Λύση με υπερήχους για ανάλυση Western blot

• Η ανάλυση Western blot είναι μια αναλυτική διαδικασία για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε δείγμα ομογενοποιήματος ιστού ή κυτταρικού εκχυλίσματος.
• Για τη διενέργεια ανάλυσης Western blot ή τη μέτρηση της ενζυμικής δραστικότητας, πολλές δοκιμασίες απαιτούν πρόσβαση στα υλικά (π.χ. πρωτεΐνες, DNA, υποκυτταρικά θραύσματα) που είναι εγκλωβισμένα στο κύτταρο.
• Η κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη και εύχρηστη μέθοδος για ελεγχόμενη κυτταρική διάρρηξη και λύση.

Κυτταρική διάρρηξη με υπερήχους

Η εκχύλιση πρωτεϊνών από ιστούς και καλλιεργημένα κύτταρα αποτελεί το πρώτο βήμα για πολλές βιολογικές, βιοχημικές και αναλυτικές τεχνικές (PAGE, ανάλυση Western blot, ELISA, φασματομετρία μάζας κ.λπ.) ή για τον καθαρισμό πρωτεϊνών. Για να επιτευχθεί υψηλή απόδοση πρωτεϊνών, το κυτταρικό υλικό και ο ιστός πρέπει να υποστούν αποτελεσματική διάρρηξη/λύση. Είτε πρόκειται για φυτικό κύτταρο είτε για ζωικό ιστό, η κατεργασία με υπερήχους είναι η μέθοδος για την εύκολη και γρήγορη παρασκευή του κυτταρικού σας λύματος.

Πλεονεκτήματα της κατεργασίας με υπερήχους

• γρήγορη και αποτελεσματική
• εύκολος χειρισμός
• υψηλή απόδοση πρωτεϊνών
• αναπαραγώγιμη/επαναλήψιμη
• ελεγχόμενη με ακρίβεια
• με δυνατότητα κλιμάκωσης

Πρωτόκολλο ανοσοκατακρήμνισης για ανοσοαποτύπωση Western

A. Αντιδραστήρια

Για την παρασκευή των διαλυμάτων, χρησιμοποιήστε καθαρισμένο νερό, όπως Milli-Q.

• 1X Φυσιολογικός ορός ρυθμισμένος με φωσφορικά (PBS)
• 1X Ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml λευπεπτίνη
  Σημαντικό: Προσθέστε 1 mM PMSF αμέσως πριν από τη χρήση.
• 15 μl πρωτεΐνης A+15 μl πρωτεΐνης G επαρκούν για IP, αλλά αυτό μπορεί να εξαρτάται από το πρωτογενές αντίσωμα και τον όγκο του δείγματός σας. Μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε προαναμεμειγμένη αγαρόζη με πρωτεΐνη A/ G (π.χ. πρωτεΐνη A για κατακρήμνιση IgG κουνελιού και πρωτεΐνη G για κατακρήμνιση IgG ποντικού)
• 3X Ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 στους 25°C), 6% w/v SDS, 30% γλυκερόλη, 150 mM DTT, 0,03% w/v κυανό της βρωμοφαινόλης

B. Παρασκευή κυτταρικών λυμάτων

• Συλλέξτε τα κύτταρα. Για να συλλέξετε κύτταρα υπό μη μετουσιωτικές συνθήκες, αφαιρέστε το θρεπτικό μέσο και ξεπλύνετε τα κύτταρα μία φορά με παγωμένο PBS.
• Αφαιρέστε το PBS, προσθέστε 0,5 ml παγωμένου 1X ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσης σε κάθε τρυβλίο (10 cm) και επωάστε τα τρυβλία σε πάγο για 5 λεπτά.
• Αποκολλήστε τα κύτταρα από τα τρυβλία με απόξεση και μεταφέρετέ τα σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης. Διατηρήστε τα σε πάγο.
• Υποβάλετε σε κατεργασία με υπερήχους δύο φορές για 10 δευτερόλεπτα σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ανοσοκατακρήμνισης (ρυθμιστικό διάλυμα IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 και το μείγμα αναστολέων πρωτεασών). Για την κατεργασία με υπερήχους, το VialTweeter ή μια συσκευή υπερήχων με ακίδα, όπως το UP100H ή UP200Ht , αποτελούν τις πλέον κατάλληλες επιλογές.
• Φυγοκεντρήστε τα λύματα στα 15.000 g για 10 λεπτά στους 4°C.
• Μεταφέρετε το υπερκείμενο σε νέο σωληνάριο. (Εάν είναι απαραίτητο, το λύμα μπορεί να αποθηκευτεί στους –80°C.)
• Προσθέστε το πρωτογενές αντίσωμα στο υπερκείμενο. Το υπερκείμενο με το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται για 1 h στους 4°C υπό ελαφρά ανάδευση. Το πρωτογενές αντίσωμα προστίθεται συνήθως σε ποσότητα με συγκέντρωση 10x μεγαλύτερη από εκείνη που χρησιμοποιείται στην ανάλυση Western blot. (Μπορείτε να ξεκινήσετε με 1μg ανά 100μL.)
• Στη συνέχεια, το υπερκείμενο επωάζεται περαιτέρω με το μείγμα ίσων ποσοτήτων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Invitrogen) και αγαρόζης με πρωτεΐνη G για ακόμη 1 h.
• Πλύνετε τα ιζήματα αγαρόζης τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα IP. Στη συνέχεια, εκχυλίστε τις δεσμευμένες πρωτεΐνες με το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS-PAGE, θερμαίνοντας στους 95°C για 5 λεπτά.

C. Ανοσοκατακρήμνιση

• Λάβετε 200 μl κυτταρικού λύματος και προσθέστε πρωτογενές αντίσωμα. Επωάστε με ήπια παλινδρομική κίνηση όλη τη νύχτα στους 4°C.
• Προσθέστε σφαιρίδια αγαρόζης με πρωτεΐνη A ή G (20 μl εναιωρήματος σφαιριδίων 50%). Επωάστε με ήπια παλινδρομική κίνηση για 1–3 ώρες στους 4°C.
• Μικροφυγοκεντρήστε για 30 δευτερόλεπτα στους 4°C. Πλύνετε το ίζημα πέντε φορές με 500 µl 1X ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσης. Διατηρήστε το σε πάγο κατά τις πλύσεις.
• Επαναιωρήστε το ίζημα με 20 μl 3X ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS. Αναδεύστε σε αναδευτήρα vortex και, στη συνέχεια, μικροφυγοκεντρήστε για 30 δευτερόλεπτα.
• Θερμάνετε το δείγμα στους 95–100°C για 2–5 λεπτά και μικροφυγοκεντρήστε για 1 λεπτό στα 14.000 X g.
• Φορτώστε το δείγμα (15–30 μl) σε πήκτωμα SDS-PAGE (12–15%).
• Αναλύστε το δείγμα με ανάλυση Western blot.

Ανάλυση Western blot με τη συσκευή υπερήχων UP50H

Το ακόλουθο πρωτόκολλο με χρήση της συσκευής υπερήχων με ακίδα UP50H χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη των Kriebisch και συν. (2011):
Απομονώθηκε ολική πρωτεΐνη από κύτταρα MC3T3-E1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ή με τον φορέα χορήγησης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich)· 150 mM NaCl (Fisher Scientific)· 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) (Fisher Scientific)· 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) και 0,5% δεοξυχολικό νάτριο (Merck). Το κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους για 2 × 10 s, με ρύθμιση κύκλου 1 και πλάτους 80, με τον επεξεργαστή υπερήχων UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Γερμανία). Στη συνέχεια, το υλικό φυγοκεντρήθηκε για 10 min στις 14.000 rpm και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση Western blot. Είκοσι πέντε μg πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε βρασμό σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και αναγωγικό παράγοντα (Invitrogen) και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 4–12% (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE health care). Πραγματοποιήθηκε αποκλεισμός της μεμβράνης για 1 h με TBS (10 mM Tris-HCl· pH 7,6· 150 mM NaCl) που περιείχε 1% καζεΐνη (Sigma-Aldrich) και 1% Tris (1 M). Μετά τον αποκλεισμό, η μεμβράνη επωάστηκε με ελαφρά ανάδευση όλη τη νύχτα στους 4°C με το πρωτογενές αντίσωμα (αντίσωμα κουνελιού έναντι της ανθρώπινης CBS 1/500, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο του καθηγητή R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ΗΠΑ). Η επώαση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου (HPR) (Dako) πραγματοποιήθηκε για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα αποτυπώματα εμφανίστηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Perkin Elmer).
 

Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα σχετικά με τις βέλτιστες πρακτικές για κυτταρική λύση και εκχύλιση με υπερήχους, την παρασκευή λυμάτων και τις συστάσεις για βελτιώσεις της διεργασίας!
 
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των εργαστηριακών συσκευών υπερήχων μας:

Βιβλιογραφία / Αναφορές

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.