Κυτταρική λύση των κυττάρων BL21 με υπερήχους
Τα κύτταρα BL21 είναι ένα στέλεχος του E. coli που χρησιμοποιείται ευρέως σε ερευνητικά εργαστήρια, βιοτεχνολογία και βιομηχανική παραγωγή λόγω της ικανότητάς τους να εκφράζουν πρωτεΐνες εξαιρετικά αποτελεσματικές. Υπερήχων κυτταρική διαταραχή, λύση και εκχύλιση πρωτεϊνών είναι η κοινή μέθοδος για την απομόνωση και τη συλλογή των στοχευμένων πρωτεϊνών από το κυτταρικό εσωτερικό των κυττάρων BL21. Υπερήχους διαταράσσει πλήρως το κύτταρο και απελευθερώνει όλες τις παγιδευμένες πρωτεΐνες, καθιστώντας διαθέσιμο το 100% της πρωτεΐνης.
Κύτταρα BL21 για έκφραση πρωτεϊνών
Το κύτταρο BL21 είναι ένα χημικά ικανό βακτηριακό στέλεχος E. coli κατάλληλο για μετασχηματισμό και έκφραση πρωτεϊνών υψηλού επιπέδου χρησιμοποιώντας ένα σύστημα επαγωγής πολυμεράσης-IPTG T7 RNA. Τα κύτταρα BL21 επιτρέπουν την υψηλής απόδοσης πρωτεϊνική έκφραση οποιουδήποτε γονιδίου που βρίσκεται υπό τον έλεγχο ενός υποκινητή Τ7. Το στέλεχος E. coli BL21(DE3) είναι ένα στέλεχος παραγωγής πρωτεϊνών με βάση την πολυμεράση T7 RNA σε συνδυασμό με φορείς έκφρασης που βασίζονται σε υποκινητές T7 και εφαρμόζεται ευρέως σε εργαστήρια και βιομηχανίες για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Στο BL21(DE3), η έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μεταγράφεται από την χρωμοσωμικά κωδικοποιημένη T7 RNA πολυμεράση (T7 RNAP), η οποία μεταγράφεται οκτώ φορές ταχύτερα από το συμβατικό E. coli RNAP. Αυτό καθιστά το στέλεχος BL21 (DE3) εξαιρετικά αποτελεσματικό και το μετατρέπει σε ένα από τα πιο προτιμώμενα κυτταρικά συστήματα έκφρασης πρωτεϊνών.
Πρωτόκολλο για λύση με υπερήχους και εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα BL21
Η κυτταρική λύση των κυττάρων BL21 εκτελείται κυρίως χρησιμοποιώντας υπερήχους σε συνδυασμό με λαουρυλοσαρκοσινικό νάτριο (επίσης γνωστό ως σαρκοζύλιο) ως ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα πλεονεκτήματα της διαταραχής των υπερηχητικών κυττάρων και της εκχύλισης πρωτεϊνών έγκεινται στην αξιοπιστία, την αναπαραγωγιμότητα καθώς και την απλή, ασφαλή και ταχεία λειτουργία των υπερήχων. Το παρακάτω πρωτόκολλο δίνει μια βήμα προς βήμα κατεύθυνση για την υπερηχητική λύση κυττάρων BL21:
- Προκειμένου να αφαιρεθούν οι πρωτεΐνες συνοδών, τα σφαιρίδια βακτηρίων BL21 επαναιωρήθηκαν σε 50 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος νατρίου Tris-EDTA (STE) (αποτελούμενο από 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl συμπληρωμένο με 100 mM PMSF).
- Προστίθενται 500 ul λυσοζύμης (10 mg / ml) και τα κύτταρα επωάζονται σε πάγο για 15 λεπτά.
- Στη συνέχεια, προστίθενται 500 ul DTT και 7 ml σαρκοσυλίου (10% (w/v) σε ρυθμιστικό διάλυμα STE).
- Είναι σημαντικό να διατηρούνται όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα καθαρισμού παγωμένα και να διατηρούνται τα δείγματα σε πάγο όλη την ώρα. Όλα τα βήματα καθαρισμού πρέπει να πραγματοποιούνται στο κρύο δωμάτιο, εάν είναι δυνατόν.
- Για λύση με υπερήχους και εκχύλιση πρωτεϊνών, τα δείγματα υποβάλλονται σε υπερήχους στο VialTweeter MultiSample υπερήχων για 4 x 30 sec σε πλάτος 100% με διάστημα 2 λεπτών μεταξύ κάθε υπερήχων. Εναλλακτικά, ένας ομογενοποιητής υπερήχων τύπου καθετήρα με μικρο-άκρη π.χ., UP200Ht με S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. παύση μεταξύ υπερήχων κύκλους, 80% πλάτος) μπορεί να χρησιμοποιηθεί.
- Για περαιτέρω στάδια καθαρισμού, τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε πάγο ή, εναλλακτικά, να αποθηκεύονται στους -80°C μέχρι περαιτέρω επεξεργασίας.
Υπερηχητικός κυτταρικός διαταράκτης UP200St με micro-tip S26d2 για λύση και εκχύλιση πρωτεΐνης
Υπερήχων Λύση υπό έλεγχο θερμοκρασίας Prescise
Ο ακριβής και αξιόπιστος έλεγχος της θερμοκρασίας είναι ζωτικής σημασίας κατά το χειρισμό βιολογικών δειγμάτων. Οι υψηλές θερμοκρασίες προκαλούν θερμικά επαγόμενη αποικοδόμηση πρωτεϊνών σε δείγματα.
Όπως όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων, κατεργασία με υπερήχους δημιουργεί θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελεγχθεί καλά όταν χρησιμοποιείτε το VialTweeter. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας ενώ τα προετοιμάζουμε με το VialTweeter και το VialPress για ανάλυση.
- Παρακολούθηση της θερμοκρασίας δείγματος: Ο υπερηχητικός επεξεργαστής UP200St, ο οποίος οδηγεί το VialTweeter, είναι εξοπλισμένος με ένα έξυπνο λογισμικό και έναν αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στο UP200St και τοποθετήστε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε έναν από τους σωλήνες δείγματος. Μέσω ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του UP200St ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασιών για το δείγμα σας με υπερήχους. Ο υπερηχητικός θα σταματήσει αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και θα σταματήσει έως ότου η θερμοκρασία δείγματος μειωθεί στη χαμηλότερη τιμή της ρυθμισμένης θερμοκρασίας ∆. Στη συνέχεια, η υπερήχηση ξεκινά αυτόματα και πάλι. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την υποβάθμιση που προκαλείται από τη θερμότητα.
- Το μπλοκ VialTweeter μπορεί να προψυχθεί. Βάλτε το μπλοκ VialTweeter (μόνο το sonotrode χωρίς μορφοτροπέα!) στο ψυγείο ή τον καταψύκτη για να προψύξετε το μπλοκ τιτανίου βοηθά στην αναβολή της αύξησης της θερμοκρασίας στο δείγμα. Εάν είναι δυνατόν, το ίδιο το δείγμα μπορεί επίσης να προψυχθεί.
- Χρησιμοποιήστε ξηρό πάγο για να κρυώσει κατά τη διάρκεια της υπερήχησης. Χρησιμοποιήστε ένα ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter στον πάγο έτσι ώστε η θερμότητα να μπορεί να διαλυθεί γρήγορα.
Οι πελάτες σε όλο τον κόσμο χρησιμοποιούν το VialTweeter και το VialPress για την καθημερινή προετοιμασία δειγμάτων σε βιολογικά, βιοχημικά, ιατρικά και κλινικά εργαστήρια. Το έξυπνο λογισμικό και ο έλεγχος θερμοκρασίας του επεξεργαστή UP200St, η θερμοκρασία ελέγχεται αξιόπιστα και αποφεύγεται η υποβάθμιση του δείγματος που προκαλείται από τη θερμότητα. Η προετοιμασία του δείγματος υπερήχων με το VialTweeter και το VialPress προσφέρει εξαιρετικά αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα!
Βρείτε τον βέλτιστο υπερηχητικό διαταράκτη για την εφαρμογή λύσης
Hielscher Υπέρηχοι είναι μακροχρόνια έμπειρος κατασκευαστής υψηλής απόδοσης υπερήχων διαταράκτες κυττάρων και ομογενοποιητές για εργαστήρια, πάγκο-top και συστήματα βιομηχανικής κλίμακας. Το μέγεθος της βακτηριακής κυτταροκαλλιέργειας, ο στόχος έρευνας ή παραγωγής και ο όγκος του κυττάρου που πρέπει να επεξεργαστεί ανά ώρα ή ημέρα είναι βασικοί παράγοντες για να βρείτε τον σωστό υπερηχητικό κυτταρικό διαταράκτη για την εφαρμογή σας.
Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες λύσεις για την ταυτόχρονη υπερήχηση των πολλαπλών δειγμάτων (μέχρι 10 φιαλίδια με το VialTweeter) και δείγματα μάζας (δηλαδή, πλάκες μικροτιτλοδότησης / πλάκες ELISA με το UIP400MTP), καθώς και το κλασικό εργαστήριο τύπου καθετήρα υπερήχων με διαφορετικά επίπεδα ισχύος από 50 έως 400 watt σε πλήρως βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων με έως και 16.000watts ανά μονάδα για εμπορική διαταραχή κυττάρων και εκχύλιση πρωτεϊνών σε μεγάλη παραγωγή. Όλοι οι υπερήχων Hielscher είναι κατασκευασμένοι για τη λειτουργία 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα/365 υπό πλήρες φορτίο. Η ευρωστία και η αξιοπιστία είναι βασικά χαρακτηριστικά των συσκευών υπερήχων μας.
Όλοι οι ψηφιακοί ομογενοποιητές υπερήχων είναι εξοπλισμένοι με έξυπνο λογισμικό, έγχρωμη οθόνη αφής και αυτόματο πρωτόκολλο δεδομένων, που καθιστούν τη συσκευή υπερήχων σε ένα βολικό εργαλείο εργασίας στο εργαστήριο και τις εγκαταστάσεις παραγωγής.
Ενημερώστε μας, τι είδους κύτταρα, τι όγκο, με ποια συχνότητα και με ποιο στόχο πρέπει να επεξεργαστείτε τα βιολογικά σας δείγματα. Θα σας προτείνουμε τον καταλληλότερο διαταράκτη κυττάρων υπερήχων για τις απαιτήσεις της διαδικασίας σας.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερηχητικών συστημάτων μας από συμπαγείς ομογενοποιητές χειρός και MultiSample Ultrasonicators σε βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων για εμπορικές εφαρμογές:
| Όγκος παρτίδας | Ροή | Προτεινόμενες συσκευές |
|---|---|---|
| Πλάκες 96 φρεατίων / μικροτιτλοδότησης | μ.δ. | UIP400MTP |
| 10 φιαλίδια à 0,5 έως 1,5 ml | μ.δ. | VialTweeter στο UP200St |
| 0.01 έως 250mL | 5 έως 100mL / λεπτό | UP50Η |
| 0.01 έως 500mL | 10 έως 200mL/min | UP100Η |
| 10 έως 2000mL | 20 έως 400mL / λεπτό | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 έως 20L | 0.2 έως 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 έως 100L | 2 έως 10L / λεπτό | UIP4000hdT |
| μ.δ. | 10 έως 100L / λεπτό | UIP16000 |
| μ.δ. | μεγαλύτερου | σύμπλεγμα UIP16000 |
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
UIP400MTP πλάκα υπερήχων για διάσπαση κυττάρων υψηλής απόδοσης σε τρυβλία 96 φρεατίων
υπερήχων UP200Ht με 2mm microtip S26d2 για την υπερήχηση μικρών δειγμάτων
Διαβάστε περισσότερα για το πώς μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τον ομογενοποιητή ιστού υπερήχων σας για την αποτελεσματική και αξιόπιστη προετοιμασία ρυθμιστικών διαλυμάτων!
Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζετε
Βακτήρια Escherichia Coli
Το Escherichia coli είναι ένας τύπος βακτηρίων, που δεν σχηματίζει σπόρια, αρνητικό κατά Gram και χαρακτηρίζεται από τη μορφή μιας ευθείας ράβδου. Τα βακτήρια E.coli υπάρχουν στο περιβάλλον, τα τρόφιμα και τα έντερα ανθρώπων και ζώων. Το E. coli είναι συνήθως κινητικό με τη χρήση περιτριχικών μαστιγίων, αλλά υπάρχουν και μη κινητοί τύποι. Τα E.coli είναι οι λεγόμενοι προαιρετικά αναερόβιοι χημειοοργανοτρόφοι οργανισμοί, πράγμα που σημαίνει ότι είναι ικανοί τόσο για αναπνευστικό όσο και για ζυμωτικό μεταβολισμό. Οι περισσότεροι τύποι E.coli είναι καλοήθεις και εκπληρώνουν χρήσιμες λειτουργίες στο σώμα, π.χ. καταστολή της ανάπτυξης επιβλαβών βακτηριακών ειδών, σύνθεση βιταμινών κ.λπ.
Τα κύτταρα βακτηρίων Escherichia coli του λεγόμενου τύπου Β είναι μια ειδική κατηγορία στελεχών E.coli, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα για τη διερεύνηση μηχανισμών όπως η ευαισθησία βακτηριοφάγων ή τα συστήματα τροποποίησης περιορισμού. Επιπλέον, τα βακτήρια E.coli αποτιμώνται ως αξιόπιστο άλογο εργασίας για την έκφραση πρωτεϊνών σε εργαστήρια βιοτεχνολογίας και βιοεπιστημών. Για παράδειγμα, το E.coli χρησιμοποιείται για τη σύνθεση ενώσεων όπως πρωτεΐνες και ολιγοσακχαρίτες σε βιομηχανική κλίμακα. Λόγω ειδικών χαρακτηριστικών όπως η ανεπάρκεια πρωτεάσης, η χαμηλή παραγωγή οξικού οξέος σε υψηλό επίπεδο γλυκόζης και η αυξημένη διαπερατότητα, τα κύτταρα E. coli B είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα κύτταρα ξενιστές για την παραγωγή γενετικά τροποποιημένων πρωτεϊνών.
Ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη
Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες (rProt) αποκτούν σημαντική σημασία σε πολλαπλούς κλάδους, συμπεριλαμβανομένης της χημικής παραγωγής, της φαρμακευτικής, της καλλυντικής, της ανθρώπινης και ζωικής ιατρικής, της γεωργίας, των τροφίμων καθώς και των βιομηχανιών επεξεργασίας αποβλήτων.
Η παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης απαιτεί τη χρήση ενός συστήματος έκφρασης. Ως εκφραστικά κυτταρικά συστήματα για την παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο προκαρυωτικά όσο και ευκαρυωτικά κύτταρα. Ενώ τα βακτηριακά κύτταρα χρησιμοποιούνται ευρύτερα για την έκφραση πρωτεϊνών λόγω παραγόντων όπως το χαμηλό κόστος, η εύκολη επεκτασιμότητα και οι απλές συνθήκες μέσων, τα συστήματα θηλαστικών, ζυμομυκήτων, φυκών, εντόμων και κυττάρων είναι καθιερωμένες εναλλακτικές λύσεις. Ο τύπος πρωτεΐνης, η λειτουργική δραστηριότητα, καθώς και η απαιτούμενη απόδοση της εκφρασμένης πρωτεΐνης επηρεάζουν την επιλογή του κυτταρικού συστήματος που χρησιμοποιείται για την έκφραση πρωτεϊνών.
Προκειμένου να εκφραστεί η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, ένα συγκεκριμένο κύτταρο πρέπει να μεταγγιστεί με έναν φορέα DNA που περιέχει το πρότυπο του ανασυνδυασμένου DNA. Τα κύτταρα που μεταγγίζονται με το πρότυπο στη συνέχεια καλλιεργούνται. Ως συνέπεια του κυτταρικού μηχανισμού, τα κύτταρα μεταγράφουν και μεταφράζουν την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος, παράγοντας έτσι τη στοχευόμενη πρωτεΐνη.
Καθώς οι εκφρασμένες πρωτεΐνες παγιδεύονται στην κυτταρική μήτρα, το κύτταρο πρέπει να λυθεί (να διαταραχθεί και να σπάσει) για να απελευθερωθούν οι πρωτεΐνες. Σε ένα επόμενο στάδιο καθαρισμού, η πρωτεΐνη διαχωρίζεται και καθαρίζεται.
Η πρώτη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που χρησιμοποιήθηκε στη θεραπεία ήταν η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη το 1982. Σήμερα, περισσότεροι από 170 τύποι ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης παράγονται παγκοσμίως για ιατρικές θεραπείες. Οι ευρέως χρησιμοποιούμενες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται στην ιατρική είναι για παράδειγμα ανασυνδυασμένες ορμόνες, ιντερφερόνες, ιντερλευκίνες, αυξητικοί παράγοντες, παράγοντες νέκρωσης όγκων, παράγοντες πήξης του αίματος, θρομβολυτικά φάρμακα και ένζυμα για τη θεραπεία σοβαρών ασθενειών όπως ο διαβήτης, ο νανισμός, το έμφραγμα του μυοκαρδίου, η συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, η εγκεφαλική αποπληξία, η σκλήρυνση κατά πλάκας, η ουδετεροπενία, η θρομβοπενία, η αναιμία, η ηπατίτιδα, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το άσθμα, η νόσος του Crohn και οι θεραπείες καρκίνου. (πρβλ. Phuc V. Pham, στο Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
ViaTweeter υπερήχων για την ταυτόχρονη υπερήχηση 10 δειγμάτων, π.χ. για τη διατάραξη των κυττάρων BL21
Υπερήχων υψηλής απόδοσης! Η γκάμα προϊόντων της Hielscher καλύπτει το πλήρες φάσμα από το συμπαγές εργαστήριο υπερήχων πάνω από μονάδες πάγκου σε πλήρη βιομηχανικά συστήματα υπερήχων.