Εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους από ιστούς και κυτταροκαλλιέργειες
- Η εκχύλιση πρωτεϊνών αποτελεί απαραίτητο στάδιο προετοιμασίας δειγμάτων στην πρωτεωμική.
- Οι πρωτεΐνες μπορούν να εκχυλιστούν από φυτικούς και ζωικούς ιστούς, ζύμες και μικροοργανισμούς.
- Η κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη, αποδοτική μέθοδος εκχύλισης πρωτεϊνών που παρέχει υψηλές αποδόσεις πρωτεϊνών σε σύντομο χρόνο εκχύλισης.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς και κύτταρα
Η εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα αποτελεί απαραίτητο στάδιο προετοιμασίας δειγμάτων που εκτελείται στο πλαίσιο πολλών βιοχημικών και αναλυτικών τεχνικών, όπως η ELISA, η PAGE, η ανοσοαποτύπωση Western, η φασματομετρία μάζας ή ο καθαρισμός πρωτεϊνών. Η κυτταρική διάρρηξη, η λύση και η εκχύλιση με υπερήχους αποτελούν μια μη θερμική τεχνική που μπορεί να ελεγχθεί με ακρίβεια, ώστε να εξασφαλίζονται υψηλές αποδόσεις πρωτεϊνών.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα με τον καθετήρα υπερήχων UP200St
- Ταχεία διαδικασία
- Υψηλές αποδόσεις
- Υψηλή αποδοτικότητα
- Ακριβής έλεγχος των παραμέτρων
- Αναπαραγώγιμα αποτελέσματα
- Γραμμική δυνατότητα κλιμάκωσης
Γενικές οδηγίες για τη λύση και την εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους
- Έλεγχος θερμοκρασίας: Για να εξασφαλιστεί υψηλή απόδοση πρωτεϊνών χωρίς θερμική μετουσίωση, η θερμοκρασία κατά την εκχύλιση πρέπει να ελέγχεται. Οι υπερσύγχρονοι ομογενοποιητές υπερήχων της Hielscher – που ονομάζονται επίσης διασπαστές υπερήχων ή συσκευές κατεργασίας με υπερήχους – μπορούν να ελεγχθούν με ακρίβεια. Διαθέτουν συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας. Στις επιλογές ρύθμισης του ομογενοποιητή υπερήχων μπορεί να οριστεί μια μέγιστη θερμοκρασία. Όταν επιτευχθεί αυτή η μέγιστη θερμοκρασία, η συσκευή υπερήχων σταματά αυτόματα μέχρι να ψυχθεί το δείγμα.
- Ρυθμιστικό διάλυμα: Η επιλογή κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος και του σωστού όγκου του διαφέρει από ιστό σε ιστό και πρέπει να προσδιορίζεται μέσω δοκιμών και σφαλμάτων.
- Απομόνωση / καθαρισμός: Τα προϊόντα λύσης που περιέχουν πρωτεΐνες μπορεί να περιέχουν περίσσεια βιομορίων, όπως DNA ή υδατάνθρακες, τα οποία μπορούν να απομακρυνθούν με κατακρήμνιση πρωτεϊνών (δεοξυχολικό άλας–τριχλωροξικό οξύ) ή με αντικατάσταση του ρυθμιστικού διαλύματος.
Οι Chittapalo και Noomhorm (2009) ανέφεραν στη μελέτη τους ότι η απόδοση πρωτεϊνών αυξήθηκε με τη χρήση κατεργασίας με υπερήχους και ότι η διαδικασία ομογενοποίησης και λύσης ιστών με υπερήχους μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τις υφιστάμενες διαδικασίες εκχύλισης – δημιουργώντας νέες ευκαιρίες για εκχύλιση σε εμπορική κλίμακα.
CupHorn υπερήχων για την ταυτόχρονη, ιδιαίτερα αποτελεσματική προετοιμασία πολλαπλών δειγμάτων υπό τις ίδιες συνθήκες, με σκοπό την απομόνωση πρωτεϊνών και τον κατακερματισμό DNA.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από ζωικούς ιστούς
Για την προετοιμασία ολόκληρων ιστών (π.χ. νεφρού, καρδιάς, πνεύμονα, μυός κ.λπ.), ο ιστός πρέπει να τεμαχίζεται σε πολύ μικρά κομμάτια με καθαρά εργαλεία, κατά προτίμηση πάνω σε πάγο, και όσο το δυνατόν ταχύτερα, ώστε να αποφεύγεται η αποικοδόμηση από πρωτεάσες (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα λύσης όπως το RIPA ή υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει μείγμα αναστολέων πρωτεασών και φωσφατασών). Μετά τον τεμαχισμό, το δείγμα εμβαπτίζεται σε υγρό άζωτο για ταχεία κατάψυξη. Το δείγμα μπορεί να αποθηκευτεί στους -80°C για μεταγενέστερη χρήση ή να διατηρηθεί πάνω σε πάγο για άμεση ομογενοποίηση. Αμέσως πριν από την εκχύλιση με υπερήχους, προστίθεται γρήγορα στο σωληνάριο του δείγματος παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (με τους αναστολείς πρωτεασών DTT, λευπεπτίνη και απροτινίνη) (συνιστώνται περίπου ~600 μL ρυθμιστικού διαλύματος ανά ~10 mg ιστού). Συνιστώνται περίπου 20–60mg ιστού ανά σωληνάριο δείγματος.
Η ομογενοποίηση, η λύση και η εκχύλιση με υπερήχους εκτελούνται με ομογενοποιητή υπερήχων όπως ο UP100H ή ο UP200Ht, εξοπλισμένο με ηχοτρόδιο με μικροάκρο. Η διάρκεια της κατεργασίας με υπερήχους είναι 60–90 sec. σε λειτουργία κύκλων υπερήχων με 15 sec. κατεργασίας με υπερήχους και 10 sec. παύσης. Το δείγμα πρέπει να διατηρείται μέσα σε πάγο καθ’ όλη τη διάρκεια.
Μετά την ομογενοποίηση / εκχύλιση με υπερήχους, το προϊόν λύσης φυγοκεντρείται στα 27.000g για περίπου 20 min. Στη συνέχεια συλλέγεται το υπερκείμενο, ώστε η συγκέντρωση πρωτεϊνών να μπορεί να προσδιοριστεί με μια δοκιμασία πρωτεϊνών, όπως η δοκιμασία πρωτεϊνών BCA της Pierce.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από ορό αίματος
Για να επιτευχθεί ομοιογενές μείγμα του ορού και του φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος, το δείγμα αναδεύεται πρώτα σε αναδευτήρα στροβιλισμού πριν από την κυτταρική λύση με υπερήχους. Για τη λύση με υπερήχους, το δείγμα υποβάλλεται σε κατεργασία με υπερήχους με εργαστηριακό ομογενοποιητή υπερήχων, όπως ο UP100H, για 8 κύκλους με πλάτος 20%, με κάθε κύκλο να περιλαμβάνει 5 δευτερόλεπτα λειτουργίας και 15 δευτερόλεπτα παύσης. Η εκχύλιση πρωτεϊνών πραγματοποιείται με κατεργασία με υπερήχους σε κύκλους (παλμική λειτουργία) και με τοποθέτηση του δείγματος σε πάγο, ώστε να αποφεύγονται η υπερθέρμανση και η θερμική αποικοδόμηση του δείγματος. Καθώς ο ορός περιέχει μεγάλη ποσότητα πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους (όπως αλβουμίνη, α1-αντιθρυψίνη, τρανσφερρίνη, απτογλοβουλίνη, ανοσοσφαιρίνη G και ανοσοσφαιρίνη A), οι οποίες παρεμποδίζουν τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών χαμηλού μοριακού βάρους κατά την IEF, συνιστάται η απομάκρυνσή τους από τον ορό με χρήση στήλης απομάκρυνσης.
Εκχύλιση πρωτεϊνών από φυτικό ιστό
Ο φρέσκος, μαλακός φυτικός ιστός, π.χ. βρύα κ.λπ., μπορεί εύκολα να υποστεί διάρρηξη με απλή τοποθέτηση του τεμαχισμένου υλικού του δείγματος σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για κατεργασία με υπερήχους. Οι ανθεκτικοί, ξυλώδεις φυτικοί ιστοί, όπως σπόροι, βελόνες ελάτης κ.λπ., πρέπει να αλέθονται εν ξηρώ. Ορισμένα σκληρά, ξυλώδη φυτικά υλικά πρέπει να καταψύχονται και να αλέθονται σε υγρό άζωτο πριν από την εκχύλισή τους με κατεργασία με υπερήχους. Για εναιωρήματα καλλιεργειών φυτικών κυττάρων, συνήθως αρκεί κατεργασία με υπερήχους διάρκειας μεταξύ 30 και 150 δευτερολέπτων σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα πιο ανθεκτικά υλικά, όπως οι κολοκυθόσποροι, απαιτούν εντονότερη κατεργασία με υπερήχους, όπως περιγράφεται παρακάτω.
Πρωτόκολλο εκχύλισης αλβουμίνης από κολοκυθόσπορους με υπερήχους
Για την εκχύλιση της πρωτεΐνης αλβουμίνης με υπερήχους από λεπτοαλεσμένη σκόνη κολοκυθόσπορων, προστίθενται 10 g απολιπασμένης σκόνης κολοκυθόσπορων και 100 mL απιονισμένου νερού ως διαλύτη σε γυάλινο ποτήρι ζέσεως των 250mL. Η εκχύλιση πρωτεϊνών αποτελείται από δύο στάδια: Αρχικά, το δείγμα υποβάλλεται σε κατεργασία με υπερήχους με συσκευή υπερήχων τύπου καθετήρα UP400St (400W, 24kHz) εξοπλισμένη με ηχοτρόδιο S24d7. Το γυάλινο ποτήρι ζέσεως τοποθετείται σε λουτρό κρύου νερού κατά την ομογενοποίηση με υπερήχους. Ο συνδεόμενος αισθητήρας θερμοκρασίας και οι ρυθμίσεις ελέγχου θερμοκρασίας της συσκευής υπερήχων UP400St διασφαλίζουν ότι η θερμοκρασία του δείγματος διατηρείται πάντα κάτω από 30°C. Με τον ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας κατά την κατεργασία με υπερήχους αποφεύγεται η μετουσίωση της αλβουμίνης. Στο δεύτερο στάδιο, η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με αναμείκτη σε ταχύτητα 200 rpm και στους 30°C. Στη συνέχεια, το ποτήρι ζέσεως μεταφέρεται σε θερμοστατούμενο αναδευτήρα. Η σφαιρίνη απομακρύνεται μέσω διαπίδυσης με απεσταγμένο νερό. Μετά την απομάκρυνση της σφαιρίνης, μπορεί να ληφθεί δείγμα από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα για τον προσδιορισμό του προφίλ της αλβουμίνης και στη συνέχεια το εκχύλισμα ρυθμίζεται σε pI=3,0 με χρήση 0,1 M HCl για την πήξη της αλβουμίνης. Η στερεά φάση διαχωρίζεται με φυγοκέντρηση στα 5000g, στους 20°C, και επαναδιαλύεται σε απιονισμένο νερό. Η πήξη της αλβουμίνης πραγματοποιείται δύο φορές για να αυξηθεί η αναλογία πρωτεΐνης στο συμπύκνωμα αλβουμίνης.
Η αλκαλική εκχύλιση πρωτεϊνών με υπερήχους για την παρασκευή πρωτεϊνικού συμπυκνώματος από πίτουρο ρυζιού δείχνει ότι η κατεργασία με υπερήχους οδηγεί σε υψηλότερη απόδοση πρωτεϊνών σε σημαντικά συντομότερο χρόνο εκχύλισης – σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους εκχύλισης.
Πρωτόκολλο προετοιμασίας δείγματος για λειτουργικό ένζυμο iNOS
Για τη λήψη πλήρως λειτουργικού ενζύμου iNOS (π.χ. για έλεγχο φαρμακευτικών ουσιών), συνιστάται το ακόλουθο πρωτόκολλο: Το κυτταρικό εναιώρημα πρέπει να τοποθετείται σε πάγο και υποβάλλεται σε κατεργασία με υπερήχους με UP100H σε πλάτος 10µm, σε κυκλική λειτουργία με 5 δευτ. κατεργασίας με υπερήχους και 25 δευτ. παύσης σε πάγο. Η διαδικασία πρέπει να επαναλαμβάνεται περίπου 3 φορές. Ο χρόνος παύσης μεταξύ των κύκλων κατεργασίας με υπερήχους μειώνει την αύξηση της θερμοκρασίας και επομένως θα μειώσει τον κίνδυνο μετουσίωσης.
Διαλυτοποίηση πρωτεϊνών με υπερήχους
Η κατεργασία με υπερήχους ενδέχεται να επιταχύνει τη διαδικασία διαλυτοποίησης των πρωτεϊνών, η οποία συνήθως απαιτεί αρκετές ώρες. Για να μην υπερθερμαίνεται το δείγμα και για να αποτρέπονται η αποικοδόμηση και οι τροποποιήσεις των πρωτεϊνών σε διαλύματα που περιέχουν ουρία, οι παλμοί υπερήχων δεν πρέπει να διαρκούν περισσότερο από λίγα δευτερόλεπτα.
Συσκευή υπερήχων UP200Ht με μικροακίδα S26d2 των 2mm για την κατεργασία μικρών δειγμάτων με υπερήχους.
Εξοπλισμός υπερήχων για εκχύλιση πρωτεϊνών
Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει μια ευρεία γκάμα ομογενοποιητών υπερήχων για τη διάσπαση κυττάρων, ιστών, βακτηρίων, μικροοργανισμών, ζυμών και σπορίων.
Οι εργαστηριακές συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι ισχυρές και εύχρηστες. Κατασκευασμένες για λειτουργία 24/7, έχουν σχεδιαστεί ως ανθεκτικές και αποδοτικές εργαστηριακές και επιτραπέζιες συσκευές. Σε όλες τις συσκευές, η αποδιδόμενη ενέργεια και το πλάτος ταλάντωσης μπορούν να ελέγχονται με ακρίβεια. Η ευρεία γκάμα εξαρτημάτων παρέχει πρόσθετες επιλογές διαμόρφωσης. Οι ψηφιακές συσκευές υπερήχων, όπως οι VialTweeter, UP200Ht, UP200St και UP400St, διαθέτουν ενσωματωμένο έλεγχο θερμοκρασίας και ενσωματωμένη κάρτα SD για αυτόματη καταγραφή δεδομένων.
Για την έμμεση και ταυτόχρονη κατεργασία πολλαπλών δειγμάτων με υπερήχους, χωρίς διασταυρούμενη επιμόλυνση, προσφέρουμε το VialTweeter ή το CupHorn υπερήχων.
Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια επισκόπηση των συσκευών υπερήχων μας για την προετοιμασία δειγμάτων, την κυτταρική διάρρηξη και την εκχύλιση. Κάντε κλικ στον τύπο της συσκευής για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με κάθε ομογενοποιητή υπερήχων. Το άρτια εκπαιδευμένο τεχνικό προσωπικό μας, με πολυετή εμπειρία, θα χαρεί να σας βοηθήσει να επιλέξετε την καταλληλότερη συσκευή υπερήχων για την προετοιμασία των δειγμάτων σας!
| Όγκος παρτίδας | Παροχή | Συνιστώμενες συσκευές |
|---|---|---|
| έως 10 φιαλίδια ή σωληνάρια | n.a. | VialTweeter |
| πλάκες πολλαπλών βοθρίων / μικροτιτλοδότησης | n.a. | UIP400MTP |
| πολλαπλά σωληνάρια / δοχεία | n.a. | CupHorn |
| 1 έως 500mL | 10 έως 200mL/min | UP100H |
| 10 έως 1000mL | 20 έως 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 έως 2000mL | 20 έως 400mL/min | UP400St |
Ανάλογα με την εφαρμογή, το υλικό και τον όγκο των δειγμάτων σας, θα σας προτείνουμε την καταλληλότερη διαμόρφωση για την προετοιμασία των δειγμάτων σας. Επικοινωνήστε μαζί μας σήμερα!
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Οι ψηφιακές συσκευές υπερήχων της Hielscher διαθέτουν τηλεχειρισμό μέσω προγράμματος περιήγησης και αυτόματη καταγραφή δεδομένων σε ενσωματωμένη κάρτα SD.
VialTweeter για έμμεση κατεργασία με υπερήχους.
Χρήσιμες πληροφορίες
Πρωτεωμική
Η πρωτεωμική είναι ο ερευνητικός κλάδος που μελετά τις πρωτεΐνες και το πρωτέωμα. Οι πρωτεΐνες επιτελούν ένα τεράστιο φάσμα ζωτικών λειτουργιών στους οργανισμούς. Το πρωτέωμα είναι το πλήρες σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζονται από ένα γονιδίωμα, κύτταρο, ιστό ή οργανισμό σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή. Το πρωτέωμα μεταβάλλεται με τον χρόνο και ανάλογα με τις ιδιαίτερες απαιτήσεις ή τις καταπονήσεις που υφίσταται ένα κύτταρο ή ένας οργανισμός. Πιο συγκεκριμένα, είναι το σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζονται σε έναν δεδομένο τύπο κυττάρου ή οργανισμού, σε μια δεδομένη χρονική στιγμή, υπό καθορισμένες συνθήκες. Ο όρος προκύπτει από τον συνδυασμό των λέξεων πρωτεΐνες και γονιδίωμα. Η πρωτεωμική είναι η μελέτη του πρωτεώματος.
Πρωτεΐνη
Οι πρωτεΐνες είναι μεγάλα βιομόρια, τα λεγόμενα μακρομόρια – τα οποία αποτελούνται από μία ή περισσότερες μακριές αλυσίδες καταλοίπων αμινοξέων. Οι πρωτεΐνες υπάρχουν σε όλους τους οργανισμούς, τόσο φυτικής όσο και ζωικής προέλευσης, και είναι καθοριστικές για τις περισσότερες βιολογικές λειτουργίες. Επειδή οι πρωτεΐνες περιέχουν πολλές βιολογικές πληροφορίες, εκχυλίζονται για αναλυτικούς σκοπούς, π.χ. για πρωτεωμική έρευνα. Στις σημαντικότερες λειτουργίες που επιτελούν οι πρωτεΐνες περιλαμβάνονται η κατάλυση μεταβολικών αντιδράσεων, η αντιγραφή του DNA, η απόκριση σε ερεθίσματα και η μεταφορά μορίων από μια θέση σε άλλη. Οι πρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους κυρίως ως προς την αλληλουχία των αμινοξέων τους, η οποία καθορίζεται από τη νουκλεοτιδική αλληλουχία των γονιδίων τους και συνήθως οδηγεί στην αναδίπλωση της πρωτεΐνης σε μια συγκεκριμένη τρισδιάστατη δομή που καθορίζει τη δραστικότητά της. Οι πρωτεΐνες είναι – μαζί με τα πεπτίδια – ένα από τα βασικά συστατικά των τροφίμων. Επομένως, η πρωτεωμική αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο στην επιστήμη των τροφίμων για τη βελτιστοποίηση των διεργασιών, της ασφάλειας των τροφίμων και της διατροφικής αξιολόγησης.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction είναι μια προαναλυτική διαδικασία για τον διαχωρισμό και την προσυγκέντρωση αναλυτών. Σε συνδυασμό με την κατεργασία με υπερήχους, η εκχύλιση στο σημείο θόλωσης μπορεί να εντατικοποιηθεί, καθιστώντας τη διαδικασία αποδοτικότερη, ταχύτερη και φιλικότερη προς το περιβάλλον. Με την κατεργασία με υπερήχους, η εκχύλιση στο σημείο θόλωσης αποτελεί μια σημαντικά αποδοτικότερη μέθοδο προετοιμασίας αναλυτών. Διαβάστε περισσότερα για την εκχύλιση στο σημείο θόλωσης με υποβοήθηση υπερήχων!
Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή
Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα είναι η κύρια μέθοδος διαχωρισμού και ανάλυσης μακρομορίων όπως το DNA, το RNA και οι πρωτεΐνες, καθώς και των θραυσμάτων τους, με βάση το μέγεθος και το φορτίο τους. Χρησιμοποιείται στην κλινική χημεία για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών βάσει φορτίου και/ή μεγέθους (IEF σε αγαρόζη, ουσιαστικά ανεξάρτητη από το μέγεθος) και στη βιοχημεία, τη μοριακή βιολογία και την πρωτεωμική για τον διαχωρισμό ενός μικτού πληθυσμού θραυσμάτων DNA και RNA βάσει μήκους, για την εκτίμηση του μεγέθους θραυσμάτων DNA και RNA ή για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών βάσει φορτίου.
Κυτταροκαλλιέργειες
Η κυτταροκαλλιέργεια είναι η ελεγχόμενη διαδικασία ανάπτυξης κατά την οποία τα κύτταρα καλλιεργούνται υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Οι συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο κυττάρων. Γενικά, το περιβάλλον μιας κυτταροκαλλιέργειας αποτελείται από ένα κατάλληλο δοχείο (π.χ. τρυβλίο Petri) με υπόστρωμα ή μέσο που παρέχει τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά (αμινοξέα, υδατάνθρακες, βιταμίνες, ανόργανα στοιχεία), αυξητικούς παράγοντες, ορμόνες και αέρια (CO2, O2) και ρυθμίζει το φυσικοχημικό περιβάλλον (ρυθμιστικό διάλυμα pH, ωσμωτική πίεση, θερμοκρασία). Τα περισσότερα κύτταρα χρειάζονται μια επιφάνεια ή ένα τεχνητό υπόστρωμα, ενώ άλλες κυτταροκαλλιέργειες μπορούν να αναπτύσσονται ελεύθερα αιωρούμενες στο μέσο καλλιέργειας (καλλιέργεια εναιωρήματος, κυτταρικό εναιώρημα).
Μαζικές καλλιέργειες ζωικών κυτταρικών σειρών χρησιμοποιούνται στη βιομηχανική παραγωγή εμβολίων κατά ιών και άλλων προϊόντων που παράγονται με βιοτεχνολογικές μεθόδους. Ανθρώπινα βλαστοκύτταρα καλλιεργούνται για την αύξηση του αριθμού των κυττάρων και τη διαφοροποίησή τους σε διάφορους τύπους σωματικών κυττάρων για σκοπούς μεταμόσχευσης.
Δείγματα ιστών
Ο όρος ιστός περιγράφει μια ενδιάμεση κυτταρική οργάνωση, στην οποία το κυτταρικό υλικό βρίσκεται σε επίπεδο οργάνωσης μεταξύ των κυττάρων και ενός πλήρους οργάνου. Στον ιστό συγκεντρώνονται παρόμοια κύτταρα κοινής προέλευσης, τα οποία επιτελούν από κοινού μια συγκεκριμένη λειτουργία. Με τη λειτουργική ομαδοποίηση πολλών ιστών σχηματίζονται οι σύνθετες δομές των οργάνων.
Λαμβάνονται δείγματα ιστών για έρευνα στη βιολογία, την ιστολογία/ιστοπαθολογία, την παρασιτολογία, τη βιοχημεία και την ανοσοϊστοχημεία, καθώς και για καλλιέργεια ιστών και εκχύλιση DNA. Γίνεται διάκριση μεταξύ ζωικού ιστού (υποδιαίρεση: ιστός θηλαστικών) και φυτικού ιστού. Οι ζωικοί ιστοί κατατάσσονται σε τέσσερις βασικούς τύπους: συνδετικό, μυϊκό, νευρικό και επιθηλιακό ιστό. Ο φυτικός ιστός υποδιαιρείται στα ακόλουθα τρία συστήματα ιστών: την επιδερμίδα, τον θεμελιώδη ιστό και τον αγγειακό ιστό.
Δείγματα ιστών μπορούν να παρασκευαστούν από μέρη ζώων ή φυτών, π.χ. οστά, μύες, φύλλα κ.λπ.
Σωματικά υγρά
Το αίμα, ο ορός, το πλάσμα, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, το σάλιο και το αρθρικό υγρό είναι σωματικά υγρά που αποτελούν πλούσια πηγή πληροφοριών διαγνωστικής σημασίας. Επομένως, είναι σημαντική η προσεγμένη προετοιμασία των δειγμάτων σωματικών υγρών για ανάλυση. Η πρώτη δυσκολία συνδέεται με το ευρύ δυναμικό εύρος των συστατικών που υπάρχουν στα σωματικά υγρά.
Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεϊνών
Η δοκιμασία Bradford, η δοκιμασία Lowry και η δοκιμασία δικιγχονινικού οξέος (BCA) είναι συνήθεις δοκιμασίες για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεϊνών. Η αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) είναι ένα από τα συχνότερα χρησιμοποιούμενα πρωτεϊνικά πρότυπα.
Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης
Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πρέπει να επιλέγεται ανάλογα με το κυτταρικό υλικό ή τον ιστό (ιστοκαλλιέργεια, φυτό, βακτήρια, μύκητες κ.λπ.), καθώς και με το αν τα κύτταρα βρίσκονται σε κάποια δομή και με τον τύπο αυτής της δομής. Ένα ευρύ φάσμα ρυθμιστικών διαλυμάτων λύσης για την εκχύλιση πρωτεϊνών, μεμβρανών και οργανιδίων παρασκευάζεται με ένα ή περισσότερα απορρυπαντικά. Το απορρυπαντικό επιλέγεται συνήθως με δοκιμές και σφάλματα ή – εφόσον υπάρχει – σύμφωνα με ένα υφιστάμενο πρωτόκολλο εκχύλισης πρωτεϊνών. Το απορρυπαντικό πρέπει να είναι συμβατό με τον ιστό προέλευσης και τις πρωτεΐνες. Γενικά, επιλέγεται το ηπιότερο απορρυπαντικό που είναι αποτελεσματικό για έναν συγκεκριμένο ιστό / πρωτεΐνη, ώστε να διατηρείται η μέγιστη λειτουργικότητα του εκχυλίσματος. Επιπλέον, στην περίπτωση εκχύλισης μεμβρανών και οργανιδίων, ένα ήπιο απορρυπαντικό διατηρεί τη μεμβράνη άθικτη. Τα απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται συνήθως στα ρυθμιστικά διαλύματα λύσης είναι ως επί το πλείστον μη ιονικά ή αμφιιονικά, π.χ. CHAPS, δεοξυχολικό, Triton™ X-100, NP40 και Tween 20.
Για παράδειγμα, ιστοί όπως ο εγκέφαλος, το ήπαρ, το έντερο, ο νεφρός, ο σπλήνας κ.λπ. μπορούν απλώς να υποβληθούν σε ρύθμιση του pH με RIPA – ωστόσο, θα πρέπει να περιλαμβάνονται αναστολείς πρωτεασών και DTT (π.χ. για ηλεκτροφόρηση σε πηκτή).
Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για σκελετικό μυϊκό ιστό (παγωμένο): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) γλυκερόλη, 1 mM EDTA, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, με προσθήκη μείγματος αναστολέων πρωτεασών και φωσφατασών
Πίνακας συνήθων ρυθμιστικών διαλυμάτων και του εύρους pH τους. Γενικά, αυτά τα ρυθμιστικά διαλύματα χρησιμοποιούνται συνήθως σε συγκεντρώσεις 20–50 mM.
| Ρυθμιστικό διάλυμα | Εύρος pH |
|---|---|
| Κιτρικό οξύ – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Κιτρικό νάτριο – κιτρικό οξύ | 3,0 – 6,2 |
| Οξικό νάτριο – οξικό οξύ | 3,6 – 5,6 |
| Άλας νατρίου του κακοδυλικού οξέος – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Δισόξινο φωσφορικό νάτριο – όξινο φωσφορικό δινάτριο | 5,8 – 8,0 |
| Ιμιδαζόλιο – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Υδροχλωρική τριαιθανολαμίνη – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Τρικίνη – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Τετραβορικό νάτριο – βορικό οξύ | 7,6 – 9,2 |
| Μπικίνη – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Γλυκίνη – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Το pH των περισσότερων ρυθμιστικών διαλυμάτων εξαρτάται από τη θερμοκρασία. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα ρυθμιστικά διαλύματα Tris. Το pKa μεταβάλλεται από 8,06 στους 25°C σε 8,85 στους 0°C.
(pH και pKa ενός ρυθμιστικού διαλύματος: το pH μετρά τη συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου σε ένα υδατικό διάλυμα. Το pKa (= σταθερά διάστασης οξέος) είναι ένα συναφές, αλλά πιο συγκεκριμένο μέτρο, καθώς βοηθά στην πρόβλεψη της συμπεριφοράς ενός μορίου σε μια συγκεκριμένη τιμή pH.)
TRIzol
Το TRIzol είναι ένα χημικό διάλυμα που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση RNA/DNA/πρωτεΐνης κατά την εκχύλιση με θειοκυανική γουανιδίνη–φαινόλη–χλωροφόρμιο. Η χρήση εκχύλισης με TRIzol υποβοηθούμενης από υπερήχους οδηγεί σε υψηλές αποδόσεις DNA, RNA και πρωτεϊνών από το ίδιο δείγμα και υπερέχει έτσι έναντι άλλων μεθόδων εκχύλισης.
Βιβλιογραφία/Αναφορές
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.