Κατακερματισμός DNA με υπερήχους για αλληλούχηση νέας γενιάς
Η αλληλούχηση νέας γενιάς (NGS) απαιτεί αξιόπιστη διάτμηση και κατακερματισμό του γονιδιωματικού DNA για την αλληλούχηση των κλώνων του γονιδιωματικού DNA και τη δημιουργία γονιδιωματικών βιβλιοθηκών. Ο ελεγχόμενος κατακερματισμός του DNA σε θραύσματα DNA αποτελεί βασικό βήμα προετοιμασίας δειγμάτων που απαιτείται πριν από την αλληλούχηση του DNA. Η κατεργασία με υπερήχους έχει αποδειχθεί αποτελεσματική και αξιόπιστη τεχνική για τον κατακερματισμό του DNA σε θραύσματα συγκεκριμένου μήκους. Τα πρωτόκολλα κατακερματισμού DNA με υπερήχους επιτυγχάνουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα κατακερματισμού. Οι συσκευές υπερήχων Hielscher μπορούν να παράγουν ένα ευρύ φάσμα κατανομών μεγέθους θραυσμάτων γονιδιωματικού DNA, οι οποίες ελέγχονται με ακρίβεια μέσω των παραμέτρων λειτουργίας. Καθώς τα συστήματα διάτμησης DNA με υπερήχους της Hielscher διατίθενται για μεμονωμένα και πολλαπλά φιαλίδια, καθώς και για μικροπλάκες, η προετοιμασία δειγμάτων γίνεται ιδιαίτερα αποδοτική.
Ο επεξεργαστής υπερήχων πλακών UIP400MTP για προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας υποβάλλει ομοιόμορφα σε κατεργασία με υπερήχους δείγματα σε πλάκες πολλαπλών βοθρίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης και πλάκες 96 βοθρίων
- επαναλήψιμα / αναπαραγώγιμα αποτελέσματα
- δυνατότητα ακριβούς ρύθμισης για την επίτευξη συγκεκριμένου μήκους θραυσμάτων
- ταχεία επεξεργασία
- σταθερά αποτελέσματα κατακερματισμού DNA
- συσκευές για οποιουσδήποτε όγκους δειγμάτων (π.χ., πολλαπλά φιαλίδια ή μικροπλάκες)
- υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα
- ακριβής έλεγχος θερμοκρασίας
- απλή, φιλική προς τον χρήστη λειτουργία
Αλληλούχηση νέας γενιάς: Κατακερματισμός DNA με υπερήχους για προετοιμασία βιβλιοθηκών
Για να πραγματοποιηθεί αλληλούχηση νέας γενιάς, πρέπει να εκτελεστούν τα τρία βασικά βήματα: (1) προετοιμασία βιβλιοθηκών, (2) αλληλούχηση και (3) ανάλυση δεδομένων. Κατά την προετοιμασία βιβλιοθηκών, το DNA κατακερματίζεται, στη συνέχεια τα άκρα των θραυσμάτων επιδιορθώνονται (λειαίνονται) με την προσθήκη μίας βάσης αδενίνης και τα θραύσματα-στόχοι μετατρέπονται σε δίκλωνο DNA. Τέλος, οι λεγόμενοι προσαρμογείς συνδέονται μέσω αντίδρασης λιγάσης, PCR ή ταυτόχρονου κατακερματισμού και προσθήκης προσαρμογέων (tagmentation), ώστε το τελικό προϊόν DNA της βιβλιοθήκης να μπορεί να ποσοτικοποιηθεί για αλληλούχηση.
Κατακερματισμός DNA με κατεργασία με υπερήχους: Ειδικά όταν χρησιμοποιούνται τεχνολογίες αλληλούχησης βραχέων αναγνώσεων όπως η Illumina, οι οποίες δεν μπορούν να διαβάσουν εύκολα μεγαλύτερα θραύσματα DNA, οι κλώνοι DNA πρέπει να κατακερματίζονται σε θραύσματα συγκεκριμένου μεγέθους, κάτι που μπορεί να επιτευχθεί αξιόπιστα με κατεργασία με υπερήχους.
Η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να χρησιμοποιηθεί αξιόπιστα για τον κατακερματισμό DNA, RNA και χρωματίνης.
Αλληλούχηση νέας γενιάς – Προετοιμασία βιβλιοθηκών
Ο κατακερματισμός DNA με υπερήχους χρησιμοποιείται συνήθως στην προετοιμασία βιβλιοθηκών αλληλούχησης DNA για πλατφόρμες αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS). Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τη διάσπαση των μορίων DNA σε μικρότερα θραύσματα εντός ενός επιθυμητού εύρους μεγέθους, γεγονός που διευκολύνει τα επόμενα βήματα της προετοιμασίας βιβλιοθηκών. Ο κατακερματισμός DNA με υπερήχους απαιτείται συνήθως κατά το βήμα προετοιμασίας βιβλιοθηκών στις ροές εργασίας NGS, για τον κατακερματισμό του γονιδιωματικού DNA σε μικρότερα τμήματα κατάλληλα για επακόλουθη επεξεργασία και αλληλούχηση. Διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη διασφάλιση της επιτυχίας του πειράματος αλληλούχησης, παράγοντας θραύσματα DNA εντός του κατάλληλου εύρους μεγέθους για τη συγκεκριμένη πλατφόρμα αλληλούχησης που χρησιμοποιείται.
Ηλεκτροφορητικές αναλύσεις γονιδιωματικού DNA του E. coli EDL933 που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους για 0 – 15 min. Το L υποδηλώνει τον δείκτη μοριακού μεγέθους DNA. (Basselet et al. 2008)
Αλληλούχηση νέας γενιάς – Βήματα της διαδικασίας:
- Κατακερματισμός DNA με υπερήχους: Πριν από την κατασκευή βιβλιοθηκών, το γονιδιωματικό DNA κατακερματίζεται σε μικρότερα, πιο εύχρηστα τμήματα. Ο κατακερματισμός με υπερήχους περιλαμβάνει τη χρήση ηχητικών κυμάτων υψηλής συχνότητας για τη διάτμηση των μορίων DNA σε θραύσματα εντός του επιθυμητού εύρους μεγέθους. Το βήμα αυτό είναι καθοριστικό, επειδή συμβάλλει στη διασφάλιση ότι οι αναγνώσεις αλληλούχησης που θα παραχθούν αργότερα θα έχουν το κατάλληλο μήκος για την πλατφόρμα αλληλούχησης που χρησιμοποιείται. Το εύρος μεγέθους των θραυσμάτων μπορεί να προσαρμοστεί με βάση τις συγκεκριμένες απαιτήσεις του πειράματος αλληλούχησης.
- Κλωνική ενίσχυση με PCR: Μετά τον κατακερματισμό με υπερήχους, τα θραύσματα DNA υποβάλλονται σε επιδιόρθωση των άκρων, σύνδεση προσαρμογέων και ενίσχυση μέσω PCR για τη δημιουργία των τελικών βιβλιοθηκών αλληλούχησης DNA. Αυτά τα βήματα προετοιμάζουν τα κατακερματισμένα μόρια DNA για τη διαδικασία αλληλούχησης, προσθέτοντας αλληλουχίες προσαρμογέων που είναι απαραίτητες για την πρόσδεση στην πλατφόρμα αλληλούχησης και παρέχοντας θέσεις πρόσδεσης εκκινητών για την ενίσχυση μέσω PCR.
- Αλληλούχηση DNA μέσω σύνθεσης: Μόλις προετοιμαστούν οι βιβλιοθήκες αλληλούχησης, ξεκινά η διαδικασία αλληλούχησης DNA μέσω σύνθεσης (SBS). Κατά την SBS, η αλληλουχία του DNA προσδιορίζεται με τη διαδοχική προσθήκη νουκλεοτιδίων στη συμπληρωματική αλυσίδα. Αυτό το βήμα περιλαμβάνει κυκλικές αντιδράσεις ενσωμάτωσης νουκλεοτιδίων, απεικόνισης και αποκοπής, επιτρέποντας τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA βάσει των σημάτων φθορισμού που εκπέμπουν τα ενσωματωμένα νουκλεοτίδια.
- Μαζικά παράλληλη αλληλούχηση: Στο τελικό βήμα, τα χωρικά διαχωρισμένα, ενισχυμένα μόρια DNA που χρησιμεύουν ως μήτρες αλληλουχούνται ταυτόχρονα με μαζικά παράλληλο τρόπο. Αυτή η προσέγγιση αλληλούχησης υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας επιτρέπει τη δημιουργία εκατομμυρίων έως δισεκατομμυρίων αναγνώσεων αλληλούχησης σε μία μόνο εκτέλεση αλληλούχησης, καθιστώντας δυνατό τον αποτελεσματικό και ταχύ προσδιορισμό αλληλουχιών DNA.
Πώς λειτουργεί ο κατακερματισμός DNA με υπερήχους;
Η κατεργασία με υπερήχους, γνωστή και ως ακουστική επεξεργασία δειγμάτων, είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος κατακερματισμού του DNA. Για τη διάτμηση του DNA με υπερήχους, τα δείγματα εκτίθενται σε υπερηχητικά κύματα υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Η αρχή λειτουργίας του κατακερματισμού DNA με υπερήχους βασίζεται στις δονήσεις και στη σπηλαίωση που προκαλούνται από τα υπερηχητικά κύματα. Οι δυνάμεις διάτμησης που προκύπτουν από την υπερηχητική (ακουστική) σπηλαίωση διασπούν τα μόρια DNA υψηλού μοριακού βάρους. Οι ρυθμίσεις της κατεργασίας με υπερήχους, όπως η ένταση (πλάτος, διάρκεια), ο τρόπος παλμικής λειτουργίας και η θερμοκρασία, επιτρέπουν τον ακριβή κατακερματισμό του DNA σε θραύσματα συγκεκριμένου επιθυμητού μήκους. Ενώ το DNA συχνά κατακερματίζεται σε μήκη 100 έως 600 bp με τη χρήση υπερήχων, μπορούν να ληφθούν μεγαλύτερα θραύσματα DNA, μήκους έως 1300 bp, όταν εφαρμόζονται ηπιότερες συνθήκες κατεργασίας με υπερήχους.
Διάτμηση DNA με υπερήχους κατά την ChIP – ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης
Προσαρμογή από έργο του Jkwchui υπό την άδεια CC-BY-SA.03
Έλεγχος θερμοκρασίας για την αποτροπή της αποικοδόμησης του DNA
Η δίκλωνη μοριακή δομή του DNA είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στις αυξημένες θερμοκρασίες, επομένως ο ακριβής έλεγχος της θερμοκρασίας κατά τα βήματα προετοιμασίας των δειγμάτων αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για αξιόπιστα αποτελέσματα ανάλυσης.
Είτε χρησιμοποιείτε τις συσκευές υπερήχων με καθετήρα της Hielscher είτε το VialTweeter ή το UIP400MTP, η συνεχής παρακολούθηση και ο έλεγχος της θερμοκρασίας διασφαλίζονται χάρη σε έναν αισθητήρα θερμοκρασίας με βύσμα και στο έξυπνο λογισμικό της συσκευής. Για να διατηρήσετε τη θερμοκρασία εντός συγκεκριμένου εύρους, μπορείτε να ορίσετε ένα ανώτερο και ένα κατώτερο όριο θερμοκρασίας. Κατά συνέπεια, η συσκευή υπερήχων διακόπτει προσωρινά τη λειτουργία της μόλις ξεπεραστεί αυτό το όριο θερμοκρασίας και συνεχίζει αυτόματα την κατεργασία με υπερήχους όταν η θερμοκρασία μειωθεί κατά μια καθορισμένη τιμή ∆T.
Το προηγμένο λογισμικό των συσκευών υπερήχων της Hielscher εξασφαλίζει την αξιόπιστη διατήρηση των ιδανικών συνθηκών επεξεργασίας των δειγμάτων.
Κατακερματισμός DNA μεγάλου αριθμού δειγμάτων με τη συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών βοθρίων
Ο αριθμός των δειγμάτων στις βιοεπιστήμες έχει αυξηθεί σημαντικά κατά την τελευταία δεκαετία. Αυτό σημαίνει ότι πολύ μεγάλοι αριθμοί δειγμάτων (π.χ., 384, 1536 ή 3456 βοθρία ανά μικροπλάκα) πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία κατά την προετοιμασία και την ανάλυση των δειγμάτων υπό σταθερά ίδιες συνθήκες, ώστε να προκύπτουν συγκρίσιμα και έγκυρα αποτελέσματα. Με το UIP400MTP, η Hielscher Ultrasonics ακολουθεί την τάση της μαζικής επεξεργασίας δειγμάτων. Το UIP400MTP είναι μια συσκευή υπερήχων για την προετοιμασία δειγμάτων με χρήση μικροπλακών. Το UIP400MTP μπορεί να επεξεργαστεί πλάκες με 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ή 3456 βοθρία. Ανάλογα με τον τύπο της μικροπλάκας, κάθε βοθρίο μπορεί συνήθως να περιέχει όγκους δείγματος από δεκάδες νανόλιτρα έως αρκετά χιλιοστόλιτρα. Το UIP400MTP χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα των βιοεπιστημών και πολύ συχνά για την προετοιμασία δειγμάτων πριν από δοκιμασίες όπως η ELISA (ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία) ή η PCR, πριν από την ανάλυση πρωτεϊνών, καθώς και για την προετοιμασία χρωματίνης πριν από CHiP και CHiP-seq, την ταυτοποίηση τροποποιήσεων ιστονών και άλλες αναλυτικές επεξεργασίες (π.χ., ηλεκτροφόρηση σε πηκτή, φασματομετρία μάζας).
Διαβάστε περισσότερα για την επεξεργασία πλακών PCR με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα!
Το VialTweeter για την προετοιμασία δειγμάτων σε έως και 10 φιαλίδια
Το VialTweeter είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη εργαστηριακή συσκευή υπερήχων VialTweeter που επιτρέπει την αποτελεσματική και εύκολη κατεργασία έως και 10 φιαλιδίων ταυτόχρονα με υπερήχους. Καθώς τα φιαλίδια και οι δοκιμαστικοί σωλήνες (π.χ., φιαλίδια Eppendorf, κρυοφιαλίδια, σωλήνες φυγοκέντρησης) υποβάλλονται σε έμμεση κατεργασία με υπερήχους, αποφεύγεται κάθε διασταυρούμενη επιμόλυνση. Καθώς σε κάθε δείγμα μεταδίδεται η ίδια ένταση υπερήχων, όλα τα αποτελέσματα της κατεργασίας με υπερήχους είναι ομοιογενή και αναπαραγώγιμα. Το VialTweeter προσφέρει όλες τις έξυπνες λειτουργίες των άλλων ψηφιακών συσκευών μας (π.χ., έξυπνο μενού, προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις, έλεγχο θερμοκρασίας, τηλεχειρισμό κ.λπ.), εξασφαλίζοντας τη μέγιστη άνεση για τον χρήστη.
Πολυδακτυλικές ακίδες για πλάκες μικροβοθρίων
Οι πολυδακτυλικές ακίδες με 4 ή 8 δάκτυλα, οι οποίες διατίθενται για τους ομογενοποιητές υπερήχων με ακίδα UP200Ht και UP200St, αποτελούν μια εύχρηστη επιλογή για την ταυτόχρονη κατεργασία πολλών δειγμάτων με υπερήχους υπό τις ίδιες συνθήκες. Για παράδειγμα, το ηχοτρόδιο MTP-24-8-96 είναι μια ακίδα με οκτώ δάκτυλα, ιδανική για ενσωμάτωση σε αυτοματοποιημένα συστήματα ή για την αποτελεσματική χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων στα βοθρία πλακών πολλαπλών βοθρίων. Το πολυδακτυλικό ηχοτρόδιο είναι ιδανικό για αυτοματοποίηση σε εργαστήρια όπου υποβάλλονται σε επεξεργασία κυρίως ποτήρια ζέσεως και δοκιμαστικοί σωλήνες με χρήση ενός τυπικού ηχοτροδίου υπερήχων. Οι πολυδακτυλικές και οι τυπικές ακίδες μπορούν να εναλλάσσονται γρήγορα μέσα σε λίγα λεπτά, μετατρέποντας τη συσκευή υπερήχων μίας ακίδας σε συσκευή διάρρηξης με υπερήχους πολλαπλών ακίδων.
Συσκευές υπερήχων Hielscher για τον κατακερματισμό DNA
Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες πλατφόρμες που βασίζονται στους υπερήχους για τον κατακερματισμό DNA, RNA και χρωματίνης. Αυτές οι διαφορετικές πλατφόρμες περιλαμβάνουν ακίδες υπερήχων (ηχοτρόδια), λύσεις έμμεσης κατεργασίας με υπερήχους για την ταυτόχρονη προετοιμασία δειγμάτων σε πολλαπλούς σωλήνες ή πλάκες πολλαπλών βοθρίων (π.χ., πλάκες 96 βοθρίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης), ηχοαντιδραστήρες και κεφαλές υπερήχων τύπου κυπέλλου. Όλες οι πλατφόρμες για τη διάτμηση DNA τροφοδοτούνται από επεξεργαστές υπερήχων υψηλής απόδοσης με συντονισμένη συχνότητα, οι οποίοι επιτρέπουν ακριβή έλεγχο και παρέχουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.
Επεξεργαστές υπερήχων για κάθε αριθμό και μέγεθος δειγμάτων
Με τις συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων της Hielscher, VialTweeter (για έως και 10 δοκιμαστικούς σωλήνες) και UIP400MTP (για μικροπλάκες/πλάκες πολλαπλών βοθρίων), είναι εύκολο να μειωθεί ο χρόνος επεξεργασίας των δειγμάτων χάρη στην έντονη και με ακρίβεια ελεγχόμενη κατεργασία με υπερήχους, επιτυγχάνοντας παράλληλα την επιθυμητή κατανομή μεγέθους και απόδοση θραυσμάτων DNA. Ο κατακερματισμός DNA με υπερήχους καθιστά την προετοιμασία δειγμάτων αποτελεσματική, αξιόπιστη και κλιμακώσιμη. Τα πρωτόκολλα μπορούν να κλιμακωθούν γραμμικά από ένα σε πολυάριθμα δείγματα με την εφαρμογή διαρκώς ελεγχόμενων υπερήχων.
Οι συσκευές υπερήχων με ακίδες ενός έως πέντε δακτύλων είναι ιδανικές για την προετοιμασία μικρότερων αριθμών δειγμάτων. Οι εργαστηριακές συσκευές υπερήχων της Hielscher διατίθενται σε διάφορα μεγέθη, ώστε να μπορούμε να σας προτείνουμε την ιδανική συσκευή για την εφαρμογή και τις απαιτήσεις σας.
Ακριβής έλεγχος της διεργασίας
Οι ρυθμίσεις κατεργασίας με υπερήχους που μπορούν να ελεγχθούν με ακρίβεια είναι καθοριστικές, καθώς η υπερβολική κατεργασία με υπερήχους μπορεί να καταστρέψει το DNA, το RNA και τη χρωματίνη, ενώ η ανεπαρκής διάτμηση με υπερήχους έχει ως αποτέλεσμα υπερβολικά μεγάλα θραύσματα DNA και χρωματίνης. Οι ψηφιακές συσκευές υπερήχων της Hielscher μπορούν εύκολα να ρυθμιστούν σε ακριβείς παραμέτρους κατεργασίας με υπερήχους. Συγκεκριμένες ρυθμίσεις κατεργασίας με υπερήχους μπορούν επίσης να αποθηκευτούν ως προγραμματισμένη ρύθμιση για τη γρήγορη επανάληψη της ίδιας διαδικασίας.
Όλες οι κατεργασίες με υπερήχους καταγράφονται αυτόματα και αποθηκεύονται ως αρχείο CSV σε ενσωματωμένη κάρτα SD. Αυτό επιτρέπει την ακριβή τεκμηρίωση των δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν και καθιστά εύκολη την ανασκόπηση των κύκλων κατεργασίας με υπερήχους.
Μέσω τηλεχειρισμού από πρόγραμμα περιήγησης, όλες οι ψηφιακές συσκευές υπερήχων μπορούν να λειτουργούν και να παρακολουθούνται από οποιοδήποτε τυπικό πρόγραμμα περιήγησης. Δεν απαιτείται εγκατάσταση πρόσθετου λογισμικού, καθώς η σύνδεση LAN επιτρέπει μια πολύ απλή εγκατάσταση άμεσης σύνδεσης και λειτουργίας.
Η μέγιστη ευχρηστία στην προετοιμασία δειγμάτων με υπερήχους
Όλες οι συσκευές υπερήχων της Hielscher έχουν σχεδιαστεί για να παρέχουν υπερήχους υψηλής απόδοσης, παραμένοντας ταυτόχρονα πάντα πολύ φιλικές προς τον χρήστη και εύκολες στον χειρισμό. Όλες οι ρυθμίσεις είναι καλά οργανωμένες σε ένα σαφές μενού, στο οποίο η πρόσβαση είναι εύκολη μέσω έγχρωμης οθόνης αφής ή τηλεχειρισμού από πρόγραμμα περιήγησης. Το έξυπνο λογισμικό με προγραμματιζόμενες ρυθμίσεις και αυτόματη καταγραφή δεδομένων εξασφαλίζει βέλτιστες ρυθμίσεις κατεργασίας με υπερήχους για αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Η σαφής και εύχρηστη διεπαφή του μενού καθιστά τις συσκευές υπερήχων της Hielscher φιλικές προς τον χρήστη και αποδοτικές.
Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των εργαστηριακών συσκευών υπερήχων μας, οι οποίες είναι ιδανικές για εργασίες προετοιμασίας δειγμάτων, όπως ο κατακερματισμός DNA και RNA, η κυτταρική λύση και η εκχύλιση πρωτεϊνών:
| Συσκευή | Ισχύς [W] | Τύπος | Όγκος [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | για μικροπλάκες | 6 – 3456 βοθρία | VialTweeter | 200 | για έως και 10 φιαλίδια, με επιπλέον δυνατότητα στερέωσης με σφιγκτήρα | 0,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | τύπου καθετήρα | 0,01 – 250 |
| UP100H | 100 | τύπου καθετήρα | 0,01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | τύπου καθετήρα | 0,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | τύπου καθετήρα | 0,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | τύπου καθετήρα | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, ηχοαντιδραστήρας | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | κυψελίδα ροής χωρίς επιμόλυνση |
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Η μονάδα προετοιμασίας πολλαπλών δειγμάτων με υπερήχους VialTweeter επιτρέπει την ταυτόχρονη κατεργασία έως και 10 φιαλιδίων με υπερήχους. Με τη διάταξη σύσφιξης VialPress, έως και 4 επιπλέον σωληνάρια μπορούν να πιεστούν στην εμπρόσθια επιφάνεια για έντονη κατεργασία με υπερήχους.
Το ηχοτρόδιο MTP-24-8-96 διαθέτει οκτώ καθετήρες υπερήχων για την κατεργασία των βοθρίων πλακών μικροτιτλοδότησης με υπερήχους.
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Wang Y., Joshu C.E., Curtis S.D., Douville C., Burk V.A., Ru M., Popoli M., Ptak J., Dobbyn L., Silliman N., Coresh J., Boerwinkle E., Prizment A., Bettegowda C., Kinzler K.W., Papadopoulos N., Platz E.A., Vogelstein B. (2025): Detection of cancers three years prior to diagnosis using plasma cell-free DNA. Cancer Discovery 2025 May.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Χρήσιμες πληροφορίες
Τι είναι η αλληλούχηση επόμενης γενιάς;
Η αλληλούχηση επόμενης γενιάς, γνωστή και ως Next Gen Sequencing (NGS), αλληλούχηση υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας ή αλληλούχηση δεύτερης γενιάς, αναφέρεται στην προσέγγιση της μαζικά παράλληλης αλληλούχησης, κατά την οποία πολύ μεγάλες (μαζικές) ποσότητες DNA από εκατομμύρια θραύσματα αλληλουχούνται ταυτόχρονα και παράλληλα σε κάθε κύκλο εκτέλεσης.
Για την πραγματοποίηση αλληλούχησης επόμενης γενιάς, τα τρία βασικά στάδια
- προετοιμασία βιβλιοθήκης,
- αλληλούχηση και
- ανάλυση δεδομένων
είναι απαραίτητα.
Κατά την προετοιμασία της βιβλιοθήκης, οι αλυσίδες DNA πρέπει να κατακερματιστούν σε θραύσματα DNA συγκεκριμένου μήκους. Η κατεργασία με υπερήχους είναι μία από τις προτιμώμενες τεχνικές για τον κατακερματισμό του DNA.
Κατά τη διαδικασία αλληλούχησης του DNA προσδιορίζεται η σειρά των νουκλεοτιδίων στο DNA – γνωστή ως αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος. Η αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος αποτελείται από τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις – αδενίνη, κυτοσίνη, γουανίνη, θυμίνη – οι οποίες κωδικοποιούν πληροφορίες.
Η αλληλούχηση επόμενης γενιάς προωθεί την έρευνα στις βιοεπιστήμες και την εξατομικευμένη ιατρική, καθώς η αλληλούχηση DNA και RNA χρησιμοποιείται εκτενώς στη γονιδιωματική έρευνα, στην έρευνα για τον καρκίνο, στην έρευνα σπάνιων και σύνθετων ασθενειών, στη μικροβιακή έρευνα, στην αγρογονιδιωματική και σε πολλά άλλα ερευνητικά πεδία.
Αλληλούχηση επόμενης γενιάς έναντι αλληλούχησης Sanger
Ενώ με την αλληλούχηση νέας γενιάς (NGS) είναι δυνατή η αλληλούχηση τεράστιου αριθμού γονιδιωματικών δειγμάτων, η αλληλούχηση Sanger (γνωστή και ως μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας ή αλληλούχηση πρώτης γενιάς) έχει τη δυνατότητα αλληλούχησης μόνο μικρού αριθμού δειγμάτων. Η αλληλούχηση Sanger προσδιορίζει την αλληλουχία μόνο ενός θραύσματος DNA κάθε φορά και μπορεί να ολοκληρωθεί σε μία μόνο ημέρα. Λόγω της ακρίβειάς της, η αλληλούχηση Sanger θεωρείται επίσης η τεχνολογία αναφοράς, η οποία χρησιμοποιείται για την επαλήθευση αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με αλληλούχηση νέας γενιάς.
Η αλληλούχηση Sanger επιτυγχάνει μήκη ανάγνωσης περίπου 800bp (συνήθως 500–600bp με μη εμπλουτισμένο DNA). Τα μεγαλύτερα μήκη ανάγνωσης στην αλληλούχηση Sanger παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων αλληλούχησης, ιδίως ως προς την αλληλούχηση επαναλαμβανόμενων περιοχών του γονιδιώματος. Οι δυσκολίες που σχετίζονται με τα δεδομένα αλληλούχησης σύντομων αναγνώσεων αποτελούν ιδιαίτερο πρόβλημα κατά την αλληλούχηση νέων γονιδιωμάτων (de novo) και κατά την αλληλούχηση τμημάτων του γονιδιώματος με εκτεταμένες αναδιατάξεις, όπως εκείνα που παρατηρούνται συνήθως σε καρκινικά γονιδιώματα ή σε περιοχές χρωμοσωμάτων που εμφανίζουν δομική ποικιλότητα. [cp. Morozova and Marra, 2008]
DNA – Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ – Οι μορφές και οι λειτουργίες του
Κάθε μορφή DNA έχει μοναδικά χαρακτηριστικά και εφαρμογές, συμβάλλοντας σε ένα ευρύ φάσμα ερευνητικών πεδίων, όπως η ογκολογία, η γενετική, η εγκληματολογική επιστήμη και η εξελικτική βιολογία. Οι συσκευές υπερήχων Hielscher αποτελούν μια εξαιρετικά αποδοτική και αξιόπιστη λύση για την απομόνωση και τον κατακερματισμό DNA και RNA για τους σκοπούς των αναλύσεών σας. Στον παρακάτω κατάλογο εξηγούμε τις συγκεκριμένες μορφές DNA και τις ταξινομούμε με βάση το βιολογικό τους πλαίσιο και τις λειτουργίες τους:
- Γονιδιωματικό DNA (gDNA)
Γονιδιωματικό DNA (gDNA): Το πλήρες σύνολο του DNA ενός οργανισμού, το οποίο περιλαμβάνει τόσο κωδικοποιητικές (γονίδια) όσο και μη κωδικοποιητικές περιοχές. - Εξωκυτταρικό DNA
Κυκλοφορούν καρκινικό DNA (ctDNA): Θραύσματα DNA που απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος από καρκινικά κύτταρα.
Ελεύθερο κυττάρων DNA (cfDNA): Θραύσματα DNA που κυκλοφορούν ελεύθερα στο αίμα και προέρχονται από διάφορους ιστούς. - Εξωχρωμοσωμικό κυκλικό DNA (eccDNA): Κυκλικά μόρια DNA που βρίσκονται εκτός των χρωμοσωμάτων στα ευκαρυωτικά κύτταρα.
Ιικό DNA: DNA που προέρχεται από ιούς, είτε ενσωματωμένο στο γονιδίωμα του ξενιστή είτε ως επισωματικό DNA. - Μιτοχονδριακό DNA
Μιτοχονδριακό DNA (mtDNA): DNA που βρίσκεται στα μιτοχόνδρια, κληρονομείται από τη μητέρα και συμμετέχει στην παραγωγή ενέργειας. - Πλασμιδιακό DNA
Πλασμιδιακό DNA: Μικρά, κυκλικά μόρια DNA που αντιγράφονται ανεξάρτητα από το χρωμοσωμικό DNA, απαντούν συνήθως στα βακτήρια και χρησιμοποιούνται στη γενετική μηχανική. - Πυρηνικό DNA
Πυρηνικό DNA (nDNA): DNA που περιέχεται στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων και αποτελεί το μεγαλύτερο μέρος του γενετικού υλικού ενός οργανισμού. - DNA μεμονωμένου κυττάρου
DNA μεμονωμένου κυττάρου (scDNA): DNA που εξάγεται από ένα μεμονωμένο κύτταρο και χρησιμοποιείται για λεπτομερή γονιδιωματική ανάλυση σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου. - Ανασυνδυασμένο DNA
Ανασυνδυασμένο DNA (rDNA): Μόρια DNA που σχηματίζονται με εργαστηριακές μεθόδους γενετικού ανασυνδυασμού για τη συνένωση γενετικού υλικού από πολλαπλές πηγές. - Εξειδικευμένες μορφές
Περιβαλλοντικό DNA (eDNA): DNA που συλλέγεται από περιβαλλοντικά δείγματα (έδαφος, νερό) χωρίς απομόνωση των οργανισμών από τους οποίους προέρχεται
Αρχαίο DNA (aDNA): DNA που εξάγεται από αρχαία δείγματα, παρέχοντας γνώσεις για την εξελικτική βιολογία και τους αρχαίους πληθυσμούς. - Χρωμοσωμικό DNA
Χρωμοσωμικό DNA: DNA που συγκροτεί τα χρωμοσώματα μέσα στον κυτταρικό πυρήνα και περιλαμβάνει τόσο κωδικοποιητικές όσο και μη κωδικοποιητικές περιοχές. - Ιικές και συνθετικές μορφές
Ιικό DNA: DNA που προέρχεται από ιούς και μπορεί είτε να είναι ενσωματωμένο στα γονιδιώματα των ξενιστών είτε να υπάρχει ως ανεξάρτητη οντότητα.
Συνθετικό DNA: Τεχνητά συντιθέμενες αλληλουχίες DNA που δημιουργούνται μέσω χημικών διεργασιών και χρησιμοποιούνται συχνά στην έρευνα και τη βιοτεχνολογία.
Η Hielscher Ultrasonics κατασκευάζει ομογενοποιητές υπερήχων υψηλής απόδοσης από εργαστηριακό έως βιομηχανικό μέγεθος.