Εκχύλιση πρωτεϊνών υπερήχων από καλλιέργειες ιστών και κυττάρων
- εκχύλιση πρωτεΐνη είναι ένα ουσιαστικό βήμα προετοιμασία του δείγματος στην πρωτεομική.
- Οι πρωτεΐνες μπορούν να εξαχθούν από φυτικό και ζωικό ιστό, ζύμες και μικροοργανισμούς.
- Κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη, αποτελεσματική μέθοδο εκχύλισης πρωτεΐνης δίνοντας υψηλές αποδόσεις πρωτεΐνης μέσα σε σύντομο χρόνο εκχύλισης.
Εκχύλιση πρωτεΐνης από ιστούς και κύτταρα
εκχύλιση πρωτεΐνης από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα είναι ένα ουσιαστικό βήμα παρασκευή δείγματος η οποία εκτελείται κατά τη διάρκεια πολλών βιοχημικών και αναλυτικές τεχνικές όπως ELISA, PAGE, κηλίδωση Western, Φασματομετρία μάζας, ή καθαρισμό πρωτεϊνών. Υπερηχητικός κυτταρική διάσπαση, λύση και εκχύλιση είναι μια ακριβώς ελεγχόμενη τεχνική για να εξασφαλίσει υψηλές αποδόσεις των πρωτεϊνών.
εκχύλιση πρωτεΐνης από ζωικό ιστό
Για την παρασκευή ιστών ολικού μεγέθους (π.χ. νεφρού, καρδιάς, πνεύμονα, μυς κ.λπ.), ο ιστός θα πρέπει να τεμαχίζεται σε πολύ μικρά κομμάτια με καθαρά εργαλεία, πάνω στον πάγο κατά προτίμηση και όσο το δυνατόν γρηγορότερα για την πρόληψη αποικοδόμησης από πρωτεάσες (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα λύσης όπως RIPA ή υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει κοκτέιλ πρωτεάσης και αναστολέα φωσφατάσης). Μετά την ανάλυση, το δείγμα βυθίζεται σε υγρό άζωτο για την κατάψυξη. Το δείγμα μπορεί να αποθηκευτεί στους -80 ° C για μεταγενέστερη χρήση ή να διατηρηθεί σε πάγο για άμεση ομογενοποίηση. Αμέσως πριν την εκχύλιση με υπερήχους προστίθεται ταχέως ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (με αναστολείς πρωτεάσης DTT, λευπεπτίνη και απροτινίνη) στο σωλήνα δειγμάτων (για ~ 10 mg ιστού περίπου ~ 600 μL ρυθμιστικού διαλύματος). Περίπου. Συνιστάται 20-60mg ιστού ανά σωλήνα δειγμάτων.
Υπερήχων ομογενοποίηση, λύσης και εκχύλιση πραγματοποιείται με ένα υπερηχητικό ομογενοποιητή όπως ο Uf200 ः t ή UP200St, Εξοπλισμένη με ένα sonotrode μικρο-tip. διάρκεια κατεργασίας με υπερήχους είναι 60-90 sec. σε ένα υπερηχητικό τρόπο λειτουργίας κύκλο 15 sec. κατεργασία με υπερήχους και 10 sec. ανάπαυσης το χρόνο. Το δείγμα πρέπει να διατηρείται σε πάγο όλη την ώρα.
Μετά υπερηχητική ομογενοποίηση / εκχύλιση, το κυτταρόλυμα υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση στα 27.000§ για περ. 20 min. Στη συνέχεια το υπερκείμενο συλλέγεται, έτσι ώστε η συγκέντρωση πρωτεΐνης μπορεί να προσδιορίζεται με μία δοκιμασία πρωτεΐνης όπως Pierce BCA ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών.
Υπερήχων εκχύλιση πρωτεϊνών από τα κύτταρα με UP200St
Εκχύλιση πρωτεϊνών από ορό του αίματος
Για ένα ομοιογενές μείγμα του ορού και του φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος, το δείγμα στροβιλίζεται πρώτα πριν από τη λύση των υπερήχων κυττάρων. Για την λύση με υπερήχους, το δείγμα υφίσταται κατεργασία με υπερήχους με έναν ομογενοποιητή υπερήχων εργαστηρίου όπως ο UP100H για 8 κύκλους στους πλάτος 20%, για τους κύκλους του κάθε 5 δευτερόλεπτα και 15 δευτερόλεπτα εκτός. Εφαρμογή ήχου διεξάγεται με sonicationg σε κύκλους και με την τοποθέτηση του δείγματος επί πάγου έτσι ώστε μία υπερθέρμανση και θερμική αποικοδόμηση του δείγματος αποφεύγεται. Από ορός περιέχει ένα μεγάλο ποσό των πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους (όπως αλβουμίνη, α1-αντιτρυψίνη, τρανσφερίνη, απτοσφαιρίνη, G ανοσοσφαιρίνη και ανοσοσφαιρίνη Α), οι οποίες αλληλεπιδρούν με τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών μικρού μοριακού βάρους κατά τη διάρκεια της IEF, συνιστάται να τα καταστρέφουν από τον ορό χρησιμοποιώντας στήλη εξάντληση.
εκχύλιση πρωτεΐνης από φυτικό ιστό
Φρέσκο, μαλακό φυτικό ιστό, π.χ. βρύα κλπ, μπορούν εύκολα να διασπαστούν με την απλή τοποθέτηση το ψιλοκομμένο δείγμα υλικού σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για υπερήχηση. Σκληρή, ligenous φυτικούς ιστούς, όπως οι σπόροι, έλατο βελόνες κ.λπ., θα πρέπει να αλεστεί ξηρά. Μερικά σκληρά, ξυλώδη φυτικά υλικά πρέπει να καταψύχονται και αλέθονται σε υγρό άζωτο πριν εκχυλίζεται με επεξεργασία με υπερήχους. Για εναιωρήματα φυτικών κυττάρων καλλιέργειας, ένας υπερηχητικός θεραπεία μεταξύ 30 και 150 δευτερόλεπτα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης είναι ως επί το πλείστον επαρκής. Πιο σκληροί υλικό όπως σπόροι κολοκύθας απαιτούν μια πιο έντονη κατεργασία με υπερήχους όπως περιγράφεται παρακάτω.
Πρωτόκολλο για την υπερηχητική εκχύλιση λευκωματίνης από σπόρους κολοκύθας
Για την υπερηχητική εκχύλιση πρωτεΐνης αλβουμίνης από λεπτή-εδάφους σκόνη σπόρων κολοκύθας, 10 g απολιπανθείσας σκόνη σπόρων κολοκύθας και 100 mL απιονισμένου νερού ως διαλύτη προστίθενται σε ένα γυάλινο ποτήρι 250 ml. Η εκχύλιση πρωτεΐνη συνίσταται σε δύο βήματα: Πρώτον, το δείγμα υφίσταται κατεργασία με υπερήχους με ένα υπερήχων ανιχνευτή τύπου UP400St (400W, 24kHz) με τοποθετημένο sonotrode S24d7. Το γυάλινο ποτήρι τοποθετείται σε ένα λουτρό κρύου νερού κατά τη διάρκεια της υπερηχητικής ομογενοποίησης. Η η ρύθμιση των υπερήχων UP400St με τον ενεργοποιημένο αισθητήρα θερμοκρασίας εξασφαλίζεται ότι η θερμοκρασία του δείγματος διατηρείται πάντοτε κάτω από τους 30 ° C. Με τον ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας με υπερήχους, αποφεύγεται η μετουσίωση της αλβουμίνης. Δεύτερον, η εκχύλιση διεξήχθη με αναμικτήρα σε ταχύτητα 200 rpm και στους 30 ° C. Στη συνέχεια το ποτήρι μεταφέρεται σε ένα θερμοστατικό αναδευτήρα. Η σφαιρίνη αφαιρείται μέσω αιμοκάθαρσης με απεσταγμένο νερό. Μετά την αφαίρεση της σφαιρίνης, το εκχύλισμα πρωτεΐνης μπορεί να δειγματοληφθεί για προσδιορισμό του προφίλ λευκωματίνης και στη συνέχεια ρυθμίζεται σε ρΙ = 3,0 χρησιμοποιώντας 0.1 Μ ΗΟΙ για πήξη αλβουμίνης. Η στερεή φάση διαχωρίζεται με φυγοκέντρηση σε 5000g, 20 ° C και επαναδιαλύεται σε απιονισμένο νερό. Η πήξη λευκωματίνης εκτελείται δύο φορές για να αυξηθεί η αναλογία πρωτεϊνών στο συμπύκνωμα αλβουμίνης.
Υπερήχων εκχύλιση αλκαλικό πρωτεΐνης για την παρασκευή συμπυκνώματος πρωτεΐνης από πίτουρο ρυζιού δείχνει ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας με υπερήχους σε υψηλότερη απόδοση πρωτεΐνης σε ένα σημαντικά βραχύτερο χρόνο εκχύλισης – σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους εκχύλισης.
VialTweeter για την έμμεση υπερήχους.
- ταχύς
- υψηλές αποδόσεις
- υψηλής απόδοσης
- Ακριβής έλεγχος πάνω παραμέτρων
- επαναλήψιμα αποτελέσματα
- γραμμική επεκτασιμότητα
Δείγμα πρωτόκολλο παρασκευής για λειτουργικό ένζυμο iNOS
Για να αποκτήσετε πλήρως λειτουργικό ένζυμο iNOS (π.χ. για τη διαλογή φαρμάκου), το ακόλουθο πρωτόκολλο συνιστάται: Το εναιώρημα των κυττάρων θα πρέπει να τοποθετείται σε πάγο και κατεργασίας με υπερήχους με ένα UP100H σε πλάτος 10 μm σε λειτουργία κύκλος της 5 sec. υπερήχηση και 25 δευτ. στηρίζονται σε πάγο. Η διαδικασία πρέπει να επαναλαμβάνεται περίπου. 3 φορές. Ο χρόνος ανάπαυσης μεταξύ των κύκλων επεξεργασίας με υπερήχους μειώνει την αύξηση της θερμοκρασίας και συνεπώς θα μειώσει τον κίνδυνο μετουσίωσης.
Υπερήχων Πρωτεΐνη διαλυτοποίηση
Η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να επιταχύνει την διαδικασία διαλυτοποίησης πρωτεΐνης, η οποία συνήθως απαιτεί αρκετές ώρες. Για να μην υπερθερμανθεί το δείγμα και την πρόληψη αποικοδόμησης των πρωτεϊνών και τροποποιήσεις σε διαλύματα που περιέχουν ουρία, οι ριπές υπερήχων δεν πρέπει να διαρκέσει περισσότερο από λίγα δευτερόλεπτα.
Γενικές οδηγίες
Ελεγχος θερμοκρασίας: Για να εξασφαλιστεί μια υψηλή απόδοση πρωτεΐνης χωρίς θερμική μετουσίωση, θερμοκρασία κατά τη διάρκεια εκχύλισης πρέπει να ελέγχεται. state-of-art ομογενοποιητών υπερήχων Hielscher του – που ονομάζεται επίσης υπερήχων αποσαθρωτή ή sonificator – είναι ακριβώς ελεγχόμενη. Έρχονται με έναν αισθητήρα θερμοκρασίας αποσπώμενες. Στις επιλογές ρύθμισης του υπερηχητικού ομογενοποιητή, μια μέγιστη θερμοκρασία μπορεί να ρυθμιστεί. Όταν επιτευχθεί αυτή η θερμοκρασία max, η υπερήχων σταματά αυτόματα μέχρις ότου το δείγμα να κρυώσει.
Ρυθμιστής: Η επιλογή ενός κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος και το δικαίωμα όγκο του ρυθμιστικού διαλύματος ποικίλλει από ιστό σε ιστό και πρέπει να καταλάβει-out από δοκιμές δοκιμής και σφάλματος.
Απομόνωση / καθαρισμό: Πρωτεϊνικά λύματα μπορούν να περιέχουν μία περίσσεια βιομορίων όπως το DNA ή υδατάνθρακες, που μπορεί να αφαιρεθεί με καθίζηση πρωτεΐνης (δεοξυχολικό-τριχλωροξικό οξύ) ή ανταλλαγή ρυθμιστικού.
Chittapalo και Noomhorm (2009) ανέφεραν ότι η πρωτεϊνική απόδοση αυξάνει με την χρήση επεξεργασίας με υπερήχους και ότι το υπερηχητικό διαδικασία ομογενοποίησης ιστών και λύσης μπορούν να ενισχύσουν σημαντικά τις υπάρχουσες διαδικασίες εκχύλισης – επιτρέποντας νέες ευκαιρίες εξαγωγής εμπορικά.
Υπερήχων ομογενοποιητή ιστού UP200St για αποδοτική εκχύλιση πρωτεΐνης
ελέγχου του προγράμματος περιήγησης για την ακριβή λειτουργία και την παρακολούθηση της διαδικασίας επεξεργασίας με υπερήχους
Υπερηχογραφικός εξοπλισμός για πρωτεΐνη Εξαγωγή
Hielscher Ultrasonics προσφέρουν ένα ευρύ φάσμα των υπερήχων ΟΜΟΓΕΝΟΠΟΙΗΤΕΣ για την αποσύνθεση των κυττάρων, ιστών, βακτήρια, μικροοργανισμούς, μαγιά, και τα σπόρια.
Hielscher ultrasonicators εργαστήριο είναι ισχυρό και εύκολο στη χρήση. Κατασκευασμένο για λειτουργία 24/7, έχουν σχεδιαστεί ως ισχυρό και αποτελεσματικό εργαστήριο και πάγκο-top συσκευές. Για όλες τις συσκευές, η παραγωγή ενέργειας και το πλάτος μπορεί να ελεγχθεί με ακρίβεια. Το ευρύ φάσμα των αξεσουάρ Ανοίγει περισσότερες επιλογές ρύθμισης. Οι ψηφιακές συσκευές, όπως VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, και UP400St έχουν ένα ολοκληρωμένο έλεγχο θερμοκρασίας και μια ενσωματωμένη κάρτα SD για αυτόματη καταγραφή δεδομένων.
Για την έμμεση, διασταυρούμενη μόλυνση-ελεύθερη και ταυτόχρονη επεξεργασία με υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων, προσφέρουμε το VialTweeter ή Υπερήχων cuphorn.
Ανάλογα με την εφαρμογή, το υλικό, και ο όγκος του δείγματος σας, θα σας προτείνουμε την πιο κατάλληλη ρύθμιση για την προετοιμασία του δείγματος σας. Επικοινωνήστε μαζί μας σήμερα!
Λογοτεχνία / Αναφορές
- Chittapalo Τ, Noomhorm Α (2009): Υπερήχων επικουρούμενη αλκαλίων εκχύλιση πρωτεΐνης από απολιπανθέντα πίτυρα ρυζιού και τις ιδιότητες των συμπυκνωμάτων πρωτεΐνης. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
- Simões, André E.S :; Pereira, Diane Μ .; Amaral, Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes, Σοφία Ε .; Rodrigues, Pedro Μ .; Lo, Adrian C .; D'Hooge, Rudi? Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen Ν .; Borralho, Pedro Μ .; Rodrigues, Cecília Μ.Ρ. (2013): Αποτελεσματική ανάκτηση πρωτεϊνών από δείγματα πολλαπλές πηγή μετά ΤπζοΙ ή ΤπζοΙ LS εκχύλιση RNA και μακροχρόνια αποθήκευση. BMC Genomics 2013, 14: 181.
Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζουμε
Πρωτεομική
Πρωτεομική είναι το πεδίο έρευνας που διερευνά τις πρωτεΐνες και το proteome. Οι πρωτεΐνες τηρούσε μια μεγάλη σειρά από ζωτικές λειτουργίες μέσα οργανισμούς. Το πρωτεώματος είναι το σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζονται από ένα γονιδίωμα, κύτταρο, ιστό, ή τον οργανισμό σε έναν ορισμένο χρόνο. Η πρωτεώματος ποικίλλει με το χρόνο και διακριτές απαιτήσεις, ή τονίζει, ότι ένα κύτταρο ή οργανισμό υφίσταται. Πιο συγκεκριμένα, αυτό είναι το σύνολο των εκφρασμένων πρωτεϊνών σε ένα δεδομένο τύπο κυττάρου ή οργανισμού, σε μια δεδομένη στιγμή, υπό καθορισμένες συνθήκες. Ο όρος είναι ένα μείγμα πρωτεϊνών και γονιδιώματος. Πρωτεομική είναι η μελέτη της proteome.
Πρωτεΐνη
Οι πρωτεΐνες είναι είναι μεγάλα βιομόρια, το λεγόμενο μακρομορίων – που αποτελούνται από μία ή περισσότερες μακριές αλυσίδες υπολειμμάτων αμινοξέων. Οι πρωτεΐνες υπάρχουν σε όλους τους οργανισμούς φυτικής και ζωικής προέλευσης και είναι κρίσιμοι για τις περισσότερες από τις βιολογικές λειτουργίες. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες περιέχουν πολλές βιολογικές πληροφορίες, εξάγονται για αναλυτικό σκοπό, π.χ. για πρωτεϊνωματική έρευνα. Η πιο σημαντική λειτουργία που ασκείται από τις πρωτεΐνες είναι η κατάλυση των μεταβολικών αντιδράσεων, η αντιγραφή του DNA, η ανταπόκριση στα ερεθίσματα και η μεταφορά μορίων από τη μια θέση στην άλλη. Οι πρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους κυρίως στην αλληλουχία αμινοξέων τους, η οποία υπαγορεύεται από την αλληλουχία νουκλεοτιδίων των γονιδίων τους και η οποία συνήθως έχει ως αποτέλεσμα την αναδίπλωση της πρωτεΐνης σε μια συγκεκριμένη τρισδιάστατη δομή που καθορίζει τη δραστικότητα της. Οι πρωτεΐνες είναι – εκτός από τα πεπτίδια – ένα από τα βασικά συστατικά των τροφίμων. Ως εκ τούτου, πρωτεομική είναι ένα ισχυρό εργαλείο στην επιστήμη των τροφίμων για τη βελτιστοποίηση των διαδικασιών, την ασφάλεια των τροφίμων και τη διατροφική αξιολόγηση.
gel Ηλεκτροφόρηση
ηλεκτροφόρηση πήγματος είναι η κύρια μέθοδος για διαχωρισμό και ανάλυση των μακρομορίων όπως ϋΝΑ, RNA και πρωτεϊνών, καθώς και θραύσματα αυτών, με βάση το μέγεθος και το φορτίο τους. Χρησιμοποιείται στην κλινική χημεία για το διαχωρισμό πρωτεϊνών με φορτίο ή / και το μέγεθος (IEF αγαρόζη, ουσιαστικά μέγεθος ανεξάρτητος) και στη βιοχημεία, μοριακή βιολογία και πρωτεϊνωματική να διαχωρίσει ένα μικτό πληθυσμό των θραυσμάτων DNA και RNA με μήκος, για να εκτιμηθεί το μέγεθος της DNA και RNA θραύσματα ή για το διαχωρισμό πρωτεϊνών με χρέωση.
καλλιέργειες κυττάρων
Κυτταρική καλλιέργεια είναι η ελεγχόμενη αυξανόμενη διαδικασία με την οποία τα κύτταρα καλλιεργούνται κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες. Οι συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας ποικίλει για κάθε κυτταρικό τύπο. Σε γενικές γραμμές, το περιβάλλον μιας κυτταρικής καλλιέργειας αποτελείται από ένα κατάλληλο δοχείο (π.χ. δίσκο Petri) με υπόστρωμα ή μέσο που παρέχει τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά (αμινοξέα, υδατάνθρακες, βιταμίνες, ανόργανα άλατα), αυξητικούς παράγοντες, ορμόνες, και αέρια (CO2Η2), Και ρυθμίζει την φυσιο-χημικό περιβάλλον (ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ, ωσμωτική πίεση, θερμοκρασία). Τα περισσότερα κύτταρα χρειάζονται μια επιφάνεια ή τεχνητό υπόστρωμα, ενώ άλλες κυτταρικές καλλιέργειες μπορούν να καλλιεργηθούν δωρεάν επιπλέουν σε μέσο καλλιέργειας (καλλιέργεια εναιωρήματος, εναιώρημα κυττάρων).
Οι Μάζα καλλιέργειες κυτταρικών γραμμών ζώου που χρησιμοποιείται στη βιομηχανική παραγωγή ιικών εμβολίων και άλλων βιοτεχνολογικά παράγωγα προϊόντα. Τα ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα καλλιεργούνται για την επέκταση του αριθμού των κυττάρων και διαφοροποίηση των κυττάρων σε διάφορα σωματικά τύπους κυττάρων για σκοπούς μεταμόσχευσης.
Τα δείγματα ιστών
Ο όρος ιστός περιγράφει ένα κυτταρικό ενδιάμεσο, όπου το υλικό κύτταρο είναι σε οργανωτικό επίπεδο μεταξύ κυττάρων και ένα πλήρες όργανο. Εις τον ιστό, παρόμοιο κύτταρα, από την ίδια προέλευση που μαζί πραγματοποιούν μια συγκεκριμένη λειτουργία, συναρμολογούνται. Με τη λειτουργική ομαδοποίηση των πολλαπλών ιστών, οι πολύπλοκες δομές των οργάνων που σχηματίζονται.
Ιστός γίνεται δειγματοληψία για την έρευνα στη βιολογία, ιστολογία / ιστοπαθολογία, παρασιτολογία, βιοχημεία, ανοσοϊστοχημεία καθώς και να καλλιεργήσει και εκχύλιση του DNA. Μπορεί να διακριθεί μεταξύ των ζώων (υποδιαίρεση: θηλαστικού ιστού) και φυτικών ιστών. Οι ιστοί των ζώων ομαδοποιούνται σε τέσσερις βασικούς τύπους των συνδετικών, των μυών, νευρική, και επιθηλιακού ιστού. Φυτικός ιστός υποδιαιρείται στα ακόλουθα τρία συστήματα ιστού: την επιδερμίδα, τον ιστό έδαφος, και του αγγειακού ιστού.
Δείγματα ιστού μπορούν να παρασκευασθούν από ζωικά ή φυτικά μέρη, π.χ. των οστών, των μυών, φύλλα, κλπ
Σωματικά υγρά
Αίμα, ορό, πλάσμα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, σάλιο και υγρά αρθρικό είναι υγρά του σώματος, τα οποία προσφέρουν μια μεγάλη πηγή διαγνωστικά σχετικών πληροφοριών. Ως εκ τούτου, ένα εξελιγμένο παρασκευή δειγμάτων σωματικού υγρού για ανάλυση είναι σημαντική. Η πρώτη δυσκολία συνδέεται με το ευρύ δυναμικό εύρος των συστατικών που υπάρχουν στα σωματικά υγρά.
Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης
Bradford δοκιμασία, δοκιμασία Lowry και δικιγχονικού οξύ (BCA) είναι κοινές δοκιμασίες για να προσδιορισθεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών. αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) είναι μία από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες πρότυπο πρωτεΐνης.
Ρυθμιστικό λύσης
ρυθμιστικού λύσης πρέπει να επιλεγεί σύμφωνα με το κύτταρο υλικό ή ιστού (καλλιέργεια ιστού, φυτού, βακτήρια, μύκητες, κλπ), και εάν τα κύτταρα βρίσκονται σε μια δομή και τον τύπο της δομής. Ένα ευρύ φάσμα των λύσεως Ρυθμιστικά διαλύματα για την εκχύλιση των πρωτεϊνών, οι μεμβράνες, και οργανίδια συνταγοποιούνται με ένα ή περισσότερα απορρυπαντικά. Το απορρυπαντικό επιλέγεται συνήθως μέσω δοκιμές δοκιμής και σφάλματος ή – εάν είναι διαθέσιμο – σύμφωνα με υπάρχον πρωτόκολλο εκχύλισης πρωτεΐνης. Το απορρυπαντικό πρέπει να είναι συμβατό με την πηγή ιστού και των πρωτεϊνών. Σε γενικές γραμμές, το ηπιότερο απορρυπαντικό που λειτουργεί για ένα ειδικό ιστό / πρωτεΐνη, επιλέγεται προκειμένου να διατηρηθεί η μέγιστη λειτουργικότητα του εκχυλίσματος. Επιπλέον, σε περίπτωση εκχύλισης των μεμβρανών και οργανιδίων, ένα ήπιο απορρυπαντικό διατηρεί η μεμβράνη άθικτη. Συνήθως χρησιμοποιούνται απορρυπαντικά σε ρυθμιστικά διαλύματα λύσης είναι κυρίως μη-ιονικά ή διπολικού ιόντος, π.χ. CHAPS, δεοξυχολικό, Triton ™ Χ-100, ΝΡ40, και Tween 20.
Για παράδειγμα, ιστοί όπως ο εγκέφαλος, το ήπαρ, έντερο, νεφρό, σπλήνα κλπ μπορεί απλά να ρυθμίζεται με RIPA – Ωστόσο θα πρέπει να συμπεριληφθούν αναστολείς πρωτεάσης και ϋΤΤ (π.χ. για ηλεκτροφόρηση πηκτώματος).
ρυθμιστικού λύσης για σκελετικού μυϊκού ιστού (παγωμένο): 20 mM Tris (ρΗ 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton Χ-100, 10% (νν / ν) γλυκερόλη, 1 mM EDTA , 1 mM διθειοθρεϊτόλη συμπληρωμένο με πρωτεάση και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ
Πίνακας των κοινών ρυθμιστικών και περιοχή ρΗ τους. Σε γενικές γραμμές, αυτά τα ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται συνήθως σε συγκεντρώσεις 20-50 mM.
| Ρυθμιστής | περιοχή ρΗ |
|---|---|
| Κιτρικό οξύ – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Κιτρικό νάτριο – Κιτρικό οξύ | 3,0 – 6,2 |
| Οξικό νάτριο – οξικό οξύ | 3,6 – 5,6 |
| άλας νατρίου κακοδυλικού οξέος – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| ΜΟΥ – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Νάτριο φωσφορικό δισόξινο – όξινο φωσφορικό δινάτριο | 5,8 – 8,0 |
| ιμιδαζόλιο – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Σφουγγαρίστρες – ΚΟΗ | 6,6 – 7,8 |
| υδροχλωρική τριαιθανολαμίνη – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Τρις – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Τρικίνη – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| τετραβορικό νάτριο – βορικό οξύ | 7,6 – 9,2 |
| δικίνης – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| γλυκίνη – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Τα περισσότερα ρυθμιστικά δείχνουν ένα ρΗ-εξάρτηση με τη θερμοκρασία. Αυτό είναι ιδιαίτερα αληθές για Tris ρυθμιστικά διαλύματα. Το ρΚα αλλάζει από 8,06 στους 25 ° C έως 8,85 στους 0 ° C.
(ΡΗ και ρΚα ενός ρυθμιστικού: pH μετρά τη συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου σε υδατικό διάλυμα ρΚα (= διαχωρισμού οξέος σταθερά) είναι ένα σχετικό, αλλά πιο συγκεκριμένο μέτρο, από το ότι βοηθά να προβλέψουμε πώς ένα μόριο θα δράσει σε μια συγκεκριμένη. τιμή ρΗ.)
ΤΚΙζοΙ
ΤΚΙζοΙ είναι μια χημική ουσία διάλυμα που χρησιμοποιείται για την εκχύλιση του RNA / DNA / πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της εκχύλισης θειοκυανικού γουανιδίου-φαινόλης-χλωροφορμίου. Η χρήση της υποβοηθούμενης υπερηχητικά ΤΚΙζοΙ αποτελέσματα εκχύλιση σε υψηλή DNA, RNA, και οι αποδόσεις πρωτεΐνης από το ίδιο δείγμα και υπερέχει έτσι άλλες μεθόδους εκχύλισης.