάδια καθαρισμού, τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε πάγο ή, εναλλακτικά, να αποθηκεύονται στους -80°C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία.

Λύση με υπερήχους υπό ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας

Ο ακριβής και αξιόπιστος έλεγχος της θερμοκρασίας είναι καθοριστικός κατά τον χειρισμό βιολογικών δειγμάτων. Οι υψηλές θερμοκρασίες προκαλούν θερμική αποδόμηση των πρωτεϊνών στα δείγματα.
Όπως όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων, η κατεργασία με υπερήχους παράγει θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελέγχεται αποτελεσματικά κατά τη χρήση του VialTweeter. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας κατά την προετοιμασία τους με το VialTweeter και το VialPress για ανάλυση.

1. Παρακολούθηση της θερμοκρασίας του δείγματος: Ο επεξεργαστής υπερήχων UP200St, ο οποίος θέτει σε λειτουργία το VialTweeter, διαθέτει έξυπνο λογισμικό και συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στο UP200St και εισαγάγετε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε έναν από τους σωλήνες δειγμάτων. Μέσω της ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του UP200St ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας για την κατεργασία του δείγματός σας με υπερήχους. Η συσκευή υπερήχων σταματά αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και παραμένει σε παύση μέχρι η θερμοκρασία του δείγματος να μειωθεί στην κατώτερη τιμή της ρυθμισμένης θερμοκρασίας ∆. Στη συνέχεια, η κατεργασία με υπερήχους ξεκινά ξανά αυτόματα. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την αποικοδόμηση που προκαλείται από τη θερμότητα.
2. Το μπλοκ του VialTweeter μπορεί να προψυχθεί. Τοποθετήστε το μπλοκ του VialTweeter (μόνο το ηχοτρόδιο χωρίς τον μετατροπέα!) στο ψυγείο ή στην κατάψυξη για να προψύξετε το μπλοκ τιτανίου, ώστε να καθυστερήσει η αύξηση της θερμοκρασίας στο δείγμα. Εάν είναι δυνατόν, μπορεί επίσης να προψυχθεί και το ίδιο το δείγμα.
3. Χρησιμοποιήστε ξηρό πάγο για ψύξη κατά την κατεργασία με υπερήχους. Χρησιμοποιήστε έναν ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter πάνω στον πάγο, ώστε η θερμότητα να μπορεί να απάγεται γρήγορα.

Πελάτες σε όλο τον κόσμο χρησιμοποιούν το VialTweeter και το VialPress για την καθημερινή προετοιμασία δειγμάτων σε βιολογικά, βιοχημικά, ιατρικά και κλινικά εργαστήρια. Χάρη στο έξυπνο λογισμικό και στον έλεγχο θερμοκρασίας του επεξεργαστή UP200St, η θερμοκρασία ελέγχεται αξιόπιστα και αποφεύγεται η αποικοδόμηση των δειγμάτων που προκαλείται από τη θερμότητα. Η προετοιμασία δειγμάτων με υπερήχους με το VialTweeter και το VialPress παρέχει εξαιρετικά αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα!
 

Βρείτε τη βέλτιστη συσκευή κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για την εφαρμογή λύσης σας

Η Hielscher Ultrasonics είναι κατασκευαστής με πολυετή εμπειρία στις συσκευές κυτταρικής διάρρηξης και στους ομογενοποιητές υπερήχων υψηλής απόδοσης για εργαστήρια, επιτραπέζια συστήματα και συστήματα βιομηχανικής κλίμακας. Το μέγεθος της καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων σας, ο ερευνητικός ή παραγωγικός στόχος σας και ο όγκος των κυττάρων προς επεξεργασία ανά ώρα ή ημέρα αποτελούν ουσιώδεις παράγοντες για την εύρεση της κατάλληλης συσκευής κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για την εφαρμογή σας.
Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις για την ταυτόχρονη κατεργασία πολλαπλών δειγμάτων με υπερήχους (έως 10 φιαλίδια με το VialTweeter) και μεγάλου αριθμού δειγμάτων (δηλαδή πλάκες μικροτιτλοδότησης / πλάκες ELISA με το UIP400MTP), καθώς και από την κλασική εργαστηριακή συσκευή υπερήχων τύπου εμβαπτιζόμενου καθετήρα με διαφορετικά επίπεδα ισχύος από 50 έως 400 watts έως πλήρως βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων με έως 16.000watts ανά μονάδα για εμπορική κυτταρική διάρρηξη και εκχύλιση πρωτεϊνών σε παραγωγή μεγάλης κλίμακας. Όλες οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι κατασκευασμένες για λειτουργία 24/7/365 υπό πλήρες φορτίο. Η ανθεκτικότητα και η αξιοπιστία αποτελούν βασικά χαρακτηριστικά των συσκευών υπερήχων μας.
Όλοι οι ψηφιακοί ομογενοποιητές υπερήχων διαθέτουν έξυπνο λογισμικό, έγχρωμη οθόνη αφής και αυτόματη καταγραφή δεδομένων, που καθιστούν τη συσκευή υπερήχων ένα εύχρηστο εργαλείο εργασίας σε εργαστήρια και εγκαταστάσεις παραγωγής.
Ενημερώστε μας για το είδος των κυττάρων, τον όγκο, τη συχνότητα και τον στόχο με τον οποίο χρειάζεται να επεξεργάζεστε τα βιολογικά σας δείγματα. Θα σας προτείνουμε την καταλληλότερη συσκευή κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για τις απαιτήσεις της διεργασίας σας.

Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συστημάτων υπερήχων μας, από συμπαγείς ομογενοποιητές χειρός και συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων έως βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων για εμπορικές εφαρμογές:

Βιβλιογραφία / Αναφορές

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.