Υπερήχων Lysis για Western Blotting

• Η δυτική κηλίδα είναι μια αναλυτική διαδικασία για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε δείγμα ομογενοποιημένου ιστού ή κυτταρικού εκχυλίσματος.
• Για να τρέξει μια δυτική κηλίδα ή για να μετρήσει την ενζυμική δραστηριότητα, πολλές δοκιμασίες απαιτούν πρόσβαση στα υλικά (π.χ. πρωτεΐνες, DNA, υποκυτταρικά θραύσματα) που παγιδεύονται στο κύτταρο.
• Κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη και εύκολη στη χρήση μέθοδος για ελεγχόμενη κυτταρική διαταραχή και λύση.

Υπερήχων κυτταρική διαταραχή

Η εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα είναι το πρώτο βήμα για πολλές βιολογικές, βιοχημικές και αναλυτικές τεχνικές (PAGE, Western blotting, ELISA, φασματομετρία μάζας κ.λπ.) ή καθαρισμό πρωτεϊνών. Για να επιτευχθεί υψηλή απόδοση πρωτεΐνης, το κυτταρικό υλικό και ο ιστός πρέπει να διαταραχθούν? λυθούν αποτελεσματικά. Είτε φυτικό κύτταρο είτε ζωικό ιστό, κατεργασία με υπερήχους είναι η μέθοδος για την προετοιμασία του κυτταρικού σας λύματος εύκολα και γρήγορα.

Πλεονεκτήματα της κατεργασίας με υπερήχους

• Γρήγορος & Αποδοτικός
• Εύκολη λειτουργία
• υψηλή απόδοση πρωτεϊνών
• αναπαραγώγιμα/ επαναλαμβανόμενα
• Ελέγχεται με ακρίβεια
• Επεκτάσιμη

Πρωτόκολλο ανοσοκατακρήμνισης για δυτική ανοσοκαθήλωση

Α. Αντιδραστήρια

Για την παρασκευή των διαλυμάτων, χρησιμοποιήστε καθαρό νερό όπως το Milli-Q.

• 1X ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS)
• 1X ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml λευκεπτίνη
  Σημαντικό: Προσθέστε 1 mM PMSF αμέσως πριν από τη χρήση.
• 15 μl πρωτεΐνης Α+15 μl πρωτεΐνης G είναι επαρκής για την IP, αλλά μπορεί να εξαρτάται από το πρωτογενές αντίσωμα και τον όγκο του δείγματός σας. Μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε προ-αναμεμειγμένη πρωτεΐνη A/ G αγαρόζη (π.χ. πρωτεΐνη Α για κουνέλι IgG τραβήξτε προς τα κάτω και πρωτεΐνη G για ποντίκι IgG τραβήξτε προς τα κάτω)
• 3X ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 στους 25°C), 6% w/v SDS, 30% γλυκερόλη, 150 mM DTT, 0,03% w/v μπλε βρωμοφαινόλης

Β. Παρασκευή προϊόντων κυτταρικής λύσης

• Συλλέξτε τα κύτταρα. Για τη συλλογή κυττάρων υπό συνθήκες μη μετουσίωσης, αφαιρέστε τα μέσα και ξεπλύνετε τα κύτταρα μία φορά με παγωμένο PBS.
• Αφαιρέστε το PBS και προσθέστε 0,5 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 1X κυττάρων σε κάθε τρυβλίο (10 cm) και επωάστε τα τρυβλία σε πάγο για 5 λεπτά.
• Ξύστε τα κύτταρα από τις πλάκες και μεταφέρετε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρισης. Κρατήστε τον πάγο.
• Υπερήχηση δύο φορές για 10 δευτερόλεπτα σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ανοσοκατακρήμνισης (ρυθμιστικό διάλυμα IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 και το μείγμα αναστολέων πρωτεάσης). Για κατεργασία με υπερήχους, το VialTweeter ή έναν ανιχνευτή υπερήχων όπως το UP100Η ή UP200Ht είναι τα πιο κατάλληλα.
• Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρούνται στα 15.000 g επί 10 λεπτά στους 4°C.
• Μεταφέρετε το υπερκείμενο υγρό σε νέο σωλήνα. (Εάν είναι απαραίτητο, το προϊόν λύσης μπορεί να αποθηκευτεί στους -80°C.)
• Προσθέστε το κύριο αντίσωμα στο υπερκείμενο υγρό. Το υπερκείμενο υγρό με το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται για 1 ώρα στους 4°C υπό ελαφρά ανάδευση. Το πρωτογενές αντίσωμα προστίθεται συνήθως σε ποσότητα 10 φορές πιο συμπυκνωμένη από ό, τι χρησιμοποιείται για τη δυτική κηλίδωση. (Μπορείτε να ξεκινήσετε με 1μg ανά 100μL.)
• Το υπερκείμενο υγρό στη συνέχεια επωάζεται περαιτέρω με το μείγμα ίσων ποσοτήτων πρωτεΐνης Α-αγαρόζης (Invitrogen) και πρωτεΐνης G αγαρόζης για άλλη 1 ώρα.
• Πλύνετε τα σφαιρίδια αγαρόζης τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα IP. Στη συνέχεια, εκχυλίστε τις δεσμευμένες πρωτεΐνες με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS-PAGE θερμαίνοντας στους 95°C για 5 λεπτά.

Γ. Ανοσοκατακρήμνιση

• Λαμβάνονται 200 μl κυτταρικού διαλύματος και προστίθεται πρωτογενές αντίσωμα. Επώαση με απαλή ταλάντευση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C.
• Προστίθενται χάντρες αγαρόζης πρωτεΐνης Α ή G (20 μl πολτού σφαιριδίων 50%). Επωάζεται με απαλή ταλάντωση για 1-3 ώρες στους 4°C.
• Μικροφυγόκεντρος για 30 δευτερόλεπτα στους 4°C. Εκπλύνεται το σφαιρίδιο πέντε φορές με 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 1 Χ. Κρατήστε σε πάγο κατά τη διάρκεια των πλύσεων.
• Επαναιωρείται το σφαιρίδιο με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS 20 μl 3X. Vortex, στη συνέχεια μικροφυγόκεντρος για 30 δευτερόλεπτα.
• Το δείγμα θερμαίνεται στους 95–100°C επί 2–5 λεπτά και πραγματοποιείται μικροφυγοκέντρηση επί 1 λεπτό στα 14.000 X g.
• Το δείγμα (15-30 μl) τοποθετείται σε γέλη SDS-PAGE (12-15%).
• Αναλύστε το δείγμα με Western blotting.

Ανάλυση Western Blot με το Sonicator UP50H

Ακολουθώντας το πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας τον υπερηχητή τύπου ανιχνευτή UP50H χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη των Kriebisch et al. (2011):
Η ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κύτταρα MC3T3-E1 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ή όχημα. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich). 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) και 0,5% δεοξυχολικό νάτριο (Merck). Το προϊόν λύσης κυττάρων υποβλήθηκε σε υπερήχους για 2 × 10 δευτερόλεπτα στον κύκλο 1 και πλάτος 80 με το UP50H υπερήχων επεξεργαστή (Hielscher, Τεχνολογία υπερήχων, Teltow, Γερμανία). Στη συνέχεια, το υλικό φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 14.000 σ.α.λ. και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για Western blotting. Είκοσι πέντε μg πρωτεΐνης βράστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και αναγωγικό παράγοντα (Invitrogen) και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πηκτές πολυακρυλαμιδίου 4-12% (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE υγειονομική περίθαλψη). Η μεμβράνη φράχτηκε για 1 ώρα με TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) που περιείχε 1% καζεΐνη (Sigma-Aldrich) και 1% Tris (1 M). Μετά την απόφραξη, η μεμβράνη επωάστηκε με ελαφρά ανάδευση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C με το πρωτογενές αντίσωμα (αντι-ανθρώπινο CBS 1/500 κουνελιού, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο του καθηγητή R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ΗΠΑ). Η επώαση με συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα υπεροξειδάσης χρένου (HPR) (Dako) πραγματοποιήθηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Όλες οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Perkin Elmer).
 

Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα σχετικά με τις βέλτιστες πρακτικές για την υπερηχητική κυτταρική λύση και εκχύλιση, προετοιμασία λυμάτων και συστάσεις για βελτιώσεις της διαδικασίας!
 
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων εργαστηριακού μεγέθους μας:

Βιβλιογραφία? Αναφορές