Υπερήχων Λύση για Western Blotting

  • Το στύπωμα western είναι μια αναλυτική διαδικασία για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών σε ένα δείγμα του ομογενοποιημένου ιστού ή εκχύλισμα κυττάρου.
  • Για να τρέξει ένα Western blot ή για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας, πολλοί προσδιορισμοί απαιτούν πρόσβαση στα υλικά (π.χ. πρωτεΐνες, DNA, υποκυτταρικό θραύσματα) παγιδευμένη στο κύτταρο.
  • Κατεργασία με υπερήχους είναι ένα αξιόπιστο και εύκολο στη λαβή μέθοδο για την ελεγχόμενη διάρρηξη κυττάρων και λύση.

Υπερήχων Κυττάρων Διακοπής

εκχύλιση πρωτεΐνης από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα είναι το πρώτο βήμα για πολλές βιολογικές, βιοχημικές και αναλυτικές τεχνικές (PAGE, κηλίδωση Western, ELISA, φασματομετρία μάζας, κλπ) ή καθαρισμού πρωτεϊνών. Για να ληφθεί μια απόδοση υψηλής πρωτεΐνης, το κύτταρο υλικό και ιστών πρέπει να διασπαστούν αποτελεσματικά / λύθηκαν. Είτε φυτικό κύτταρο ή ζωικό ιστό, κατεργασία με υπερήχους είναι η μέθοδος για την παρασκευή λύμα το κινητό σας εύκολα και γρήγορα.

Πλεονεκτήματα υπερήχων

  • Γρήγορα & αποτελεσματικός
  • εύκολη λειτουργία
  • υψηλή απόδοση πρωτεΐνης
  • αναπαραγώγιμη / επαναλήψιμη
  • ακριβή έλεγχο
  • ανάβατος

Αίτηση για πληροφορίες




Σημειώστε τις Πολιτική Απορρήτου.


Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

ViaTweeter υπερήχων Για προετοιμασία δείγματος υπερήχων, όπως κυτταρική διαταραχή και απομόνωση πρωτεϊνών

Ανοσοκατακρήμνιση πρωτόκολλο για τη Δυτική ανοσοαποτύπωσης

Α Αντιδραστήρια

Για την παρασκευή των διαλυμάτων, χρησιμοποιήστε κεκαθαρμένο ύδωρ, όπως Milli-Q.

  • 1Χ Αλατόνερο Ρυθμισμένο με Φωσφορικό (PBS)
  • 1Χ Ρυθμιστικό Διάλυμα Κυτταρικής Λύσης: 20 mM Tris (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 2.5 πυροφωσφορικό mM νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Na3VO4, 1 μg / ml λευπεπτίνη
    Σημαντικό: Προσθέστε 1 mM PMSF αμέσως πριν από τη χρήση.
  • 15 μΙ Πρωτεΐνη Α + 15 μΙ πρωτεΐνης G είναι επαρκής για ΙΡ, αλλά μπορεί να εξαρτάται από πρωτογενή όγκο αντισώματος και το δείγμα σας. Μπορείτε, επίσης, να χρησιμοποιούν προ-αναμεμιγμένο πρωτεΐνης Α / G αγαρόζης (π.χ. πρωτεΐνη Α για το κουνέλι IgG γκρεμίζουν και Πρωτεΐνης G για IgG ποντικού τραβήξει προς τα κάτω)
  • 3X SDS Ρυθμιστικό Δείγμα: 187.5 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8 στους 25 ° C), 6% β / ο SDS, 30% γλυκερόλη, 150 mM DTT, 0.03% w / v κυανούν βρωμοφαινόλης

Β Παρασκευή των κυτταρικών λυμάτων

  • Συγκομιδή των κυττάρων. Για να συλλεχθούν κύτταρα υπό μη μετουσιωτικές συνθήκες, αφαιρέστε μέσα και ξεπλύνετε κύτταρα μία φορά με παγωμένο PBS.
  • Αφαιρέστε PBS και προσθέστε 0.5 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος 1Χ λύσης κυττάρου σε κάθε πλάκα (10 cm) και επωάστε τα τρυβλία σε πάγο για 5 λεπτά.
  • Ξύστε κύτταρα από τις πλάκες και μεταφέρετε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου. Διατηρήστε στον πάγο.
  • Επεξεργαστείτε με υπερήχους δύο φορές για 10 δευτερόλεπτα σε παγωμένο ρυθμιστικό ανοσοκαταβύθισης (ρυθμιστικό ΙΡ: 50 mM Tris-HCI [ρΗ 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% ΝΡ-40 και το μίγμα αναστολέα πρωτεάσης). Για κατεργασία με υπερήχους, η VialTweeter ή ένα υπερήχων ανιχνευτή όπως η UP100H ή Uf200 ः t είναι οι πιο κατάλληλες.
  • Φυγοκεντρήστε τα προϊόντα λύσης στις 15.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C.
  • Μεταφέρετε το υπερκείμενο σε ένα νέο σωλήνα. (Εάν είναι απαραίτητο, λύμα μπορεί να αποθηκευτεί στους -80 ° C.)
  • Προσθέστε το πρωτεύον αντίσωμα στο υπερκείμενο. Το υπερκείμενο με το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται για 1 ώρα στους 4 ° C υπό ελαφρά ανάδευση. Πρωτογενές αντίσωμα συνήθως προστίθεται σε μία ποσότητα 10x πιο συμπυκνωμένο από αυτό που χρησιμοποιείται για western αποτύπωση. (Μπορείτε να ξεκινήσετε με 1 μg ανά 100 μl).
  • Το υπερκείμενο στη συνέχεια επωάζεται περαιτέρω με το μίγμα ίσων ποσοτήτων Πρωτεΐνης Α-αγαρόζη (Invitrogen) και Πρωτεΐνης G αγαρόζης για άλλη 1 ώρα.
  • Πλένουμε τα σφαιρίδια αγαρόζης τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ. Στη συνέχεια, εκχύλιση των δεσμευμένες πρωτεΐνες με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS-PAGE με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά.

Γ Ανοσοκαταβύθιση

  • Πάρτε 200 μΙ προϊόντος λύσης κυττάρου και προσθέστε πρωτογενές αντίσωμα. Επωάστε με ήπια ανακίνηση όλη τη νύκτα στους 4 ° C.
  • Προσθήκη είτε πρωτεΐνη Α ή σφαιρίδια αγαρόζης G (20 μΙ πολτού σφαιριδίων 50%). Επώαση με ήπια ανακίνηση για 1-3 ώρες στους 4 ° C.
  • Μικροφυγόκεντρο για 30 δευτερόλεπτα στους 4 ° C. Πλύνετε σφαιροποιηθούν πέντε φορές με 500 μΙ 1Χ ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσης. Διατηρήστε στον πάγο κατά τη διάρκεια πλύσεις.
  • Το ίζημα αναδιαλύεται με 20 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 3Χ SDS. Vortex, τότε μικροφυγόκεντρο για 30 δευτερόλεπτα.
  • Το δείγμα θερμαίνεται στους 95-100 ° C για 2-5 λεπτά και μικροφυγόκεντρο επί 1 λεπτό στα 14.000 Χ g.
  • Φορτώστε το δείγμα (15-30 μΙ) επί πηκτής SDS-PAGE (12-15%).
  • Αναλύστε το δείγμα με κηλίδωση Western.

Ανάλυση Western Blot με το Sonicator UP50H

Ακολουθώντας το πρωτόκολλο που χρησιμοποιεί τον υπερηχητή τύπου ανιχνευτή UP50H χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη των Kriebisch et al. (2011):
Υπερήχων ομογενοποιητής τύπου καθετήρα UP50H χρησιμοποιείται συνήθως για κυτταρική διαταραχή και απομόνωση πρωτεϊνών ως βήμα προετοιμασίας δείγματος πριν από τη δυτική κηλίδωσηΗ ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κύτταρα MC3T3-E1 σε επεξεργασία με 1,25 (ΟΗ)2ρε3 (10-8 Μ) ή όχημα. Τα κύτταρα λύθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris HCl, ρΗ 8 (Sigma-Aldrich)? 150 mM NaCl (Fisher Scientific)? 0.1% δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS) (Fisher Scientific)? 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) και 0.5% δεοξυχολικό νάτριο (Merck). Το προϊόν λύσης κυττάρου υποβλήθηκε σε υπερήχους για 2 × 10 s στους κύκλο 1 και του πλάτους 80 με την UP50H Υπερήχων Επεξεργαστής (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany). Στη συνέχεια το υλικό φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 14.000 rpm και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για κηλίδωση Western. Είκοσι πέντε μg πρωτεΐνης βράστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και αναγωγικό παράγοντα (Invitrogen) και ακολούθως διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 4-12% (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (υγειονομική περίθαλψη GE). Η μεμβράνη παρεμποδίστηκε για 1 ώρα με TBS (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6, 150 mM NaCI) που περιείχε 1% καζεΐνη (Sigma-Aldrich) και 1% Tris (1 Μ). Μετά την παρεμπόδιση, η μεμβράνη επωάστηκε με ελαφρά ανάδευση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C με το πρωτεύον αντίσωμα (CBS 1/500 κουνελιού αντι-ανθρώπου, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο του Prof. R. Banerjee, Αηη Arbor, ΜΙ, USA). Επωάστηκε με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (HPR) (Dako) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα στυπώματα αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Perkin Elmer).
 

Αυτό το σεμινάριο εξηγεί ποιος τύπος υπερήχων είναι καλύτερος για τις εργασίες προετοιμασίας του δείγματός σας, όπως λύση, κυτταρική διαταραχή, απομόνωση πρωτεϊνών, κατακερματισμός DNA και RNA σε εργαστήρια, ανάλυση και έρευνα. Επιλέξτε τον ιδανικό τύπο υπερήχων για την εφαρμογή σας, τον όγκο δείγματος, τον αριθμό δείγματος και την απόδοση. Hielscher Υπέρηχοι έχει το ιδανικό υπερήχων ομογενοποιητή για σας!

Πώς να βρείτε τον τέλειο υπερήχων για κυτταρική διαταραχή και εκχύλιση πρωτεϊνών στην επιστήμη και την ανάλυση

Μικρογραφία βίντεο

 

Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα σχετικά με τις βέλτιστες πρακτικές για την υπερηχητική κυτταρική λύση και εκχύλιση, προετοιμασία λυμάτων και συστάσεις για βελτιώσεις της διαδικασίας!
 
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων εργαστηριακού μεγέθους μας:

Προτεινόμενες συσκευέςΜαζική ΌγκοςΡυθμός ροής
UIP400MTP Υπερήχων πλάκας 96 φρεατίωνπλάκες πολλαπλών φρεατίων / μικροτιτλοδότησηςμ.δ.
Υπερήχων cuphornCupHorn για φιαλίδια ή ποτήρι ζέσεωςμ.δ.
GDmini2Υπερηχητικός αντιδραστήρας μικρο-ροήςμ.δ.
VialTweeter0.5 έως 1.5mLμ.δ.
UP100H1 έως 500mL10 έως 200 ml / λεπτό
Uf200 ः t, UP200St10 έως 1000mL20 έως 200mL / λεπτό
UP400St10 έως 2000mL20 έως 400mL / λεπτό
υπερηχητικός αναδευτήρας κόσκινουμ.δ.μ.δ.

Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!

Ζητήστε περισσότερες πληροφορίες

Χρησιμοποιήστε την παρακάτω φόρμα για να ζητήσετε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τους υπερήχων μας για την προετοιμασία δείγματος πριν από τη Western Blots, λεπτομερή πρωτόκολλα εφαρμογής και τιμή. Θα χαρούμε να συζητήσουμε τη διαδικασία προετοιμασίας του δείγματός σας μαζί σας και να σας προσφέρουμε ένα σύστημα υπερήχων που ικανοποιεί τις απαιτήσεις σας!









Παρακαλείστε να σημειώσετε ότι η Πολιτική Απορρήτου.


Οι μικροπλάκες, οι πλάκες πολλαπλών φρεατίων, οι πλάκες PCR και οι πλάκες 96 φρεατίων μπορούν να υπερηχηθούν άνετα και ομοιόμορφα με υπερήχους χρησιμοποιώντας τον υπερήχων πλάκας UIP400MTP

UIP400MTP Πλάκα υπερήχων για υπερήχηση υψηλής απόδοσης πλακών 96 φρεατίων



Σχετικά με Western Blotting

Οι κηλίδες είναι αναλυτικές διαδικασίες όπου DNA, RNA και πρωτεΐνες μεταφέρονται επάνω σε έναν φορέα έτσι ώστε να μπορούν να διαχωριστούν.
Το στύπωμα Southern χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του DNA, το στύπωμα Northern για RNA και στο στύπωμα Western για πρωτεΐνες.
Western κηλίδωση καλείται επίσης ανοσοκηλίδωση πρωτεΐνης, επειδή ένα αντίσωμα χρησιμοποιείται για να ανιχνεύσει ειδικά το αντιγόνο του. Η Western Blotting είναι μια από τις πιο σημαντικές μεθόδους ανάλυσης για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών στο δείγμα. Στο στύπωμα Western, οι πρωτεΐνες ακινητοποιούνται σε μεμβράνες για τον εντοπισμό τους χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα.
Με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS (SDS-PAGE) οι φυσικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται με δομή 3-D ή μετουσιωμένες πρωτεΐνες με το μήκος του πολυπεπτιδίου. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη (τυπικά νιτροκυτταρίνη ή PVDF), όπου χρωματίζονται με αντισώματα ειδικά για την πρωτεΐνη στόχο. Το στάδιο ηλεκτροφόρησης πηκτώματος περιλαμβάνεται στην ανάλυση στυπώματος western για να επιλυθεί το ζήτημα της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας των αντισωμάτων.
Στη συνέχεια, οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες κηλιδώνονται πάνω σε μήτρα (κυρίως σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF), όπου χρωματίζονται με αντισώματα. Τα αντισώματα λειτουργούν ως ανιχνευτής και επιλέγονται ειδικά προς την πρωτεΐνη στόχο. Η ανάλυση της θέσης και της έντασης της συγκεκριμένης αντίδρασης αποκαλύπτει λεπτομέρειες έκφρασης των πρωτεϊνών-στόχων στο δεδομένο δείγμα. Η κηλίδωση Western μπορούσε να ανιχνεύσει πρωτεΐνη στόχου που είναι τόσο χαμηλή όσο 1 ng λόγω υψηλής ανάλυσης της ηλεκτροφόρησης πηκτής και ισχυρής ειδικότητας και υψηλής ευαισθησίας της ανοσοδοκιμασίας. Η μέθοδος Western blot χρησιμοποιείται στη μοριακή βιολογία, βιοχημεία, ανοσογενετική και άλλους τομείς της μοριακής έρευνας.
Άλλες σχετικές τεχνικές περιλαμβάνουν ανάλυση dot blot, ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία όπου τα αντισώματα χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση πρωτεϊνών σε ιστούς και κύτταρα με ανοσοχρώση, και ενζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA).


Λογοτεχνία / Αναφορές

Πλήρης διαμόρφωση Vialtvali: VialTweeter sonotrode σε υπερήχων επεξεργαστή UP200St

ViaTweeter υπερήχων για την ταυτόχρονη προετοιμασία δείγματος πολλαπλών φιαλιδίων

Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!





Παρακαλείστε να σημειώσετε ότι η Πολιτική Απορρήτου.


Κατεργασία με υπερήχους είναι ένα σημαντικό στάδιο κατά τη διάρκεια παρασκευής του δείγματος

UP200St με μικρο-άκρο για υπερήχηση δείγμα

Θα χαρούμε να συζητήσουμε τη διαδικασία σας.

Ας έρθουμε σε επαφή.