Υπερήχων κατακερματισμός DNA για αλληλούχιση επόμενης γενιάς
Η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) απαιτεί την αξιόπιστη διάτμηση και τον κατακερματισμό του γονιδιωματικού DNA προκειμένου να αλληλουχηθούν οι κλώνοι γονιδιωματικού DNA και να δημιουργηθούν βιβλιοθήκες γονιδιώματος. Ο ελεγχόμενος κατακερματισμός του DNA σε θραύσματα DNA είναι ένα ουσιαστικό στάδιο προετοιμασίας δείγματος που απαιτείται πριν από την αλληλουχία του DNA. Υπερήχους αποδεικνύεται ως αποτελεσματική και αξιόπιστη τεχνική για τον κατακερματισμό του DNA συγκεκριμένου μήκους. Τα πρωτόκολλα κατακερματισμού υπερήχων DNA επιτυγχάνουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα κατακερματισμού. Hielscher υπερήχων είναι σε θέση να παράγουν ένα ευρύ φάσμα γονιδιωματικών κατανομών μεγέθους θραυσμάτων DNA, ακριβώς ελεγχόμενες μέσω των παραμέτρων λειτουργίας. Δεδομένου ότι Hielscher υπερήχων συστήματα διάτμησης DNA είναι διαθέσιμα για μονά και πολλαπλά φιαλίδια, καθώς και για μικροπλάκες, προετοιμασία δείγματος γίνεται εξαιρετικά αποτελεσματική.
Το UIP400MTP Plate Sonicator Για την προετοιμασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης επιτυγχάνεται ομοιόμορφα με υπερήχους δείγματα σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων, μικροτιτλοδότησης και πλάκες 96 κοιλοτήτων
- Επαναλαμβανόμενα / Αναπαραγώγιμα αποτελέσματα
- Ρυθμιζόμενο με ακρίβεια για να αποκτήσετε συγκεκριμένο μήκος θραύσματος
- Ταχεία επεξεργασία
- συνεπή αποτελέσματα κατακερματισμού DNA
- συσκευές για οποιονδήποτε όγκο δείγματος (π.χ. πολλαπλά φιαλίδια ή μικροπλάκες)
- υψηλή απόδοση
- ακριβής έλεγχος θερμοκρασίας
- απλή, φιλική προς το χρήστη λειτουργία
Αλληλούχιση επόμενης γενιάς: Υπερηχητικός κατακερματισμός DNA για προετοιμασία βιβλιοθήκης
Προκειμένου να πραγματοποιηθεί μια αλληλουχία επόμενης γενιάς, πρέπει να εκτελεστούν τα τρία βασικά βήματα (1) προετοιμασίας βιβλιοθήκης, (2) αλληλουχίας και (3) ανάλυσης δεδομένων. Κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας της βιβλιοθήκης, το DNA κατακερματίζεται, στη συνέχεια τα άκρα των θραυσμάτων επισκευάζονται (γυαλίζονται) προσθέτοντας μια βάση αδενίνης και τα θραύσματα-στόχοι μετατρέπονται σε δίκλωνο DNA. Τέλος, οι λεγόμενοι προσαρμογείς συνδέονται με σύνδεση, PCR ή σήμανση, έτσι ώστε το τελικό προϊόν DNA βιβλιοθήκης να μπορεί να ποσοτικοποιηθεί για αλληλούχιση.
Κατακερματισμός DNA με χρήση υπερήχων: Ειδικά όταν οι τεχνολογίες αλληλούχισης σύντομης ανάγνωσης όπως το Illumina, οι οποίες δεν μπορούν να διαβάσουν εύκολα μεγαλύτερα θραύσματα DNA, οι βάσεις DNA πρέπει να κατακερματιστούν σε ένα ορισμένο μέγεθος που μπορεί να επιτευχθεί αξιόπιστα με υπερήχους.
Υπερήχους μπορεί να χρησιμοποιηθεί αξιόπιστα για κατακερματισμό DNA, RNA και χρωματίνης.
Αλληλουχία επόμενης γενιάς – Προετοιμασία βιβλιοθήκης
Υπερήχων κατακερματισμός DNA χρησιμοποιείται συνήθως στην προετοιμασία των βιβλιοθηκών αλληλούχισης DNA για πλατφόρμες αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS). Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται για να σπάσει τα μόρια DNA σε μικρότερα θραύσματα ενός επιθυμητού εύρους μεγέθους, γεγονός που διευκολύνει τα επόμενα βήματα στην προετοιμασία της βιβλιοθήκης. Ο υπερηχητικός κατακερματισμός DNA απαιτείται συνήθως κατά τη διάρκεια του σταδίου προετοιμασίας της βιβλιοθήκης των ροών εργασίας NGS για τον κατακερματισμό του γονιδιωματικού DNA σε μικρότερα κομμάτια κατάλληλα για κατάντη επεξεργασία και αλληλούχιση. Διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη διασφάλιση της επιτυχίας του πειράματος αλληλούχισης δημιουργώντας θραύσματα DNA του κατάλληλου εύρους μεγέθους για τη συγκεκριμένη πλατφόρμα αλληλούχισης που χρησιμοποιείται.
Ηλεκτροφορητικές αναλύσεις του γονιδιωματικού DNA του E. coli EDL933 που υποβάλλονται σε 0 – 15 λεπτά υπερήχους. Το L δείχνει τη σκάλα DNA. (Basselet et al. 2008)
Αλληλουχία επόμενης γενιάς – Βήματα διαδικασίας:
- Υπερήχων κατακερματισμός DNA: Πριν από την κατασκευή της βιβλιοθήκης, το γονιδιωματικό DNA είναι κατακερματισμένο σε μικρότερα, πιο διαχειρίσιμα κομμάτια. Υπερήχων κατακερματισμός περιλαμβάνει τη χρήση υψηλής συχνότητας ηχητικά κύματα για τη διάτμηση των μορίων DNA σε θραύσματα του επιθυμητού εύρους μεγέθους. Αυτό το βήμα είναι ζωτικής σημασίας, διότι βοηθά να διασφαλιστεί ότι οι αναγνώσεις αλληλουχίας που δημιουργούνται αργότερα θα έχουν το κατάλληλο μήκος για την πλατφόρμα αλληλουχίας που χρησιμοποιείται. Το εύρος μεγέθους των θραυσμάτων μπορεί να ρυθμιστεί με βάση τις ειδικές απαιτήσεις του πειράματος αλληλούχισης.
- Κλωνική ενίσχυση με PCR: Μετά από υπερηχητικό κατακερματισμό, τα θραύσματα DNA υποβάλλονται σε τελική επισκευή, απολίνωση προσαρμογέα και ενίσχυση PCR για τη δημιουργία των τελικών βιβλιοθηκών αλληλούχισης DNA. Αυτά τα βήματα προετοιμάζουν τα κατακερματισμένα μόρια DNA για τη διαδικασία αλληλούχισης προσθέτοντας αλληλουχίες προσαρμογέα απαραίτητες για τη σύνδεση στην πλατφόρμα αλληλούχισης και παρέχοντας θέσεις εκκίνησης για ενίσχυση PCR.
- Αλληλούχιση DNA με σύνθεση: Μόλις προετοιμαστούν οι βιβλιοθήκες αλληλούχισης, ξεκινά η διαδικασία αλληλούχισης DNA με σύνθεση (SBS). Κατά τη διάρκεια του SBS, η αλληλουχία DNA προσδιορίζεται με τη διαδοχική προσθήκη νουκλεοτιδίων στον συμπληρωματικό κλώνο. Αυτό το βήμα περιλαμβάνει κυκλικές αντιδράσεις ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων, απεικόνισης και διάσπασης, επιτρέποντας τον προσδιορισμό της αλληλουχίας DNA με βάση τα σήματα φθορισμού που εκπέμπονται από τα ενσωματωμένα νουκλεοτίδια.
- Μαζικά παράλληλη αλληλουχία: Στο τελικό στάδιο, τα χωρικά διαχωρισμένα, ενισχυμένα πρότυπα DNA αλληλουχούνται ταυτόχρονα με μαζικά παράλληλο τρόπο. Αυτή η προσέγγιση αλληλούχισης υψηλής απόδοσης επιτρέπει τη δημιουργία εκατομμυρίων έως δισεκατομμυρίων αναγνώσεων αλληλούχισης σε μία μόνο εκτέλεση αλληλούχισης, επιτρέποντας τον αποτελεσματικό και γρήγορο προσδιορισμό των αλληλουχιών DNA.
Πώς υπερήχων DNA κατακερματισμού εργασίας?
Κατεργασία με υπερήχους, επίσης γνωστή ως ακουστική επεξεργασία δείγματος, είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον κατακερματισμό του DNA. Για διάτμηση DNA υπερήχων, τα δείγματα εκτίθενται σε υπερηχητικά κύματα υπό ελεγχόμενη κατάσταση. Η αρχή λειτουργίας του κατακερματισμού του DNA υπερήχων βασίζεται στις δονήσεις και τη σπηλαίωση που παράγονται από τα κύματα υπερήχων. Οι δυνάμεις διάτμησης που προκύπτουν από την υπερηχητική (ακουστική) σπηλαίωση σπάνε μόρια DNA υψηλού μοριακού βάρους. Η ρύθμιση της υπερήχησης όπως η ένταση (πλάτος, διάρκεια), ο τρόπος παλμών και η θερμοκρασία επιτρέπουν τον ακριβή κατακερματισμό του DNA σε ένα ορισμένο επιθυμητό μήκος θραυσμάτων DNA. Ενώ το DNA συχνά μειώνεται σε 100 έως 600 bp χρησιμοποιώντας υπερήχους, μεγαλύτερα θραύσματα DNA μέχρι 1300 bp μπορούν να ληφθούν όταν εφαρμόζονται ηπιότερες συνθήκες υπερήχων.
Υπερήχων διάτμηση DNA κατά τη διάρκεια ChIP – ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης
Προσαρμοσμένο από το Jkwchui υπό CC-BY-SA.03
Έλεγχος θερμοκρασίας για την πρόληψη της υποβάθμισης του DNA
Το δίκλωνο μοριακό σχήμα του DNA είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στις υψηλές θερμοκρασίες, έτσι ώστε ο ακριβής έλεγχος της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια των βημάτων προετοιμασίας του δείγματος να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για αξιόπιστα αποτελέσματα ανάλυσης.
Είτε χρησιμοποιείτε υπερήχους ανιχνευτή Hielscher, το VialTweeter ή το UIP400MTP – Εξασφαλίζεται συνεχής παρακολούθηση και έλεγχος θερμοκρασίας χάρη στον αισθητήρα θερμοκρασίας που μπορεί να συνδεθεί και το λογισμικό έξυπνης συσκευής. Για να διατηρήσετε τη θερμοκρασία εντός ενός συγκεκριμένου εύρους, μπορείτε να ορίσετε ένα ανώτερο και χαμηλότερο όριο θερμοκρασίας. Κατά συνέπεια, ο υπερηχητικός θα σταματήσει μόλις ξεπεραστεί αυτό το όριο θερμοκρασίας και αυτόματα θα συνεχίσει να υπερήχων όταν η θερμοκρασία έχει μειωθεί κατά ένα σύνολο ∆T.
Το εξελιγμένο λογισμικό των υπερήχων Hielscher εξασφαλίζει την αξιόπιστη διατήρηση των ιδανικών συνθηκών επεξεργασίας δειγμάτων.
Κατακερματισμός DNA δείγματος μάζας με το UIP400MTP Multi-Well Plate Ultrasonicator
Ο αριθμός των δειγμάτων στις βιοεπιστήμες έχει αυξηθεί σημαντικά την τελευταία δεκαετία. Αυτό σημαίνει ότι πολύ μεγάλος αριθμός δειγμάτων (π.χ. 384, 1536 ή 3456 κοιλότητες ανά μικροπλάκα) πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία κατά την προετοιμασία και την ανάλυση του δείγματος υπό σταθερά ίσες συνθήκες, προκειμένου να ληφθούν συγκρίσιμα και έγκυρα αποτελέσματα. Με την UIP400MTP, Hielscher Υπέρηχοι ακολουθεί την τάση της μαζικής επεξεργασίας δειγμάτων. Το UIP400MTP είναι ένας υπερηχητικός παράγοντας για την προετοιμασία δειγμάτων χρησιμοποιώντας μικροπλάκες. Το UIP400MTP μπορεί να επεξεργαστεί πλάκες με 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ή 3456 πηγάδια. Ανάλογα με τον τύπο της μικροπλάκας, κάθε φρεάτιο μπορεί συνήθως να χωρέσει όγκους δείγματος μεταξύ δεκάδων νανολίτρων και αρκετών χιλιοστόλιτρων. Χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα των επιστημών της ζωής, η UIP400MTP χρησιμοποιείται πολύ συχνά για την προετοιμασία δειγμάτων πριν από δοκιμασίες όπως ELISA (ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία) ή PCR, πριν από την ανάλυση πρωτεϊνών, καθώς και για την παρασκευή χρωματίνης πριν από CHiP και CHiP-seq, ταυτοποίηση τροποποίησης ιστόνης και άλλες αναλυτικές επεξεργασίες (π.χ. ηλεκτροφόρηση πηκτής, φασματομετρία μάζας).
Διαβάστε περισσότερα σχετικά με την επεξεργασία πλακών PCR υψηλής απόδοσης!
Το VialTweeter για την προετοιμασία δείγματος έως και 10 φιαλιδίων
Το VialTweeter είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο εργαστήριο υπερήχων VialTweeter που επιτρέπει την αποτελεσματική και άνετη υπερήχηση έως και 10 φιαλίδια ταυτόχρονα. Δεδομένου ότι τα φιαλίδια και οι δοκιμαστικοί σωλήνες (π.χ. φιαλίδια Eppendorf, κρυοφιαλίδια, σωλήνες φυγοκέντρισης) υποβάλλονται έμμεσα σε υπερήχους, αποφεύγεται οποιαδήποτε διασταυρούμενη μόλυνση. Καθώς η ίδια ένταση υπερήχων παραδίδεται σε κάθε δείγμα, όλα τα αποτελέσματα υπερήχων είναι ομοιογενή και αναπαραγώγιμα. Το VialTweeter προσφέρει όλες τις έξυπνες λειτουργίες όπως και τις άλλες ψηφιακές συσκευές μας (π.χ. έξυπνο μενού, προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις, έλεγχο θερμοκρασίας, τηλεχειριστήριο κ.λπ.) έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η μέγιστη άνεση του χρήστη.
Ανιχνευτές πολλαπλών δακτύλων για πλάκες Microwell
Διαθέσιμος για τους ομογενοποιητές ανιχνευτών υπερήχων UP200Ht και UP200St, οι ανιχνευτές πολλαπλών δακτύλων με 4 ή 8 δάχτυλα είναι μια άνετη επιλογή για την υπερήχηση πολλαπλών δειγμάτων ταυτόχρονα υπό τις ίδιες συνθήκες. Για παράδειγμα, το sonotrode MTP-24-8-96 είναι ένας ανιχνευτής οκτώ δακτύλων, ο οποίος είναι ιδανικός για την ενσωμάτωση σε αυτοματοποιημένα συστήματα ή την αποτελεσματική χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων των φρεατίων των πλακών πολλαπλών φρεατίων. Το sonotrode πολλαπλών δακτύλων είναι ιδανικό για αυτοματοποιημένα εργαστήρια, όπου επεξεργάζονται κυρίως ποτήρια ζέσεως και δοκιμαστικοί σωλήνες χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο υπερηχητικό sonotrode. Οι ανιχνευτές πολλαπλών δακτύλων και τυποποιημένων μπορούν να αντικατασταθούν γρήγορα μέσα σε λίγα λεπτά, μετατρέποντας τον υπερηχητικό ανιχνευτή ενός καθετήρα σε έναν υπερηχητικό διαταράκτη πολλαπλών καθετήρα.
Hielscher υπερήχων για κατακερματισμό του DNA
Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες υπερήχων με βάση τις πλατφόρμες για το DNA, RNA, και κατακερματισμό χρωματίνης. Αυτές οι διαφορετικές πλατφόρμες περιλαμβάνουν υπερηχητικούς ανιχνευτές (sonotrodes), έμμεσες λύσεις υπερήχων για την ταυτόχρονη προετοιμασία δείγματος πολλαπλών σωλήνων ή πλακών πολλαπλών φρεατίων (π.χ. πλάκες 96 φρεατίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης), sonoreactors, και υπερήχων cuphorns. Όλες οι πλατφόρμες διάτμησης DNA τροφοδοτούνται από επεξεργαστές υπερήχων υψηλής απόδοσης συντονισμένους με συχνότητα, οι οποίοι είναι ακριβώς ελεγχόμενοι και παρέχουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.
Υπερήχων επεξεργαστές για οποιοδήποτε αριθμό δείγματος και μέγεθος
Με τους υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων Hielscher VialTweeter (για έως και 10 δοκιμαστικούς σωλήνες) και UIP400MTP (για μικροπλάκες / πλάκες πολλαπλών φρεατίων) καθίσταται εύκολα δυνατή η μείωση του χρόνου επεξεργασίας δείγματος λόγω έντονης και επακριβώς ελεγχόμενης υπερήχων, ενώ επιτυγχάνεται η επιθυμητή κατανομή μεγέθους θραυσμάτων DNA και απόδοση. Ο υπερηχητικός κατακερματισμός DNA καθιστά την προετοιμασία του δείγματος αποτελεσματική, αξιόπιστη και κλιμακούμενη. Τα πρωτόκολλα μπορούν να κλιμακωθούν γραμμικά από ένα σε πολλά δείγματα εφαρμόζοντας συνεχώς ελεγχόμενους υπερήχους.
Καθετήρας υπερήχων με ένα έως πέντε δάχτυλα είναι ιδανικό για την προετοιμασία μικρότερων αριθμών δειγμάτων. Εργαστήριο υπερήχων Hielscher είναι διαθέσιμα σε διάφορα μεγέθη, ώστε να μπορούμε να σας προτείνουμε την ιδανική συσκευή για την εφαρμογή και τις απαιτήσεις σας.
ακριβής έλεγχος της διαδικασίας
Ακριβώς ελεγχόμενες ρυθμίσεις υπερήχων είναι ζωτικής σημασίας, δεδομένου ότι η εξαντλητική ηχοποίηση μπορεί να καταστρέψει το DNA, το RNA και τη χρωματίνη, αλλά η ανεπαρκής διάτμηση υπερήχων οδηγεί σε πολύ μεγάλα θραύσματα DNA και χρωματίνης. Ψηφιακοί υπερήχων Hielscher μπορεί εύκολα να ρυθμιστεί σε ακριβή παράμετρο υπερήχων. Συγκεκριμένες ρυθμίσεις υπερήχων μπορούν επίσης να αποθηκευτούν ως προγραμματισμένη ρύθμιση για γρήγορη επανάληψη της ίδιας διαδικασίας.
Όλες οι υπερήχηση πρωτοκολλούνται αυτόματα και αποθηκεύονται ως αρχείο CSV σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD. Αυτό επιτρέπει την ακριβή τεκμηρίωση των εκτελούμενων δοκιμών και καθιστά δυνατή την αναθεώρηση των υπερήχων τρέχει εύκολα.
Μέσω τηλεχειριστηρίου προγράμματος περιήγησης, όλοι οι ψηφιακοί υπερήχων μπορούν να λειτουργήσουν και να παρακολουθούνται μέσω οποιουδήποτε τυπικού προγράμματος περιήγησης. Δεν απαιτείται εγκατάσταση πρόσθετου λογισμικού, καθώς μια σύνδεση LAN επιτρέπει μια πολύ απλή εγκατάσταση plug-n-play.
Υψηλότερη φιλικότητα προς το χρήστη στην προετοιμασία δειγμάτων υπερήχων
Όλοι Hielscher υπερήχων έχουν σχεδιαστεί για να παρέχουν υπερήχους υψηλής απόδοσης, ενώ ταυτόχρονα είναι πάντα πολύ φιλικό προς το χρήστη και εύκολο στη χρήση. Όλες οι ρυθμίσεις είναι καλά δομημένες σε ένα σαφές μενού, το οποίο είναι εύκολα προσβάσιμο μέσω έγχρωμης οθόνης αφής ή τηλεχειριστηρίου προγράμματος περιήγησης. Το έξυπνο λογισμικό με προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις και αυτόματη καταγραφή δεδομένων εξασφαλίζει βέλτιστες ρυθμίσεις υπερήχων για αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Η καθαρή και εύχρηστη διεπαφή μενού μετατρέπει Hielscher υπερήχων σε φιλικές προς το χρήστη και αποτελεσματικές συσκευές.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων εργαστηρίου μας, τα οποία είναι ιδανικά για εργασίες προετοιμασίας δειγμάτων όπως ο κατακερματισμός DNA και RNA, η κυτταρική λύση καθώς και η εκχύλιση πρωτεϊνών:
| Συσκευή | Ισχύς [W] | Δακτυλογραφώ | Όγκος [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | για μικροπλάκες | 6 – 3456 πηγάδια | VialTweeter | 200 | για έως 10 φιαλίδια συν δυνατότητα σύσφιξης | 0.5 – 1.5 |
| UP50Η | 50 | Τύπος αισθητήρα | 0.01 – 250 |
| UP100Η | 100 | Τύπος αισθητήρα | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | Τύπος αισθητήρα | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Τύπος αισθητήρα | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Τύπος αισθητήρα | 5.0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | κύτταρο ροής χωρίς μόλυνση |
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Η υπερηχητική μονάδα προετοιμασίας πολλαπλών δειγμάτων VialTweeter επιτρέπει την ταυτόχρονη υπερήχηση έως και 10 φιαλιδίων. Με τη συσκευή σύσφιξης VialPress, μπορούν να πιεστούν έως και 4 επιπλέον σωλήνες προς τα εμπρός για έντονη υπερήχηση.
Το sonotrode MTP-24-8-96 διαθέτει οκτώ υπερηχητικούς ανιχνευτές για την υπερήχηση των φρεατίων των πλακών μικροτιτλοδότησης.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζετε
Τι είναι η αλληλουχία επόμενης γενιάς;
Η αλληλούχιση επόμενης γενιάς, επίσης αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS), αλληλούχιση υψηλής απόδοσης ή αλληλούχιση δεύτερης γενιάς, αναφέρεται στην προσέγγιση της μαζικής παράλληλης αλληλούχισης, όπου πολύ μεγάλες (μαζικές) ποσότητες DNA εκατομμυρίων θραυσμάτων αλληλουχούνται ταυτόχρονα παράλληλα ανά εκτέλεση.
Προκειμένου να πραγματοποιηθεί μια αλληλουχία επόμενης γενιάς, τα τρία βασικά βήματα της
- προετοιμασία βιβλιοθήκης,
- αλληλουχία, και
- Ανάλυση δεδομένων
απαιτούνται.
Κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας της βιβλιοθήκης, οι κλώνοι DNA πρέπει να κατακερματιστούν σε θραύσματα DNA ορισμένου μήκους. Κατεργασία με υπερήχους είναι μία από τις προτιμώμενες τεχνικές για τον κατακερματισμό του DNA.
Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αλληλούχισης DNA, η σειρά των νουκλεοτιδίων στο DNA – γνωστή ως αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος – προσδιορίζεται. Η αλληλουχία νουκλεϊνικών οξέων αποτελείται από τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις – αδενίνη, κυτοσίνη, γουανίνη, θυμίνη – ποιος κωδικός για πληροφορίες.
Η αλληλούχιση επόμενης γενιάς οδηγεί την έρευνα στις βιοεπιστήμες και την εξατομικευμένη ιατρική, καθώς η αλληλούχιση DNA και RNA χρησιμοποιείται σε μεγάλο βαθμό στη γονιδιωματική έρευνα, την έρευνα για τον καρκίνο, την έρευνα σπάνιων και πολύπλοκων ασθενειών, τη μικροβιακή έρευνα, τη γεωργογενωμική και πολλά άλλα ερευνητικά πεδία.
Αλληλουχία επόμενης γενιάς έναντι αλληλουχίας Sanger
Ενώ με την αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) είναι δυνατή η αλληλουχία τεράστιου αριθμού γονιδιωματικών δειγμάτων, η αλληλούχιση Sanger (επίσης γνωστή ως μέθοδος τερματισμού αλυσίδας ή αλληλούχιση πρώτης γενιάς) έχει μόνο την ικανότητα αλληλουχίας μικρών αριθμών δειγμάτων. Η αλληλούχιση Sanger αλληλουχεί μόνο ένα θραύσμα DNA κάθε φορά και μπορεί να επιτευχθεί σε μία μόνο ημέρα. Λόγω της ασφάλειάς της, η αλληλουχία Sanger θεωρείται επίσης η τεχνολογία χρυσού προτύπου, η οποία χρησιμοποιείται για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με αλληλούχιση επόμενης γενιάς.
Η αλληλούχιση Sanger επιτυγχάνει μήκη ανάγνωσης περίπου 800bp (συνήθως 500-600bp με μη εμπλουτισμένο DNA). Τα μεγαλύτερα μήκη ανάγνωσης στην αλληλούχιση Sanger εμφανίζουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων αλληλούχισης, ειδικά όσον αφορά την αλληλούχιση επαναλαμβανόμενων περιοχών του γονιδιώματος. Μια πρόκληση των δεδομένων αλληλουχίας σύντομης ανάγνωσης είναι ιδιαίτερα ένα ζήτημα στην αλληλούχιση νέων γονιδιωμάτων (de novo) και στην αλληλούχιση εξαιρετικά αναδιατεταγμένων τμημάτων γονιδιώματος, συνήθως εκείνων που παρατηρούνται σε καρκινικά γονιδιώματα ή σε περιοχές χρωμοσωμάτων που παρουσιάζουν δομική παραλλαγή. [cp. Morozova και Marra, 2008]
DNA – Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ – Οι μορφές και οι λειτουργίες του
Κάθε μορφή DNA έχει μοναδικά χαρακτηριστικά και εφαρμογές, συμβάλλοντας σε ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών πεδίων, συμπεριλαμβανομένης της ογκολογίας, της γενετικής, της εγκληματολογικής επιστήμης και της εξελικτικής βιολογίας. Hielscher υπερήχων είναι μια εξαιρετικά αποτελεσματική και αξιόπιστη λύση για την απομόνωση και κατακερματισμό DNA και RNA για τους σκοπούς της ανάλυσής σας. Στην παρακάτω λίστα, σας εξηγούμε τις συγκεκριμένες μορφές DNA και τις κατηγοριοποιούμε με βάση το βιολογικό πλαίσιο και τις λειτουργίες τους:
- Γονιδιωματικό DNA (gDNA)
Γονιδιωματικό DNA (gDNA): Το πλήρες σύνολο του DNA σε έναν οργανισμό, συμπεριλαμβανομένων τόσο των κωδικοποιητικών (γονιδίων) όσο και των μη κωδικοποιητικών περιοχών. - Εξωκυττάριο DNA
Κυκλοφορών DNA όγκων (ctDNA): Θραύσματα DNA που απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος από καρκινικά κύτταρα.
DNA χωρίς κύτταρα (cfDNA): Θραύσματα DNA που βρίσκονται ελεύθερα κυκλοφορούν στην κυκλοφορία του αίματος, προερχόμενα από διάφορους ιστούς. - Εξωχρωμοσωμικό κυκλικό DNA (eccDNA): Κυκλικά μόρια DNA που βρίσκονται έξω από τα χρωμοσώματα στα ευκαρυωτικά κύτταρα.
Ιικό DNA: DNA που προέρχεται από ιούς, είτε ενσωματωμένο στο γονιδίωμα του ξενιστή είτε ως επισωμικό DNA. - μιτοχονδριακό DNA
Μιτοχονδριακό DNA (mtDNA): Το DNA βρίσκεται στα μιτοχόνδρια, κληρονομείται μητρικά και εμπλέκεται στην παραγωγή ενέργειας. - πλασμιδικό DNA
Πλασμιδικό DNA: Μικρά, κυκλικά μόρια DNA που αναπαράγονται ανεξάρτητα από το χρωμοσωμικό DNA, βρίσκονται συνήθως σε βακτήρια και χρησιμοποιούνται στη γενετική μηχανική. - πυρηνικό DNA
Πυρηνικό DNA (nDNA): DNA που περιέχεται στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων, που περιλαμβάνει την πλειοψηφία του γενετικού υλικού σε έναν οργανισμό. - Μονοκύτταρο DNA
Μονοκύτταρο DNA (scDNA): DNA που εξάγεται από ένα μόνο κύτταρο, χρησιμοποιείται για λεπτομερή γονιδιωματική ανάλυση σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου. - Ανασυνδυασμένο DNA
Ανασυνδυασμένο DNA (rDNA): Μόρια DNA που σχηματίζονται με εργαστηριακές μεθόδους γενετικού ανασυνδυασμού για να συγκεντρώσουν γενετικό υλικό από πολλαπλές πηγές. - Εξειδικευμένες Φόρμες
Περιβαλλοντικό DNA (eDNA): DNA που συλλέγεται από περιβαλλοντικά δείγματα (έδαφος, νερό) χωρίς απομόνωση των οργανισμών προέλευσης
Αρχαίο DNA (aDNA): DNA που εξάγεται από αρχαία δείγματα, παρέχοντας πληροφορίες για την εξελικτική βιολογία και τους αρχαίους πληθυσμούς. - Χρωμοσωμικό DNA
Χρωμοσωμικό DNA: DNA που αποτελεί τα χρωμοσώματα εντός του πυρήνα του κυττάρου, περιλαμβάνοντας τόσο κωδικοποιητικές όσο και μη κωδικοποιητικές περιοχές. - Ιογενείς και συνθετικές μορφές
Ιικό DNA: DNA που προέρχεται από ιούς, οι οποίοι μπορούν είτε να ενσωματωθούν σε γονιδιώματα ξενιστών είτε να υπάρχουν ως ανεξάρτητες οντότητες.
Συνθετικό DNA: Τεχνητά συνθετικές αλληλουχίες DNA που δημιουργούνται μέσω χημικών διεργασιών, που χρησιμοποιούνται συχνά στην έρευνα και τη βιοτεχνολογία.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.