Υπερήχων Λύση για Western Blotting

• Το στύπωμα western είναι μια αναλυτική διαδικασία για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών σε ένα δείγμα του ομογενοποιημένου ιστού ή εκχύλισμα κυττάρου.
• Για να τρέξει ένα Western blot ή για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας, πολλοί προσδιορισμοί απαιτούν πρόσβαση στα υλικά (π.χ. πρωτεΐνες, DNA, υποκυτταρικό θραύσματα) παγιδευμένη στο κύτταρο.
• Κατεργασία με υπερήχους είναι ένα αξιόπιστο και εύκολο στη λαβή μέθοδο για την ελεγχόμενη διάρρηξη κυττάρων και λύση.

Υπερήχων Κυττάρων Διακοπής

εκχύλιση πρωτεΐνης από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα είναι το πρώτο βήμα για πολλές βιολογικές, βιοχημικές και αναλυτικές τεχνικές (PAGE, κηλίδωση Western, ELISA, φασματομετρία μάζας, κλπ) ή καθαρισμού πρωτεϊνών. Για να ληφθεί μια απόδοση υψηλής πρωτεΐνης, το κύτταρο υλικό και ιστών πρέπει να διασπαστούν αποτελεσματικά / λύθηκαν. Είτε φυτικό κύτταρο ή ζωικό ιστό, κατεργασία με υπερήχους είναι η μέθοδος για την παρασκευή λύμα το κινητό σας εύκολα και γρήγορα.

Πλεονεκτήματα υπερήχων

• Γρήγορα & αποτελεσματικός
• εύκολη λειτουργία
• υψηλή απόδοση πρωτεΐνης
• αναπαραγώγιμη / επαναλήψιμη
• ακριβή έλεγχο
• ανάβατος

Ανοσοκατακρήμνιση πρωτόκολλο για τη Δυτική ανοσοαποτύπωσης

Α Αντιδραστήρια

Για την παρασκευή των διαλυμάτων, χρησιμοποιήστε κεκαθαρμένο ύδωρ, όπως Milli-Q.

• 1Χ Αλατόνερο Ρυθμισμένο με Φωσφορικό (PBS)
• 1Χ Ρυθμιστικό Διάλυμα Κυτταρικής Λύσης: 20 mM Tris (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 2.5 πυροφωσφορικό mM νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Na3VO4, 1 μg / ml λευπεπτίνη
  Σημαντικό: Προσθέστε 1 mM PMSF αμέσως πριν από τη χρήση.
• 15 μΙ Πρωτεΐνη Α + 15 μΙ πρωτεΐνης G είναι επαρκής για ΙΡ, αλλά μπορεί να εξαρτάται από πρωτογενή όγκο αντισώματος και το δείγμα σας. Μπορείτε, επίσης, να χρησιμοποιούν προ-αναμεμιγμένο πρωτεΐνης Α / G αγαρόζης (π.χ. πρωτεΐνη Α για το κουνέλι IgG γκρεμίζουν και Πρωτεΐνης G για IgG ποντικού τραβήξει προς τα κάτω)
• 3X SDS Ρυθμιστικό Δείγμα: 187.5 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8 στους 25 ° C), 6% β / ο SDS, 30% γλυκερόλη, 150 mM DTT, 0.03% w / v κυανούν βρωμοφαινόλης

Β Παρασκευή των κυτταρικών λυμάτων

• Συγκομιδή των κυττάρων. Για να συλλεχθούν κύτταρα υπό μη μετουσιωτικές συνθήκες, αφαιρέστε μέσα και ξεπλύνετε κύτταρα μία φορά με παγωμένο PBS.
• Αφαιρέστε PBS και προσθέστε 0.5 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος 1Χ λύσης κυττάρου σε κάθε πλάκα (10 cm) και επωάστε τα τρυβλία σε πάγο για 5 λεπτά.
• Ξύστε κύτταρα από τις πλάκες και μεταφέρετε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου. Διατηρήστε στον πάγο.
• Επεξεργαστείτε με υπερήχους δύο φορές για 10 δευτερόλεπτα σε παγωμένο ρυθμιστικό ανοσοκαταβύθισης (ρυθμιστικό ΙΡ: 50 mM Tris-HCI [ρΗ 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% ΝΡ-40 και το μίγμα αναστολέα πρωτεάσης). Για κατεργασία με υπερήχους, η VialTweeter ή ένα υπερήχων ανιχνευτή όπως η UP100H ή Uf200 ः t είναι οι πιο κατάλληλες.
• Φυγοκεντρήστε τα προϊόντα λύσης στις 15.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C.
• Μεταφέρετε το υπερκείμενο σε ένα νέο σωλήνα. (Εάν είναι απαραίτητο, λύμα μπορεί να αποθηκευτεί στους -80 ° C.)
• Προσθέστε το πρωτεύον αντίσωμα στο υπερκείμενο. Το υπερκείμενο με το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται για 1 ώρα στους 4 ° C υπό ελαφρά ανάδευση. Πρωτογενές αντίσωμα συνήθως προστίθεται σε μία ποσότητα 10x πιο συμπυκνωμένο από αυτό που χρησιμοποιείται για western αποτύπωση. (Μπορείτε να ξεκινήσετε με 1 μg ανά 100 μl).
• Το υπερκείμενο στη συνέχεια επωάζεται περαιτέρω με το μίγμα ίσων ποσοτήτων Πρωτεΐνης Α-αγαρόζη (Invitrogen) και Πρωτεΐνης G αγαρόζης για άλλη 1 ώρα.
• Πλένουμε τα σφαιρίδια αγαρόζης τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ. Στη συνέχεια, εκχύλιση των δεσμευμένες πρωτεΐνες με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS-PAGE με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά.

Γ Ανοσοκαταβύθιση

• Πάρτε 200 μΙ προϊόντος λύσης κυττάρου και προσθέστε πρωτογενές αντίσωμα. Επωάστε με ήπια ανακίνηση όλη τη νύκτα στους 4 ° C.
• Προσθήκη είτε πρωτεΐνη Α ή σφαιρίδια αγαρόζης G (20 μΙ πολτού σφαιριδίων 50%). Επώαση με ήπια ανακίνηση για 1-3 ώρες στους 4 ° C.
• Μικροφυγόκεντρο για 30 δευτερόλεπτα στους 4 ° C. Πλύνετε σφαιροποιηθούν πέντε φορές με 500 μΙ 1Χ ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσης. Διατηρήστε στον πάγο κατά τη διάρκεια πλύσεις.
• Το ίζημα αναδιαλύεται με 20 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 3Χ SDS. Vortex, τότε μικροφυγόκεντρο για 30 δευτερόλεπτα.
• Το δείγμα θερμαίνεται στους 95-100 ° C για 2-5 λεπτά και μικροφυγόκεντρο επί 1 λεπτό στα 14.000 Χ g.
• Φορτώστε το δείγμα (15-30 μΙ) επί πηκτής SDS-PAGE (12-15%).
• Αναλύστε το δείγμα με κηλίδωση Western.

Western Blot ανάλυση με υπερήχων UP50H

Μετά πρωτόκολλο χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη της Kriebisch et al. (2011):
Η ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κύτταρα MC3T3-E1 σε επεξεργασία με 1,25 (ΟΗ)₂ρε₃ (10^-8 Μ) ή όχημα. Τα κύτταρα λύθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris HCl, ρΗ 8 (Sigma-Aldrich)? 150 mM NaCl (Fisher Scientific)? 0.1% δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS) (Fisher Scientific)? 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) και 0.5% δεοξυχολικό νάτριο (Merck). Το προϊόν λύσης κυττάρου υποβλήθηκε σε υπερήχους για 2 × 10 s στους κύκλο 1 και του πλάτους 80 με την UP50H Υπερήχων Επεξεργαστής (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany). Στη συνέχεια το υλικό φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 14.000 rpm και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για κηλίδωση Western. Είκοσι πέντε μg πρωτεΐνης βράστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και αναγωγικό παράγοντα (Invitrogen) και ακολούθως διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 4-12% (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (υγειονομική περίθαλψη GE). Η μεμβράνη παρεμποδίστηκε για 1 ώρα με TBS (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6, 150 mM NaCI) που περιείχε 1% καζεΐνη (Sigma-Aldrich) και 1% Tris (1 Μ). Μετά την παρεμπόδιση, η μεμβράνη επωάστηκε με ελαφρά ανάδευση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C με το πρωτεύον αντίσωμα (CBS 1/500 κουνελιού αντι-ανθρώπου, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο του Prof. R. Banerjee, Αηη Arbor, ΜΙ, USA). Επωάστηκε με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (HPR) (Dako) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα στυπώματα αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Perkin Elmer).

Λογοτεχνία / Αναφορές