Υπερήχων εκχύλιση πρωτεΐνης από καλλιέργειες ιστών και κυττάρων
- Η εκχύλιση πρωτεΐνης είναι ένα βασικό στάδιο προετοιμασίας δείγματος στην πρωτεομική.
- Οι πρωτεΐνες μπορούν να εξαχθούν από φυτικούς και ζωικούς ιστούς, ζύμες και μικροοργανισμούς.
- Κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη, αποτελεσματική μέθοδος εκχύλισης πρωτεϊνών που δίνει υψηλές αποδόσεις πρωτεϊνών μέσα σε σύντομο χρόνο εκχύλισης.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς και κύτταρα
Η εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα είναι ένα βασικό βήμα προετοιμασίας δείγματος που εκτελείται κατά τη διάρκεια πολλών βιοχημικών και αναλυτικών τεχνικών όπως ELISA, PAGE, Western blotting, φασματομετρία μάζας ή καθαρισμός πρωτεϊνών. Υπερήχων κυτταρική διαταραχή, λύση και εκχύλιση είναι μια ακριβώς ελεγχόμενη, μη θερμική τεχνική για την εξασφάλιση υψηλών αποδόσεων των πρωτεϊνών.
Η εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα με το υπερηχητικός καθετήρας UP200St
- Ταχύς
- υψηλές αποδόσεις
- Υψηλή απόδοση
- Ακριβής έλεγχος των παραμέτρων
- Αναπαραγώγιμα αποτελέσματα
- γραμμική επεκτασιμότητα
Γενικές οδηγίες για υπερήχων λύση και εκχύλιση πρωτεϊνών
- Έλεγχος θερμοκρασίας: Για να εξασφαλιστεί υψηλή απόδοση πρωτεϊνών χωρίς θερμική μετουσίωση, πρέπει να ελέγχεται η θερμοκρασία κατά την εκχύλιση. Hielscher's state-of-art ομογενοποιητές υπερήχων – Ονομάζεται επίσης υπερήχων αποσυνθέτης ή υπερήχων – είναι ακριβώς ελεγχόμενα. Έρχονται με αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης. Στις επιλογές ρύθμισης του ομογενοποιητή υπερήχων, μπορεί να ρυθμιστεί μια μέγιστη θερμοκρασία. Όταν επιτευχθεί αυτή η μέγιστη θερμοκρασία, ο υπερηχητικός σταματά αυτόματα μέχρι να κρυώσει το δείγμα.
- Ρυθμιστικό διάλυμα: Η επιλογή ενός κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος και ο σωστός όγκος ρυθμιστικού διαλύματος ποικίλλει από ιστό σε ιστό και πρέπει να υπολογιστεί με δοκιμές δοκιμής και σφάλματος.
- Απομόνωση / καθαρισμός: Τα προϊόντα λύσης πρωτεϊνών μπορεί να περιέχουν περίσσεια βιομορίων όπως DNA ή υδατάνθρακες, τα οποία μπορούν να απομακρυνθούν με καθίζηση πρωτεϊνών (δεοξυχολικό-τριχλωροξικό οξύ) ή ανταλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος.
Οι Chittapalo και Noomhorm (2009) ανέφεραν στη μελέτη τους ότι η απόδοση πρωτεϊνών αυξήθηκε χρησιμοποιώντας υπερήχους και ότι η διαδικασία ομογενοποίησης και λύσης υπερήχων ιστού μπορεί να ενισχύσει σημαντικά τις υπάρχουσες διαδικασίες εκχύλισης – επιτρέποντας νέες εμπορικές ευκαιρίες εξόρυξης.
Υπερήχων CupHorn για την ταυτόχρονη, εξαιρετικά αποτελεσματική προετοιμασία δείγματος πολλαπλών δειγμάτων υπό τις ίδιες συνθήκες για απομόνωση πρωτεϊνών και κατακερματισμό DNA.
Εκχύλιση πρωτεΐνης από ζωικό ιστό
Για την παρασκευή ιστού πλήρους μεγέθους (π.χ. νεφρών, καρδιάς, πνευμόνων, μυών κ.λπ.), ο ιστός θα πρέπει να τεμαχίζεται σε πολύ μικρά κομμάτια με καθαρά εργαλεία, κατά προτίμηση σε πάγο, και όσο το δυνατόν γρηγορότερα για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση από πρωτεάσες (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα λύσης όπως RIPA ή ρυθμιστικό διάλυμα υποτονικής λύσης που περιέχει κοκτέιλ πρωτεάσης και αναστολέα φωσφατάσης). Μετά την ανατομή, το δείγμα βυθίζεται σε υγρό άζωτο για γρήγορη κατάψυξη. Το δείγμα μπορεί να αποθηκευτεί στους -80°C για μεταγενέστερη χρήση ή να διατηρηθεί σε πάγο για άμεση ομογενοποίηση. Αμέσως πριν από την εκχύλιση με υπερήχους, συνιστάται παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (με αναστολείς πρωτεάσης DTT, λευκεπτίνη και απροτινίνη) στο σωλήνα δείγματος (ανά ~ 10 mg ιστού περίπου ~ 600 μL ρυθμιστικού διαλύματος συνιστώνται). Περίπου 20-60mg ιστού συνιστώνται ανά σωλήνα δείγματος.
Υπερήχων ομογενοποίηση, λύση και εκχύλιση πραγματοποιείται με έναν υπερηχητικό ομογενοποιητή όπως το UP100H ή UP200Ht, εξοπλισμένο με ένα sonotrode μικρο-άκρη. Η διάρκεια κατεργασίας με υπερήχους είναι 60-90 sec. σε λειτουργία κύκλου υπερήχων 15 sec. υπερήχηση και 10 sec. χρόνος ανάπαυσης. Το δείγμα πρέπει να διατηρείται συνεχώς σε πάγο.
Μετά από ομογενοποίηση / εκχύλιση με υπερήχους, το προϊόν λύσης φυγοκεντρείται στα 27.000g για περίπου 20 λεπτά. Στη συνέχεια συλλέγεται το υπερκείμενο υγρό, έτσι ώστε η συγκέντρωση πρωτεΐνης να μπορεί να προσδιοριστεί με μια πρωτεϊνική δοκιμασία όπως η πρωτεϊνική δοκιμασία BCA του Pierce.
Εκχύλιση πρωτεΐνης από ορό αίματος
Για ένα ομοιογενές μείγμα του ορού και του φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος, το δείγμα στροβιλίζεται πρώτα πριν από την υπερηχητική κυτταρική λύση. Για την υπερηχητική λύση, το δείγμα υποβάλλεται σε υπερήχους με έναν ομογενοποιητή εργαστηρίου υπερήχων όπως το UP100H για 8 κύκλους σε πλάτος 20%, για κύκλους κάθε 5 δευτερολέπτων και 15 δευτερολέπτων μακριά. Η εκχύλιση πρωτεϊνών πραγματοποιείται με υπερήχηση σε κύκλους (λειτουργία παλμών) και τοποθετώντας το δείγμα σε πάγο έτσι ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση και η θερμική αποικοδόμηση του δείγματος. Δεδομένου ότι ο ορός περιέχει μεγάλη ποσότητα πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους (όπως λευκωματίνη, α1-αντιθρυψίνη, τρανσφερίνη, απτοσφαιρίνη, ανοσοσφαιρίνη G και ανοσοσφαιρίνη Α), οι οποίες παρεμβαίνουν στον διαχωρισμό πρωτεϊνών χαμηλού μοριακού βάρους κατά τη διάρκεια της IEF, συνιστάται η εξάντλησή τους από τον ορό χρησιμοποιώντας μια στήλη εξάντλησης.
Εκχύλιση πρωτεΐνης από φυτικό ιστό
Φρέσκος, μαλακός φυτικός ιστός, π.χ. βρύα κ.λπ., μπορεί εύκολα να διαταραχθεί απλά τοποθετώντας το τεμαχισμένο υλικό δείγματος σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για υπερήχους. Σκληροί, λιγνώδεις φυτικοί ιστοί, όπως σπόροι, βελόνες ελάτης κ.λπ., πρέπει να αλέθονται στεγνά. Ορισμένα σκληρά, ξυλώδη φυτικά υλικά πρέπει να καταψυχθούν και να αλεσθούν σε υγρό άζωτο πριν εξαχθούν με υπερήχους. Για εναιωρήματα καλλιέργειας φυτικών κυττάρων, μια υπερηχητική θεραπεία μεταξύ 30 και 150 δευτερολέπτων σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης είναι ως επί το πλείστον επαρκής. Σκληρότερο υλικό όπως οι σπόροι κολοκύθας απαιτούν μια πιο έντονη υπερήχηση όπως περιγράφεται παρακάτω.
Πρωτόκολλο για υπερήχων εκχύλιση της αλβουμίνης από σπόρους κολοκύθας
Για την εκχύλιση με υπερήχων πρωτεΐνης λευκωματίνης από λεπτή σκόνη σπόρου κολοκύθας, προστίθενται 10 g απολιπανθείσας σκόνης σπόρου κολοκύθας και 100 mL απιονισμένου νερού ως διαλύτη σε γυάλινο ποτήρι ζέσεως 250mL. Η εκχύλιση πρωτεΐνης αποτελείται από δύο στάδια: Πρώτον, το δείγμα υποβάλλεται σε υπερήχους με ένας υπερηχητικός τύπος καθετήρα UP400St (400W, 24kHz) εξοπλισμένος με sonotrode S24d7. Το γυάλινο ποτήρι ζέσεως τοποθετείται σε λουτρό κρύου νερού κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης υπερήχων. Ο pluggable αισθητήρας θερμοκρασίας και οι ρυθμίσεις ελέγχου θερμοκρασίας του υπερήχων UP400St εξασφαλίζουν ότι η θερμοκρασία δείγματος διατηρείται πάντα κάτω από 30 ° C. Με τον ακριβή έλεγχο θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της υπερήχησης, αποφεύγεται η μετουσίωση της λευκωματίνης. Δεύτερον, η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με μίξερ στις στροφές 200 rpm και στους 30°C. Στη συνέχεια, το ποτήρι ζέσεως μεταφέρεται σε θερμοστατικό αναδευτήρα. Η σφαιρίνη απομακρύνεται μέσω αιμοκάθαρσης με απεσταγμένο νερό. Μετά την απομάκρυνση της σφαιρίνης, μπορεί να ληφθεί δείγμα από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα για τον προσδιορισμό του προφίλ λευκωματίνης και στη συνέχεια ρυθμίζεται σε pI=3,0 χρησιμοποιώντας 0,1 M HCl για πήξη λευκωματίνης. Η στερεά φάση διαχωρίζεται με φυγοκέντρηση στα 5000g, 20°C και επαναδιαλύεται σε απιονισμένο νερό. Η πήξη της λευκωματίνης εκτελείται δύο φορές για να αυξηθεί η αναλογία πρωτεϊνών στο συμπύκνωμα λευκωματίνης.
Υπερήχων αλκαλική πρωτεΐνη εκχύλιση για την παρασκευή συμπυκνώματος πρωτεΐνης από πίτουρο ρυζιού δείχνει ότι η υπερήχων θεραπεία οδηγεί σε υψηλότερη απόδοση πρωτεΐνης σε σημαντικά μικρότερο χρόνο εκχύλισης – σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους εκχύλισης.
Πρωτόκολλο προετοιμασίας δείγματος για λειτουργικό ένζυμο iNOS
Για να ληφθεί πλήρως λειτουργικό ένζυμο iNOS (π.χ. για έλεγχο φαρμάκων), συνιστάται το ακόλουθο πρωτόκολλο: Το κυτταρικό εναιώρημα πρέπει να τοποθετείται σε πάγο και υποβάλλεται σε υπερήχους με UP100H σε πλάτος 10μm σε λειτουργία κύκλου 5 sec. υπερήχηση και 25 sec. ανάπαυση στον πάγο. Η διαδικασία πρέπει να επαναληφθεί περίπου 3 φορές. Ο χρόνος ανάπαυσης μεταξύ των κύκλων υπερήχων μειώνει την αύξηση της θερμοκρασίας και επομένως θα μειώσει τον κίνδυνο μετουσίωσης.
Διαλυτοποίηση πρωτεϊνών υπερήχων
Κατεργασία με υπερήχους μπορεί να επιταχύνει τη διαδικασία διαλυτοποίησης πρωτεϊνών, η οποία συνήθως απαιτεί αρκετές ώρες. Προκειμένου να μην υπερθερμανθεί το δείγμα και να αποφευχθεί η αποικοδόμηση πρωτεϊνών και οι τροποποιήσεις σε διαλύματα που περιέχουν ουρία, οι εκρήξεις υπερήχων δεν πρέπει να διαρκούν περισσότερο από λίγα δευτερόλεπτα.
Υπερήχων UP200Ht με 2mm microtip S26d2 για την υπερήχηση μικρών δειγμάτων.
Υπερήχων εξοπλισμός για την εκχύλιση πρωτεϊνών
Hielscher Υπέρηχοι προσφέρουν ένα ευρύ φάσμα υπερήχων ομογενοποιητές για την αποσύνθεση των κυττάρων, ιστούς, βακτήρια, μικροοργανισμούς, ζύμη, και σπόρια.
Hielscher εργαστήριο υπερήχων είναι ισχυρό και εύκολο να λειτουργήσει. Κατασκευασμένες για 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα λειτουργία, έχουν σχεδιαστεί ως στιβαρές και αποτελεσματικές εργαστηριακές και επιτραπέζιες συσκευές. Για όλες τις συσκευές, η έξοδος ενέργειας και το πλάτος μπορούν να ελεγχθούν με ακρίβεια. Η ευρεία γκάμα αξεσουάρ ανοίγει περαιτέρω επιλογές ρύθμισης. Οι ψηφιακοί υπερήχων όπως το VialTweeter, UP200Ht, UP200St, και UP400St διαθέτουν ενσωματωμένο έλεγχο θερμοκρασίας και ενσωματωμένη κάρτα SD για αυτόματη καταγραφή δεδομένων.
Για την έμμεση, χωρίς διασταυρούμενη μόλυνση και ταυτόχρονη υπερήχηση πολλαπλών δειγμάτων, προσφέρουμε το VialTweeter ή το υπερηχητικό CupHorn.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια επισκόπηση των υπερήχων μας για την προετοιμασία του δείγματος, κυτταρική διαταραχή και εκχύλιση. Κάντε κλικ στον τύπο της συσκευής για να λάβετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με κάθε ομογενοποιητή υπερήχων. Το καλά εκπαιδευμένο και μακροχρόνιο τεχνικό προσωπικό μας θα χαρεί να σας βοηθήσει να επιλέξετε τον καταλληλότερο υπερηχητικό για την προετοιμασία του δείγματός σας!
| Όγκος παρτίδας | Ροή | Προτεινόμενες συσκευές |
|---|---|---|
| έως 10 φιαλίδια ή σωληνάρια | μ.δ. | VialTweeter |
| πλάκες multiwell / microtiter | μ.δ. | UIP400MTP |
| πολλαπλοί σωλήνες / δοχεία | μ.δ. | Cuphorn |
| 1 έως 500mL | 10 έως 200mL/min | UP100Η |
| 10 έως 1000mL | 20 έως 200mL / λεπτό | UP200Ht, UP200St |
| 10 έως 2000mL | 20 έως 400mL / λεπτό | UP400St |
Ανάλογα με την εφαρμογή, το υλικό και τον όγκο του δείγματός σας, θα σας προτείνουμε την πιο κατάλληλη ρύθμιση για την προετοιμασία του δείγματός σας. Επικοινωνήστε μαζί μας σήμερα!
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Hielscher ψηφιακή υπερήχων διαθέτουν ένα τηλεχειριστήριο του προγράμματος περιήγησης και αυτόματη πρωτόκολλο δεδομένων σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD.
VialTweeter για έμμεση υπερήχηση.
Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζετε
πρωτεομική
Πρωτεομική είναι το ερευνητικό πεδίο που διερευνά τις πρωτεΐνες και το πρωτέωμα. Οι πρωτεΐνες καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα ζωτικών λειτουργιών μέσα στους οργανισμούς. Το πρωτέωμα είναι ολόκληρο το σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζονται από ένα γονιδίωμα, κύτταρο, ιστό ή οργανισμό σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή. Το πρωτέωμα ποικίλλει ανάλογα με το χρόνο και τις διακριτές απαιτήσεις, ή πιέσεις, που υφίσταται ένα κύτταρο ή ένας οργανισμός. Πιο συγκεκριμένα, είναι το σύνολο των εκφρασμένων πρωτεϊνών σε έναν δεδομένο τύπο κυττάρου ή οργανισμού, σε μια δεδομένη στιγμή, υπό καθορισμένες συνθήκες. Ο όρος είναι ένα μείγμα πρωτεϊνών και γονιδιώματος. Πρωτεομική είναι η μελέτη του πρωτεώματος.
πρωτεΐνη
Οι πρωτεΐνες είναι μεγάλα βιομόρια, τα λεγόμενα μακρομόρια – τα οποία αποτελούνται από μία ή περισσότερες μακριές αλυσίδες υπολειμμάτων αμινοξέων. Οι πρωτεΐνες υπάρχουν σε όλους τους οργανισμούς τόσο φυτικής όσο και ζωικής προέλευσης και είναι ζωτικής σημασίας για τις περισσότερες βιολογικές λειτουργίες. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες περιέχουν πολλές βιολογικές πληροφορίες, εξάγονται για αναλυτικούς σκοπούς, π.χ. για πρωτεομική έρευνα. Η πιο σημαντική λειτουργία που εκτελείται από τις πρωτεΐνες περιλαμβάνει την κατάλυση των μεταβολικών αντιδράσεων, την αντιγραφή του DNA, την απόκριση σε ερεθίσματα και τη μεταφορά μορίων από τη μία θέση στην άλλη. Οι πρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους κυρίως στην αλληλουχία των αμινοξέων, η οποία υπαγορεύεται από την αλληλουχία νουκλεοτιδίων των γονιδίων τους και η οποία συνήθως οδηγεί σε αναδίπλωση πρωτεϊνών σε μια συγκεκριμένη τρισδιάστατη δομή που καθορίζει τη δραστηριότητά της. Οι πρωτεΐνες είναι – εκτός από τα πεπτίδια – ένα από τα βασικά συστατικά των τροφίμων. Ως εκ τούτου, η πρωτεομική είναι ένα ισχυρό εργαλείο στην επιστήμη των τροφίμων για τη βελτιστοποίηση των διαδικασιών, της ασφάλειας των τροφίμων και της διατροφικής αξιολόγησης.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction είναι μια προαναλυτική διαδικασία για τον διαχωρισμό και την προσυγκέντρωση των αναλυτέων ουσιών. Σε συνδυασμό με υπερήχους, η εξαγωγή σημείου σύννεφων μπορεί να εντατικοποιηθεί καθιστώντας τη διαδικασία πιο αποτελεσματική, ταχύτερη και φιλικότερη προς το περιβάλλον. Με υπερήχους, η εκχύλιση σημείου σύννεφων είναι μια σημαντικά πιο αποτελεσματική μέθοδος παρασκευής αναλυτέας ουσίας. Διαβάστε περισσότερα σχετικά με την υπερηχητικά υποβοηθούμενη εξαγωγή σημείου σύννεφων!Ηλεκτροφόρηση γέλης
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι η κύρια μέθοδος διαχωρισμού και ανάλυσης μακρομορίων όπως DNA, RNA και πρωτεϊνών καθώς και των θραυσμάτων τους, με βάση το μέγεθος και το φορτίο τους. Χρησιμοποιείται στην κλινική χημεία για να διαχωρίσει τις πρωτεΐνες κατά φορτίο ή / και μέγεθος (IEF αγαρόζη, ουσιαστικά ανεξάρτητη από το μέγεθος) και στη βιοχημεία, τη μοριακή βιολογία και την πρωτεομική για να διαχωρίσει έναν μικτό πληθυσμό θραυσμάτων DNA και RNA κατά μήκος, για να εκτιμήσει το μέγεθος θραυσμάτων DNA και RNA ή για να διαχωρίσει πρωτεΐνες με φορτίο.
κυτταροκαλλιέργειες
Η κυτταροκαλλιέργεια είναι η ελεγχόμενη διαδικασία ανάπτυξης με την οποία τα κύτταρα καλλιεργούνται υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Οι συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας ποικίλλουν για κάθε τύπο κυττάρου. Γενικά, το περιβάλλον μιας κυτταροκαλλιέργειας αποτελείται από ένα κατάλληλο δοχείο (π.χ. τρυβλίο Petri) με υπόστρωμα ή μέσο που παρέχει τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά (αμινοξέα, υδατάνθρακες, βιταμίνες, μέταλλα), αυξητικούς παράγοντες, ορμόνες και αέρια (CO2, O2), και ρυθμίζει το φυσικοχημικό περιβάλλον (ρυθμιστικό pH, οσμωτική πίεση, θερμοκρασία). Τα περισσότερα κύτταρα χρειάζονται επιφανειακό ή τεχνητό υπόστρωμα, ενώ άλλες κυτταροκαλλιέργειες μπορούν να καλλιεργηθούν ελεύθερα σε υπόστρωμα καλλιέργειας (καλλιέργεια εναιωρήματος, κυτταρικό εναιώρημα).
Οι μαζικές καλλιέργειες ζωικών κυτταρικών σειρών χρησιμοποιούνται στη βιομηχανική παραγωγή ιικών εμβολίων και άλλων βιοτεχνολογικά παραγόμενων προϊόντων. Τα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα καλλιεργούνται για να επεκτείνουν τον αριθμό των κυττάρων και να διαφοροποιήσουν τα κύτταρα σε διάφορους τύπους σωματικών κυττάρων για σκοπούς μεταμόσχευσης.
Δείγματα ιστών
Ο όρος ιστός περιγράφει ένα κυτταρικό ενδιάμεσο, όπου το κυτταρικό υλικό βρίσκεται σε οργανωτικό επίπεδο μεταξύ κυττάρων και ενός πλήρους οργάνου. Στον ιστό, συναρμολογούνται παρόμοια κύτταρα, από την ίδια προέλευση που μαζί εκτελούν μια συγκεκριμένη λειτουργία. Με τη λειτουργική ομαδοποίηση πολλαπλών ιστών, σχηματίζονται οι σύνθετες δομές των οργάνων.
Γίνεται δειγματοληψία ιστού για έρευνα στη βιολογία, ιστολογία/ιστοπαθολογία, παρασιτολογία, βιοχημεία, ανοσοϊστοχημεία καθώς και για καλλιέργεια και εξαγωγή DNA. Μπορεί να διακριθεί μεταξύ ζωικού (υποδιαίρεση: ιστός θηλαστικών) και φυτικού ιστού. Οι ζωικοί ιστοί ομαδοποιούνται στους τέσσερις βασικούς τύπους συνδετικού, μυϊκού, νευρικού και επιθηλιακού ιστού. Ο φυτικός ιστός υποδιαιρείται στα ακόλουθα τρία συστήματα ιστών: την επιδερμίδα, τον ιστό εδάφους και τον αγγειακό ιστό.
Δείγματα ιστών μπορούν να παρασκευαστούν από μέρη ζώων ή φυτών, π.χ. οστά, μύες, φύλλα κ.λπ.
Σωματικά υγρά
Το αίμα, ο ορός, το πλάσμα, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, το σάλιο και το αρθρικό υγρό είναι σωματικά υγρά, τα οποία προσφέρουν μια μεγάλη πηγή διαγνωστικά σχετικών πληροφοριών. Ως εκ τούτου, μια εξελιγμένη προετοιμασία δειγμάτων σωματικών υγρών για ανάλυση είναι σημαντική. Η πρώτη δυσκολία σχετίζεται με το ευρύ δυναμικό φάσμα των συστατικών που υπάρχουν στα σωματικά υγρά.
Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών
Η δοκιμασία Bradford, η δοκιμασία Lowry και η δοκιμασία bicinchoninic acid (BCA) είναι κοινές δοκιμασίες για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεϊνών. Η αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) είναι ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα πρότυπα πρωτεΐνης.
ρυθμιστικό διάλυμα λύσης
Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πρέπει να επιλέγεται σύμφωνα με το κυτταρικό υλικό ή τον ιστό (ιστοκαλλιέργεια, φυτό, βακτήρια, μύκητες κ.λπ.) και εάν τα κύτταρα βρίσκονται σε δομή και τον τύπο της δομής. Ένα ευρύ φάσμα ρυθμιστικών διαλυμάτων λύσης για την εκχύλιση πρωτεϊνών, μεμβρανών και οργανιδίων παρασκευάζονται με ένα ή περισσότερα απορρυπαντικά. Το απορρυπαντικό επιλέγεται συνήθως μέσω δοκιμών δοκιμής και σφάλματος ή – εάν είναι διαθέσιμο – σύμφωνα με ένα υπάρχον πρωτόκολλο εκχύλισης πρωτεΐνης. Το απορρυπαντικό πρέπει να είναι συμβατό με την πηγή ιστού και τις πρωτεΐνες. Γενικά, το ηπιότερο απορρυπαντικό που λειτουργεί για έναν συγκεκριμένο ιστό / πρωτεΐνη, επιλέγεται προκειμένου να διατηρηθεί η μέγιστη λειτουργικότητα του εκχυλίσματος. Επιπλέον, σε περίπτωση εκχύλισης μεμβρανών και οργανιδίων, ένα ήπιο απορρυπαντικό διατηρεί ανέπαφη τη μεμβράνη. Τα απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται συνήθως στα ρυθμιστικά διαλύματα λύσης είναι ως επί το πλείστον μη ιονικά ή zwitterionic, π.χ. CHAPS, δεοξυχολικό, Triton™ X-100, NP40 και Tween 20.
Για παράδειγμα, ιστοί όπως ο εγκέφαλος, το ήπαρ, το έντερο, τα νεφρά, ο σπλήνας κ.λπ. μπορούν απλά να ρυθμιστούν με RIPA – Ωστόσο, θα πρέπει να περιλαμβάνονται αναστολείς πρωτεάσης και DTT (π.χ. για ηλεκτροφόρηση πηκτής).
Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για σκελετικό μυϊκό ιστό (παγωμένο): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) γλυκερόλη, 1 mM EDTA, 1 mM διθειοθρεϊτόλη συμπληρωμένη με κοκτέιλ πρωτεάσης και αναστολέα φωσφατάσης
Πίνακας κοινών ρυθμιστικών διαλυμάτων και του εύρους pH τους. Γενικά, αυτά τα ρυθμιστικά διαλύματα χρησιμοποιούνται συνήθως σε συγκεντρώσεις 20-50 mM.
| ρυθμιστικό διάλυμα | Εύρος pH |
|---|---|
| Κιτρικό οξύ – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Κιτρικό νάτριο – Κιτρικό οξύ | 3.0 – 6.2 |
| Οξικό νάτριο – οξικό οξύ | 3.6 – 5.6 |
| Άλας νατρίου με κακοδυλικό οξύ – HCl | 5.0 – 7.4 |
| ΜΕΣ – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Δισόξινο φωσφορικό νάτριο – όξινο φωσφορικό δινάτριο | 5.8 – 8.0 |
| ιμιδαζόλιο – HCl | 6.2 – 7.8 |
| ΣΦΟΥΓΓΑΡΊΣΤΡΕΣ – ΚΟΗ | 6.6 – 7.8 |
| Υδροχλωρική τριαιθανολαμίνη – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Τρεισ – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Τρικίνη – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Τετραβορικό νάτριο – βορικό οξύ | 7.6 – 9.2 |
| Μπικίνη – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| γλυκίνη – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Τα περισσότερα ρυθμιστικά διαλύματα παρουσιάζουν εξάρτηση από το pH με τη θερμοκρασία. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα buffer Tris. Το pKa αλλάζει από 8,06 στους 25°C σε 8,85 στους 0°C.
(pH και pKa ενός ρυθμιστικού διαλύματος: Το pH μετρά τη συγκέντρωση ιόντων υδρογόνου σε ένα υδατικό διάλυμα. Το pKa (= σταθερά διάστασης οξέος) είναι ένα σχετικό, αλλά πιο συγκεκριμένο μέτρο, καθώς βοηθά στην πρόβλεψη του τρόπου με τον οποίο ένα μόριο θα δράσει σε μια συγκεκριμένη τιμή pH.)
TRIzol
Το TRIzol είναι ένα χημικό διάλυμα που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση RNA/DNA/πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της εκχύλισης θειοκυανικού-φαινόλης-χλωροφορμίου γουανιδινίου. Η χρήση υπερήχων υποβοηθούμενη εκχύλιση TRIzol έχει ως αποτέλεσμα υψηλές αποδόσεις DNA, RNA και πρωτεϊνών από το ίδιο δείγμα και υπερέχει με αυτόν τον τρόπο άλλες μεθόδους εκχύλισης.
Βιβλιογραφία/Αναφορές
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.