Τεχνολογία Υπερήχων Hielscher

Υπερήχων Προετοιμασία των δειγμάτων C. Elegans

Γ. elegans, ένα σκουλήκι νηματωδών, είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος πρότυπος οργανισμός στη βιολογία. Η προετοιμασία του δείγματος πριν από την ανάλυση απαιτεί λύση, εκχύλιση πρωτεΐνης και λιπιδίων, καθώς και κατακερματισμό RNA, η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί αξιόπιστα μέσω υπερήχηση. Οι υπερηχητικοί διαταράκτες κυττάρων είναι αξιόπιστες, περίπλοκες και εύχρηστες συσκευές για τη γρήγορη προετοιμασία των δειγμάτων C. elegans.

Υπερήχων Προετοιμασία των δειγμάτων C. Elegans

Γ. elegans είναι roundworms, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στα ερευνητικά εργαστήρια για να διερευνήσουν τη γονιδιωματική, την αναπτυξιακή βιολογία, και τις ασθένειες. Πολλά γονίδια στο γονιδίωμα του C. elegans έχουν λειτουργικά αντίστοιχα στον άνθρωπο. Με αυτόν τον τρόπο, το σκουλήκι νηματωδών είναι ένα εξαιρετικά χρήσιμο πρότυπο για τις ανθρώπινες ασθένειες. Άλλα πλεονεκτήματα για την ευρεία χρήση του C. elegans είναι η εύκολη και φθηνή καλλιέργειά του σε πλάκες που περιέχουν βακτήρια (π.χ. E. coli), η διαφάνειά του, βολικό χειρισμό, καθώς και η δυνατότητα να παγώσει και να αποθηκεύσει τα σκουλήκια για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα.
Η ανάλυση πρωτεϊνών και λιπιδίων είναι τακτικές διαδικασίες στα εργαστήρια και η προετοιμασία του δείγματος υπερήχων είναι η καθιερωμένη μέθοδος για την ανάλυση των νηματωδών C. elegans σε κάθε στάδιο ανάπτυξης (π.χ. έμβρυα, προνύμφες L1-L4, ενήλικες). Δεδομένου ότι το C. elegans χρησιμοποιείται επίσης ως σύστημα έκφρασης πρωτεΐνης για την υπερέκφραση στοχευμένων πρωτεϊνών, απαιτείται μια αξιόπιστη, αναπαραγώγιμη μέθοδος λύσης και εκχύλισης πρωτεΐνης, η οποία δίνει υψηλές αποδόσεις πρωτεϊνών. Υπερήχων κυττάρων διαταραχή και τα συστήματα εκχύλισης είναι διαθέσιμα ως ομογενοποιητές τύπου καθετήρα και ως υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων. Catering στην κατάλληλη προετοιμασία δειγμάτων και όλων των μορφών δειγμάτων αριθμούς, Hielscher Ultrasonics έχει τον ιδανικό υπερηχητικό διαταράκτη κυττάρων για τη διαδικασία εργαστηρίων σας.
C. elegans is a widely used model organism in biological research. Ultrasonic lysis is a sophisticated, reliable, reproducible and rapid technique to prepare high-quality protein extracts from C. elegans.

Υπερήχων C. elegans Λύση για

  • Προετοιμασία ομογενειών σκουληκιών
  • εκχύλιση πρωτεΐνη
  • Εκχύλιση λιπιδίων
  • Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών
  • Immunoprecipitation
  • κηλίδωση Western
  • Εξαγωγή RNA
  • Ενζυμικές δοκιμασίες
Το sonotrode MTP-24-8-96 έχει οκτώ υπερήχους καθετήρες για την υπερήχηση των φρεατίων των πλακών μικροτιτήρα.

Το sonotrode MTP-24-8-96 έχει οκτώ υπερήχους καθετήρες για την υπερήχηση των φρεατίων των πλακών μικροτιτήρα.

Αίτηση για πληροφορίες




Σημειώστε τις Πολιτική Απορρήτου.


Υπερήχων πρωτόκολλα για C. Elegans διαταραχή και λύση

Η υπερηχητική ομογενοποίηση και η λύση του C. elegans και της επακόλουθης εκχύλισης πρωτεΐνης και λιπιδίων μπορούν να εκτελεστούν χρησιμοποιώντας ποικίλες διαδικασίες χρησιμοποιώντας διαφορετικά προσκρουστήματα ομογενοποίησης και λύσης κ.λπ. Όλα τα πρωτόκολλα λύσης έχουν κοινό ότι τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται συνεχώς στον πάγο για την πρόληψη της υποβάθμισης των πρωτεϊνών. Παρακάτω, σας παρουσιάζουμε μερικά αξιόπιστα και γρήγορα υπερηχητικά πρωτόκολλα λύσης και εκχύλισης για την προετοιμασία υψηλής ποιότητας πρωτεϊνικών ή λιπιδίων που περιέχουν δείγματα C. elegans.

Πλεονεκτήματα της υπερήχων C. elegans Λύση

  • αξιόπιστος
  • αναπαραγώγιμος
  • ακριβώς ελεγχόμενη από τη θερμοκρασία
  • αξιόπιστος έλεγχος διαδικασίας
  • ήπια μέθοδος
  • εύκολο να εφαρμοστεί
  • Ασφαλής

Υπερήχων εξαγωγή πρωτεΐνης από C. elegans δείγματα

Υπερήχων λύση και εκχύλιση πρωτεΐνης των σκουληκιών C. elegans μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας διάφορα πρωτόκολλα. Παρακάτω σας παρουσιάζουμε μερικά αξιόπιστα και γρήγορα πρωτόκολλα λύσης για αναπαραγώγιμα αποτελέσματα εκχύλισης πρωτεΐνης.

Ταχεία προετοιμασία του κυτταροσολικού εκχυλίσματος από τα σκουλήκια C. elegans από την υπερήχηση

Με το ακόλουθο πρωτόκολλο μπορείτε να προετοιμάσετε C. elegans lysates σε λιγότερο από 30 λεπτά.
Συλλογή του C. elegans
Επιλέξτε τα επιθυμητά σκουλήκια C. elegans σε ένα φωσφορικό σωλήνα 1,5 ml ρυθμιστικό ορό (PBS) ή πλύνετε τα από ένα πιάτο με 1,5ml PBS. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 2000rpm σε σφαιρίδιο. Κρατήστε τα δείγματα ανά πάσα στιγμή στον πάγο.
Στη συνέχεια, πλύνετε τα σκουλήκια δύο φορές με PBS.
Στη συνέχεια, πλύνετε τα σκουλήκια δύο φορές με ddH2O.
Επαναιωρήσεις των σκουληκιών σε τουλάχιστον 500ul ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης (HB). Τα δείγματα σκουληκιών είναι τώρα έτοιμα για υπερηχητική λύση.
Για υψηλότερη ποιότητα εκχυλίσματος πρωτεΐνης, ίσως να θέλετε να μειώσετε τη βακτηριακή μόλυνση με το πλύσιμο των σκουληκιών για 5 λεπτά το καθένα σε PBS και αποστειρωμένο, εξαιρετικά καθαρό νερό (ddH2O) ή εκτελέστε επιπλεύση σακχαρόζης. Κρατήστε τα δείγματα σκουληκιών συνεχώς στον πάγο.

Υπερηχητικό πρωτόκολλο λύσης C. elegans

  • Βεβαιωθείτε ότι έχετε προετοιμάσει το ultrasonicator εκ των προτέρων, έτσι ώστε ο ομογενοποιητής υπερήχων είναι έτοιμο για χρήση (καθετήρα τοποθετηθεί, υπερήχων πρόγραμμα προκαθορισμένο).
  • Ultrasonicator UP200Ht (200 watts, 26kHz) with microtip S26d2 for the preparation of biological samplesΕάν ο υπερηχητικός σας παράγοντας είναι όρθιος, τοποθετήστε το λουτρό πάγου με τους σωλήνες δείγματός σας κάτω από τον υπερηχητικό καθετήρα και τοποθετήστε τον υπερηχητικό καθετήρα στο σωλήνα 1,5ml.

  • Για τη λύση C. elegans με το UP200St ή το UP200Ht, η υπερήχηση θα πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας μια μικροτίληξη (π.χ., καθετήρας 2 mm S26d2, βλέπε εικόνα αριστερά) σε πλάτος 40% για 1sec με 30sec παύσεις ενδιάμεσα. 5 κύκλοι υπερήχων για κάθε 1 δευτερόλεπτο με παύσεις 30sec είναι ιδανικοί για τη λύση C. elegans. Εάν εκτελέσετε τη λύση για πρώτη φορά, μπορείτε να ελέγξετε την εξέλιξη της λύσης σε μικρές ποσότητες του δείγματος μετά από κάθε παλμό χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο.
  • Η λύση ολοκληρώνεται επιτυχώς όταν διαταράσσουν τα σκουλήκια. Η υπερ υπερήχηση έχει ως αποτέλεσμα τη θραύση των πυρήνων και γίνεται ορατό όταν το δείγμα γίνεται ιξώδες ή αφρούς. Για να αποφύγετε την υποβάθμιση του δείγματος, χρησιμοποιήστε περισσότερους παλμούς, εάν χρειάζεται. Μην αυξάνετε το χρόνο κάθε υπερηχητικού κύκλου σφυγμού για να πάρετε υψηλής ποιότητας εκχυλίσματα πρωτεΐνης.
  • Καθαρίστε το κύτταρο lysate με φυγοκέντρηση των υπερηχητικά lysed σκουλήκια σε 14.000rpm για 10min σε 4ºC.
  • Στη συνέχεια, μεταφέρετε το υπερκείμενο σε ένα φρέσκο σωλήνα και προετοιμαστείτε για ανοσοκαταθλισμό ή άλλες δοκιμασίες.

Σημείωση για ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης: Προετοιμάστε το ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης για το πρωτόκολλο υπερήχων λύση παραπάνω ως εξής:

  • 15 mM Hepes pH 7,6 – 15 ml των 0,5 M
  • 10 mM KCl – 2,5 ml των 2 M
  • 1,5 mM MgCl2 – 00,75 ml από 1 M
  • 0.1 mM EDTA – 100 ul των 0,5 Μ
  • 0.5 mM EGTA – 2,5 ml των 0,1 M
  • 44 mM Σακχαρόζη – 14,7 ml 50 %
  • Προσθέστε δικαίωμα πριν από τη χρήση: 1mM DTT – 1000x 1M
  • συν έναν αναστολέα πρωτεάσης

Υπερήχων Λύση του C. elegans για ποσοτική συγγένεια καθαρισμού δοκιμές

Γ. elegans έμβρυα (∼2 εκατομμύρια ανά αναπαραγωγή) ήταν πρόσφατα συγκομίζονται σε βιολογικά τριπλό από τη λεύκανση των νέων gravid ερμαφρόδιτα και sonicated στον πάγο (κύκλος: 0,5 s, πλάτος: 40-45%, 5 εγκεφαλικά επεισόδια / συνεδρία, 5 συνεδρίες, διάστημα μεταξύ των συνεδριών: 30 s? UP200S υπερηχητικός επεξεργαστής με μικρο-άκρο S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (συνολικός όγκος: ∼600 μl· Tris-HCl 50 mm, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% γλυκερίνη, μείγμα αναστολέα πρωτεάσης, 0,1% Nonidit P-40 Υποκατάστατο). Μετά την υπερήχηση, Nonidet P-40 Υποκατάστατο προστέθηκε μέχρι 1% και τα lysates επωάστηκαν με το κεφάλι πάνω από την περιστροφή της ουράς στους 4 °C για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση σε 20.000 × g για 20 λεπτά σε 4 °C. Στη συνέχεια, το εκκαθαρισμένο lysate αναρροφήθηκε χωρίς να διαταραχθεί το ανώτερο στρώμα λιπιδίων και χωρίστηκε κατά το ήμισυ είτε σε χάντρες αγαρόζης κατά του GFP είτε σε μπλοκαρισμένες χάντρες ελέγχου (40–50 μl). Μετά από την περιστροφή της ουράς στους 4°C στους 60–90 λεπτά, οι χάντρες πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιείχε 0,1% Nonidet P-40 Υποκατάστατο, ακολουθείται από δύο φορές πλύση είτε στο ρυθμιστικό διάλυμα I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) είτε στο ρυθμιστικό διάλυμα II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ή και στα δύο. Για τα pull-down του GFP:MBK-2, πραγματοποιήθηκαν δύο ξεχωριστά πειράματα χρησιμοποιώντας διαφορετικές συνθήκες πλύσης. Οι πρωτεΐνες εκλούθηκαν με τροχιακή ανάδευση σε 50 μl ουρίας 6 m/2 M θειουρίας σε θερμοκρασία δωματίου. Για τα πειράματα απόσυρσης MBK-1::GFP, οι πρωτεΐνες εκλούθηκαν δύο φορές με ανάδευση σε 50μl χλωριούχου γουανιδινίου 8 m στους 90°C, ακολουθούμενη από κατακρήμνιση αιθανόλης. Εκλεψήθηκαν δείγματα πρωτεΐνης αφομοιώθηκαν στη συνέχεια σε διάλυμα.
(πρβλ. Chen et al., 2016)

VialTweeter at the ultrasonic processor UP200ST

VialTweeter μονάδα προετοιμασίας πολλαπλών δειγμάτων για την ταυτόχρονη υπερήχηση 10 δοκιμαστικών σωλήνων.

Ομογενοποίηση και λύση υπερηχητικών σκουληκιών

Για τη λύση C.elegans και τη διαδικασία εκχύλισης πρωτεΐνης, 30.000 νεμότοδες του σχετικού σταδίου συλλέχθηκαν ανά δείγμα και πλύθηκαν σε παγωμένο S-basal, συμπυκνωμένοι με φυγοκέντρηση στις 1500 σ.α.λ. για 2 λεπτά, πλύθηκαν έξι φορές με παγωμένο S-basal για την απομάκρυνση των υπολειμματικών βακτηρίων και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στον πάγο μέχρι να είναι έτοιμα για χρήση. Για την εκχύλιση πρωτεΐνης, gravid-ενήλικα σκουλήκια είχαν τη δυνατότητα να σχηματίσουν ένα συμπαγές σφαιρίδιο μετά την τελευταία S-basal πλύση. Τα σφαιρίδια σκουληκιών στη συνέχεια αναιωρούνται σε 1 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης [20 mM φωσφορικού καλίου, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, αναστολείς πρωτεάσης (Sigma P2714)] και υποβλήθηκαν αμέσως σε επεξεργασία.
∼30.000 σκουλήκια gravid-ενηλίκων (που αντιστοιχούν σε ∼100 mg υγρού βάρους), υπερήχηθηκαν στον πάγο χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό καθετήρα τύπου (π.χ. UP50H με microtip MS2) σε 40% πλάτος για 10 κύκλους 3 sec, 30 sec off, σε 1 ml εκχύλισης παγοψυχουμονού. (πρβλ. Μπασκανάν κ.ά. 2012)

Υπερήχων Λιπιδική Εκχύλιση από C. elegans

Στην λιπιδομική, ένας κλάδος των μεταβολομικών, το λιπιδικό συμπλήρωμα των βιολογικών συστημάτων χαρακτηρίζεται και αναλύεται. Γ. elegans χρησιμοποιούνται ευρέως σε λιπιδομική για να διερευνήσουν την αλληλεπίδραση των μεταβολικών λιπιδίων και τις επιπτώσεις τους στην υγεία και τη διάρκεια ζωής.
Υπερήχων λύση και εκχύλιση χρησιμοποιείται για την απελευθέρωση λιπιδίων, όπως sphingolipids από C. elegans έμβρυα, προνύμφες, και ενήλικα σκουλήκια. Ultrasonication χρησιμοποιείται για την προετοιμασία ομογενειακών σκουληκιών και στη συνέχεια για την εξαγωγή των λιπιδίων από το δείγμα.
Πρωτόκολλο για την εκχύλιση με υπερήχους λιπιδίων από C. elegans
Ξεπαγώστε το σφαιρίδιο C. elegans στον πάγο και επαναιωρούμε με 0,5 ml υπερυάγουρα. 
Υπερήχηση των δειγμάτων C. elegans σε δοκιμαστικούς σωλήνες 1,5mL, διατηρώντας παράλληλα τα δείγματα συνεχώς στον πάγο.
Υπερήχηση μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας έναν καθετήρα-ultrasonicstor, όπως η Uf200 ः t, η μονάδα προετοιμασίας δείγματος υπερήχων VialTweeter (ταυτόχρονη υπερήχηση 10 δειγμάτων) ή UIP400MTP (για την υπερήχηση των πλακών πολλαπλών φρεατίων, όπως 96-καλά πλάκες). Για υπερήχων λύση με το UP200Ht χρησιμοποιήστε το μικρο-άκρη S26d2. Προ-που ο τρόπος υπερήχων κύκλο στο ψηφιακό μενού. Ρυθμίστε το πλάτος στο 10% και τον τρόπο κύκλου υπερήχων των παλμών 2 δευτερολέπτων των 20 κύκλων με μια παύση 30 sec. μεταξύ κάθε υπερηχητικής έκρηξης παλμού.
Μεταφέρετε τα υπερκείμενο σε γυάλινους σωλήνες με βιδωτό καπάκι. 
Πραγματοποιείται εκχύλιση folch προσθέτοντας 1 ml υπερυθυρίου σε κάθε γυάλινο σωλήνα και στη συνέχεια προσθέτοντας 6 ml μίγματος χλωροφόρμιου/μεθανόλης (λόγος = 2:1) σε κάθε γυάλινο σωλήνα.
Vortex κάθε γυάλινο σωλήνα για 30 δευτερόλεπτα για 4 φορές. 
Φυγοκεντρείται οι σωλήνες σε 1.258 x g για 15 λεπτά (Eppendorf, 5810 R) για την περαιτέρω ενίσχυση του διαχωρισμού φάσης. 
Μεταφέρουμε το κάτω υδρόφοβο κλάσμα σε ένα καθαρό γυάλινο σωλήνα με μια γυάλινη πιπέτα Pasteur. 
Στεγνώστε το χαμηλότερο υδρόφοβο κλάσμα κάτω από τη ροή αζώτου σε έναν εξατμιστή αζώτου. 
Φυλάσσετε το αποξηραμένο σφαιρίδιο σε καταψύκτη -80 °C μέχρι να το χρησιμοποιήσετε.

Υπερηχητική προετοιμασία των lysates σκουληκιών

Lysate σκουληκιών: Τα σκουλήκια σταδίων L4 συγκομίστηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές με το ρυθμιστικό διάλυμα M9 (42.26 mM Na2HPO4, 22,04 mM KH2Po4, 85,56 mM NaCl, και 0,87 mM MgSO4) για να αφαιρέσετε όλα τα βακτήρια. Μετά την αφαίρεση όσο το δυνατόν περισσότερο του ρυθμιστικού διαλύματος M9, τα σκουλήκια επαναιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM φωσφορικό β-γλυκερίνη, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 1 mM ορθοβαναδατίδα νατρίου, 5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 0,2 mM φαινυλμεθανονοφθοριλίου και αναστολέας της πρωτεάσης. Τα σκουλήκια πάγωσαν σε υγρό άζωτο και αποψύχθηκαν στους 37°C για τρεις φορές, τότε τα σκουλήκια ήταν sonicated σε ξηρό πάγο με μια υπερηχητική μονάδα VialTweeter για την ταυτόχρονη προετοιμασία των 10 σωλήνων δείγματος. Υπερήχηση πραγματοποιήθηκε σε 50% πλάτος σε 10 κύκλους των 2 sec. με 30 δευτερόλεπτα παύση μεταξύ των εκρήξεων υπερήχων. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12000 σ.α.λ. στους 4°C για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -70°C. Μια aliquot χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών από τη δοκιμασία Bradford.
Προσδιορισμός της ολικής γλουταθειόνης, GSH και GSSG: Για την ποσοτικοποίηση της γλουταθειόνης, τα άλατα και ο προσδιορισμός έγιναν την ίδια ημέρα. Οι προνύμφες που τρέφονται με γλυκόζη και ελέγχου L4 συγκομίστηκαν και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα M9 τρεις φορές. Μετά την αφαίρεση όσο το δυνατόν περισσότερο του M9 buffer, σκουλήκια ήταν reuspend σε παγωμένο μεταφωσφορικό οξύ (5% w / v), τότε σκουλήκια ήταν sonicated στον πάγο με ένα υπερηχητικό VialTweeter σε 50% πλάτος σε δέκα κύκλους υπερήχων των 2 sec. με 30 sec. παύση μεταξύ κάθε κύκλου. Στη συνέχεια, φυγοκεντρείται στις 12000 σ.α.λ. στις 4 ̊C για 15 λεπτά.
(βλ. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Γ. προετοιμασία δείγματος elegans πριν από την ανοσοκαταποθέτηση και το δυτικό λέκιασμα

Εν συντομία, για τα εμβρυϊκά εκχυλίσματα, οι προνύμφες C. elegans L1 καλλιεργούνταν σε μεγάλης κλίμακας υγρές καλλιέργειες S-medium μέχρι την ενηλικίωση. Τα έμβρυα συλλέχθηκαν με τη συνήθη μέθοδο χλωρίνης και ανεστάλησαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% γλυκερίνη, 0,05% NP-40, 1􏰅 Protease Αναστολέας Κοκτέιλ, και 1􏰅 Phosphatase Αναστολέας Κοκτέιλ Ι και ΙΙ), κατεψυγμένα γρήγορα σε υγρό άζωτο, και lysed με υπερήχων διαταραχή κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα υπερηχητικό με μικροδειχτήρα, όπως η Uf200 ः t με S26d2 για 10 παλμούς πάνω από 10 s σε πλάτος 30%. Εάν πρέπει να παρασκευαστεί μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων, VialTweeter ή το MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP για καλά πλάκες συνιστώνται. Μετά την υπερήχηση, τα εκχυλίσματα είχαν προ-εκκαθαριστεί με φυγοκέντρηση στα 30.000g για 20 λεπτά στους 4°C. Το προ-καθαρισμένο εκχύλισμα (300μg συνολικής πρωτεΐνης) επωάστηκε με 40μ􏰂g αντι-CDC-25.1 ενταφήνιου αντισώματος (αυτή η μελέτη) που διασταυρώθηκε με την πρωτεΐνη Α-αγαρόζη, ή ως έλεγχος, μια παρόμοια ποσότητα ανοσοσφαιρίνης κουνελιού (Ig)G που διασταυρώθηκε με την πρωτεΐνη Α-αγαρόζη χρησιμοποιήθηκε σε συνολικό όγκο 200μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει 1% NP-40, η συμπερίληψη των οποίων μείωσε τη μη ειδική σύνδεση πρωτεϊνών στη μήτρα. Τα δείγματα περιστρέφονταν για 1 ώρα στους 4°C, οι χάντρες πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και εκλούθηκαν με 30μl γλυκίνης/HCl και 200 mM NaCl, pH 2.2. Μετά την ανοσοπαρευθυνοποίηση, τα έλεως αραιώθηκαν σε 30μ􏰂l διαλύματος δείγματος SDS, θερμαινόμενα στους 95°C για 4 λεπτά, και συνήθως το 3% του συνόλου για τις εισροές και το 30% για τα εκλούσματα εφαρμόστηκαν στο SDS-PAGE ακολουθούμενο από το δυτικό λέκιασμα με αντι-CDC-25.1 (1:400), αντι-LIN-23 (1: 750), αντι-ubiquitin (1:1000), αντι-GSK3􏰁 (1:500), ή αντι-􏰁β-ακτίνη (1:2000) αντισώματα. Όταν τα εκχυλίσματα δεν υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταστολή, η ίδια ποσότητα συνολικής πρωτεΐνης που προέρχεται από τα εν λόγω εκχυλίσματα επαναιωρήθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, θερμαίνεται στους 95°C και στη συνέχεια εφαρμόστηκε απευθείας στο SDS-PAGE και αναλύθηκε με δυτικό λέκιασμα. (βλ. Segref et al. 2020)

Probe-τύπου insonifier UP200St για λύση

Υπερηχητικός διαταράκτης κυττάρων UP200St με μικρο-άκρη S26d2 για τη λύση και την εξαγωγή πρωτεΐνης

Υπερηχητική λύση κάτω από τον έλεγχο θερμοκρασίας prescise

The VialTweeter is a MultiSample Ultraonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.Ο ακριβής και αξιόπιστος έλεγχος θερμοκρασίας είναι ζωτικής σημασίας κατά το χειρισμό βιολογικών δειγμάτων. Οι υψηλές θερμοκρασίες ξεκινούν την θερμικά προκληθείσα πρωτεϊνική υποβάθμιση στα δείγματα.
Καθώς όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας του δείγματος, η υπερήχηση δημιουργεί θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελεγχθεί καλά όταν χρησιμοποιείτε το VialTweeter. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας κατά την προετοιμασία τους με το VialTweeter και VialPress για ανάλυση.

  1. Παρακολούθηση της θερμοκρασίας του δείγματος: Ο υπερηχητικός επεξεργαστής UP200St, ο οποίος οδηγεί το VialTweeter, είναι εξοπλισμένος με ένα έξυπνο λογισμικό και έναν αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στο UP200St και τοποθετήστε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε έναν από τους σωλήνες δείγματος. Μέσω ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του UP200St ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας για το δείγμα υπερήχων σας. Ο υπερηχητικός παράγοντας θα σταματήσει αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και θα σταματήσει μέχρι να μειωθεί η θερμοκρασία του δείγματος στη χαμηλότερη τιμή της καθορισμένης θερμοκρασίας ∆. Στη συνέχεια, η υπερήχηση ξεκινά αυτόματα και πάλι. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την υποβάθμιση που προκαλείται από τη θερμότητα.
  2. Το μπλοκ VialTweeter μπορεί να προψυχωθεί. Τοποθετήστε το μπλοκ VialTweeter (μόνο το sonotrode χωρίς μετατροπέα!) στο ψυγείο ή τον καταψύκτη για να προψύξετε το μπλοκ τιτανίου βοηθά στην αναβολή της αύξησης της θερμοκρασίας του δείγματος. Εάν είναι δυνατόν, το ίδιο το δείγμα μπορεί να προψυκτιστεί πάρα πολύ.
  3. Χρησιμοποιήστε ξηρό πάγο για να κρυώσει κατά τη διάρκεια υπερήχηση. Χρησιμοποιήστε ένα ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter στον ξηρό πάγο, έτσι ώστε η θερμότητα μπορεί να διαλύσει γρήγορα.

Βρείτε το βέλτιστο υπερηχητικό διαταράκτη κυττάρων για την εφαρμογή λύσης σας

Hielscher Ultrasonics είναι μακροπρόθεσμος έμπειρος κατασκευαστής υψηλής απόδοσης υπερήχων διαταράκτες κυττάρων και ομογενοποιητές για εργαστήρια, πάγκο-top και βιομηχανικά συστήματα κλίμακας. Το μέγεθος της βακτηριακής κυτταρικής καλλιέργειας, ο στόχος της έρευνας ή της παραγωγής σας και ο όγκος των κυττάρων που πρέπει να επεξεργάζονται ανά ώρα ή ημέρα είναι βασικοί παράγοντες για να βρείτε το σωστό υπερηχητικό διαταραχή των κυττάρων για την εφαρμογή σας.
Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις για την ταυτόχρονη υπερήχηση των πολλαπλών δειγμάτων (μέχρι 10 φιαλίδια), καθώς και δείγματα μάζας (δηλαδή, πλάκες microtiter / 96-καλά πλάκες), το κλασικό καθετήρα τύπου εργαστήριο ultrasonicator με διαφορετικά επίπεδα ισχύος από 50 έως 400 watt σε πλήρως βιομηχανική υπερήχων επεξεργαστές με έως και 16.000watts ανά μονάδα για εμπορική διαταραχή των κυττάρων και την εξαγωγή πρωτεΐνης σε μεγάλη παραγωγή. Όλοι οι υπερηχητικοί hielscher κατασκευάζονται για τη λειτουργία 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα/365 κάτω από το πλήρες φορτίο. Η ευρωστία και η αξιοπιστία είναι βασικά χαρακτηριστικά των υπερηχητικών συσκευών μας.
Όλοι οι ψηφιακοί υπερηχητικοί ομογενοποιητές είναι εξοπλισμένοι με το έξυπνο λογισμικό, την χρωματισμένη επίδειξη αφής και την αυτόματη protocolling στοιχείων, τα οποία κάνουν τη υπερηχητική συσκευή σε ένα κατάλληλο εργαλείο εργασίας στις εγκαταστάσεις εργαστηρίων και παραγωγής.
Ενημερώστε μας, τι είδους κύτταρα, τι όγκο, με ποια συχνότητα και με ποιο στόχο έχετε να επεξεργαστείτε τα βιολογικά δείγματα σας. Θα σας προτείνουμε το πιο κατάλληλο υπερηχητικό ς διαταράκτης κυττάρων για τις απαιτήσεις της διαδικασίας σας.

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερηχητικών συστημάτων μας από συμπαγείς χειρός ομογενοποιητές και MultiSample Ultrasonicators σε βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων για εμπορικές εφαρμογές:

Μαζική Όγκος Ρυθμός ροής Προτεινόμενες συσκευές
Πλάκες 96 φρεατίων / μικροτιετών μ.δ. UIP400MTP
10 φιαλίδια à 0,5 έως 1,5mL μ.δ. VialTweeter σε UP200St
0.01 έως 250mL 5 έως 100mL/min UP50H
0.01 έως 500mL 10 έως 200 ml / λεπτό UP100H
10 έως 2000mL 20 έως 400mL / λεπτό Uf200 ः t, UP400St
0.1 έως 20 λίτρα 0.2 έως 4 λίτρα / λεπτό UIP2000hdT
10 έως 100L 2 έως 10 λίτρα / λεπτό UIP4000hdT
μ.δ. 10 έως 100 λίτρα / λεπτό UIP16000
μ.δ. μεγαλύτερος σύμπλεγμα UIP16000

Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!

Ζητήστε περισσότερες πληροφορίες

Παρακαλούμε χρησιμοποιήστε την παρακάτω φόρμα για να ζητήσετε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με υπερήχους επεξεργαστές, εφαρμογές και τιμή. Θα χαρούμε να συζητήσουμε τη διαδικασία σας μαζί σας και να σας προσφέρουμε ένα υπερηχητικό σύστημα που πληροί τις απαιτήσεις σας!









Παρακαλείστε να σημειώσετε ότι η Πολιτική Απορρήτου.


Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Υπερήχων κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές για την ανάμειξη εφαρμογών, διασποράς, γαλακτωματοποίηση και εκχύλιση σε εργαστήριο, πιλοτική και βιομηχανική κλίμακα.

Λογοτεχνία / Αναφορές



Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζουμε

Καενορχάμπιτις ελεγκάνες

Το Γ. elegans είναι ένας ελεύθερος-ζωντανός διαφανής νηματώδης (roundworm) περίπου 1 mm στο μήκος, το οποίο τρέφεται με τα βακτηρίδια (π.χ. E. coli) και έχει έναν σχετικά σύντομο κύκλο ζωής. Στους 20 °C, το εργαστηριακό στέλεχος του C. elegans (N2) έχει μέση διάρκεια ζωής περίπου 2-3 εβδομάδες και χρόνο παραγωγής 3 έως 4 ημέρες. Όταν C. elegans καλλιεργούνται σε μεγάλους αριθμούς, το οποίο μπορεί εύκολα να γίνει υπό ακριβώς ελεγχόμενες συνθήκες εργαστηρίου, μπορούν εύκολα να ελεγχθούν για την αρχή εργασίας των νέων φαρμάκων, καθώς και τα αποτελέσματα και την αλληλεπίδρασή τους στο πλαίσιο πολύπλοκων μοριακών διεργασιών στην ανθρώπινη ασθένεια. Το σύντομο γονιδίωμα, ο σύντομος κύκλος ζωής και ο απλός χειρισμός σε εργαστηριακές ρυθμίσεις καθιστούν το C. elegans ιδανικό πρότυπο για έρευνα όπως η γονιδιωματική, η πρωτεομική, η αναπτυξιακή βιολογία, η έρευνα ασθενειών, η ανάπτυξη φαρμάκων κ.λπ.
Caenorhabditis elegans σκουλήκια μπορεί να είναι είτε αρσενικό ή ερμαφρόδιτο. Οι ερμαφρόδιτες έχουν και αρσενικά και θηλυκά αναπαραγωγικά όργανα. Ωστόσο, θηλυκά σκουλήκια δεν υπάρχουν. Ερμαφρόδιτα μπορεί είτε αυτο-γονιμοποίηση ή μπορεί επίσης να αναπαραχθούν με αρσενικά σκουλήκια. C. elegans μπορεί να παράγει πάνω από 1.000 αυγά κάθε μέρα.
Δεδομένου ότι το C. elegans είναι ένας από τους απλούστερους οργανισμούς με νευρικό σύστημα, το σκουλήκι νηματωδών χρησιμοποιείται από το 1963 ως πρότυπος οργανισμός για την έρευνα. Οι νευρώνες δεν φωτιά δυνατότητες δράσης, και δεν εκφράζουν καμία τάση-gated κανάλια νατρίου. Στον ερμαφρόδιτο, αυτό το σύστημα περιλαμβάνει 302 νευρώνες του οποίου το μοτίβο έχει χαρτογραφηθεί πλήρως, σε αυτό που είναι γνωστό ως connectome.
Πολλά από τα γονίδια στο γονιδίωμα C. elegans έχουν λειτουργικά αντίστοιχα στοιχεία στον άνθρωπο που το καθιστά ένα εξαιρετικά χρήσιμο μοντέλο για τις ανθρώπινες ασθένειες και χρησιμοποιείται για παράδειγμα για τη μελέτη της αναπτυξιακής βιολογίας, της γήρανσης και των παραγόντων που επηρεάζουν τη μακροζωία. Επιπλέον, οι μεταλλαγμένοι C. elegans παρέχουν μοντέλα για πολλές ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων νευρολογικών διαταραχών (π.χ. Αλτσχάιμερ), συγγενών καρδιακών παθήσεων και νεφροπαθών.
Αυτοί οι παράγοντες έκαναν c. elegans ένα ιδιαίτερα πολύτιμο πρότυπο για πολλούς ερευνητικούς τομείς. Κατά συνέπεια, το C. elegans ήταν ο πρώτος πολυκυτταρικός οργανισμός που έχει το σύνολο του γονιδιώματος του σε ακολουθία. Το γονιδίωμα περιέχει περίπου 20.470 γονίδια κωδικοποίησης πρωτεϊνών. Περίπου το 35% των γονιδίων C. elegans έχουν ανθρώπινες ομόλογα. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα ανθρώπινα γονίδια έχουν αποδειχθεί επανειλημμένα ότι αντικαθιστούν τις ομόλογες τους C. elegans όταν εισάγονται στο C. elegans. Αντίθετα, πολλά γονίδια C. elegans μπορούν να λειτουργήσουν παρόμοια με τα γονίδια θηλαστικών.

Η διάρκεια ζωής του C. elegans είναι περίπου 3 εβδομάδες και αποτελείται από έξι στάδια ζωής: εμβρυογένεση (στάδιο ωαρίων), τέσσερα στάδια προνύμφης (L1 έως L4), και το στάδιο ενηλίκων. Οι νηματώδεις εκκολάπτονται από αυγά καθώς οι προνύμφες L1 αποτελούνται από 560 κύτταρα. Η ανάπτυξη κατά τη διάρκεια κάθε σταδίου της προνύμφης εμφανίζεται ανά κυτταρική διαίρεση και με κυτταρική υπερτροφία. Η κοπή των κομμένων molting χαρακτηρίζει κάθε στάδιο της προνύμφης. Εάν οι σκληρές περιβαλλοντικές συνθήκες σηματοδοτούν στο αναπτυσσόμενο σκουλήκι ότι οι συνθήκες είναι απίθανο να υποστηρίξουν την ενήλικη γονιμότητα, το C. elegans μπορεί να αλλάξει την ανάπτυξή του και να διαμορφώσει ένα εναλλακτικό στάδιο προνύμφης L3, όπου οι προνύμφες πηγαίνουν σε ένα στάδιο dauer. Σε αυτή την κατάσταση, τα ζώα είναι εξαιρετικά ανθεκτικά στο στρες και μακράς διάρκειας ζωής και μπορούν να επιβιώσουν τρεις έως εννέα μήνες. Οι προνύμφες Dauer απομονώνονται από τις αντιξοότητες σφραγίζοντας τόσο τις στοματικές όσο και τις πρωκτικές κοιλότητες τους, συρρικνώνοντας το έντερό τους και ενεργοποιώντας ένα γενετικό πρόγραμμα που εξαρτάται από το daf-16/FOXO, το οποίο, μεταξύ άλλων, οδηγεί στην έκφραση μιας επιδερμίδας που αφορά το dauer. (πρβλ. Henderson et al., 2006)

Γ. προνύμφες elegans Dauer

Οι προνύμφες Dauer είναι ο όρος για τις προνύμφες νηματωδών, οι οποίες εισήλθαν σε εναλλακτικό στάδιο ανάπτυξης. ο όρος "προνύμφες Dauer" χρησιμοποιείται ιδιαίτερα για τα σκουλήκια της οικογένειας των ραβιδιδίδων, συμπεριλαμβανομένων των caenorhabditis elegans. Η λέξη "Dauer" είναι γερμανικής προέλευσης και σημαίνει” κατά την έννοια του “χρονικό διάστημα». Οι προνύμφες Dauer πηγαίνουν σε έναν τύπο στάσης και μπορούν να επιβιώσουν από σκληρές συνθήκες. Εάν και όταν μια προνύμφη εισέρχεται στο στάδιο dauer εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Οι προνύμφες Dauer μελετώνται εκτενώς στη βιολογία επειδή το laravae παρουσιάζει μια εξαιρετική ικανότητα να επιβιώνουν σκληρά περιβάλλοντα και να ζουν για εκτεταμένες χρονικές περιόδους. Για παράδειγμα, οι προνύμφες C. elegans dauer μπορούν να επιβιώσουν έως και τέσσερις μήνες, πολύ μεγαλύτερη από τη μέση διάρκεια ζωής τους περίπου τρεις εβδομάδες κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής αναπαραγωγικής ανάπτυξης.