Υπερήχων προετοιμασία των δειγμάτων C. elegans

Το C. elegans, ένας νηματώδης σκώληκας, είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος πρότυπος οργανισμός στη βιολογία. Η προετοιμασία του δείγματος πριν από την ανάλυση απαιτεί λύση, εκχύλιση πρωτεϊνών και λιπιδίων καθώς και κατακερματισμό RNA, η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί αξιόπιστα μέσω υπερήχων. Οι διαταράκτες κυττάρων υπερήχων είναι αξιόπιστες, εξελιγμένες και εύχρηστες συσκευές για τη γρήγορη προετοιμασία δειγμάτων C. elegans.

Υπερήχων προετοιμασία των δειγμάτων C. elegans

Τα C. elegans είναι σκουλήκια, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως σε ερευνητικά εργαστήρια για τη διερεύνηση της γονιδιωματικής, της αναπτυξιακής βιολογίας και των ασθενειών. Πολλά γονίδια στο γονιδίωμα του C. elegans έχουν λειτουργικά αντίστοιχα στους ανθρώπους. Με αυτόν τον τρόπο, ο νηματώδης σκώληκας είναι ένα εξαιρετικά χρήσιμο μοντέλο για ανθρώπινες ασθένειες. Άλλα πλεονεκτήματα για την ευρεία χρήση του C. elegans είναι η εύκολη και φθηνή καλλιέργειά του σε πλάκες που περιέχουν βακτήρια (π.χ. E. coli), η διαφάνειά του, ο άνετος χειρισμός του, καθώς και η δυνατότητα κατάψυξης και αποθήκευσης των σκουληκιών για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα.
Η ανάλυση πρωτεϊνών και λιπιδίων είναι τακτικές διαδικασίες σε εργαστήρια και η προετοιμασία δειγμάτων υπερήχων είναι η καθιερωμένη μέθοδος για τη λύση νηματωδών C. elegans σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο (δηλ. έμβρυα, προνύμφες L1-L4, ενήλικες). Δεδομένου ότι το C. elegans χρησιμοποιείται επίσης ως σύστημα έκφρασης πρωτεϊνών για την υπερέκφραση στοχευμένων πρωτεϊνών, απαιτείται μια αξιόπιστη, αναπαραγώγιμη μέθοδος λύσης και εκχύλισης πρωτεϊνών, η οποία δίνει υψηλές αποδόσεις πρωτεϊνών. Υπερήχων κυτταρική διαταραχή και συστήματα εκχύλισης είναι διαθέσιμα ως ομογενοποιητές τύπου καθετήρα και ως υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων. Τροφοδοσία για την κατάλληλη προετοιμασία δειγμάτων και όλα τα είδη των αριθμών μεγέθους δείγματος, Hielscher Υπέρηχοι έχει το ιδανικό υπερήχων διαταράκτη κυττάρων για την εργαστηριακή διαδικασία σας.

Πρωτόκολλα υπερήχων για διαταραχή και λύση C. elegans

Υπερήχων ομογενοποίηση και λύση του C. elegans και η επακόλουθη εκχύλιση πρωτεϊνών και λιπιδίων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ποικίλες διαδικασίες χρησιμοποιώντας διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα ομογενοποίησης και λύσης κλπ. Όλα τα πρωτόκολλα λύσης έχουν κοινό ότι τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται συνεχώς σε πάγο για να αποφευχθεί η αποικοδόμηση πρωτεϊνών. Παρακάτω, σας παρουσιάζουμε μερικά αξιόπιστα και γρήγορα πρωτόκολλα λύσης και εκχύλισης υπερήχων για την παρασκευή υψηλής ποιότητας δειγμάτων C. elegans που περιέχουν πρωτεΐνες ή λιπίδια.

Πλεονεκτήματα της υπερήχων C. elegans Lysis

• Αξιόπιστος
• Αναπαραχθούν
• με ακρίβειαελεγχόμενη θερμοκρασία
• Αξιόπιστος έλεγχος διεργασιών
• απαλή μέθοδος
• εύκολο στην εφαρμογή
• Ασφαλής

Υπερήχων πρωτεΐνη εκχύλιση από C. elegans δείγματα

Υπερήχων λύση και πρωτεΐνη εκχύλιση των σκουληκιών C. elegans μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας διάφορα πρωτόκολλα. Παρακάτω σας παρουσιάζουμε μερικά αξιόπιστα και γρήγορα πρωτόκολλα λύσης για αναπαραγώγιμα αποτελέσματα εκχύλισης πρωτεϊνών.

Ταχεία προετοιμασία του κυτταροσολικού εκχυλίσματος από σκουλήκια C. elegans με υπερήχους

Με το ακόλουθο πρωτόκολλο μπορείτε να παρασκευάσετε το C. elegans lysates σε λιγότερο από 30 λεπτά.
Συλλογή C. elegans
Διαλέξτε τα επιθυμητά σκουλήκια C. elegans σε φυσιολογικό ορό με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού σωλήνα (PBS) 1,5ml ή πλύνετε τα από ένα πιάτο με 1,5ml PBS. Φυγοκεντρήστε για 1 λεπτό στις 2000rpm σε σφαιρίδιο. Κρατήστε τα δείγματα ανά πάσα στιγμή σε πάγο.
Στη συνέχεια, πλύνετε τα σκουλήκια δύο φορές με PBS.
Στη συνέχεια, πλύνετε τα σκουλήκια δύο φορές με ddH₂O.
Επαναιωρήστε τους ιούς τύπου worm σε τουλάχιστον 500ul ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης (HB). Τα δείγματα σκουληκιών είναι τώρα έτοιμα για υπερηχητική λύση.
Για υψηλότερη ποιότητα εκχυλίσματος πρωτεΐνης, ίσως θελήσετε να μειώσετε τη βακτηριακή μόλυνση πλένοντας τα σκουλήκια για 5 λεπτά το καθένα σε PBS και αποστειρωμένο, εξαιρετικά καθαρό νερό (ddH₂O) ή να εκτελέσει επίπλευση σακχαρόζης. Κρατήστε τα δείγματα σκουληκιών συνεχώς σε πάγο.

Υπερήχων C. elegans Lysis Protocol

• Βεβαιωθείτε ότι προετοιμάζετε τον υπερηχητικό εκ των προτέρων, έτσι ώστε ο ομογενοποιητής υπερήχων να είναι έτοιμος για χρήση (καθετήρας τοποθετημένος, πρόγραμμα υπερήχων προκαθορισμένο).

Εάν ο υπερηχητικός σας είναι τοποθετημένος, τοποθετήστε το λουτρό πάγου με τους σωλήνες δείγματός σας κάτω από τον υπερηχητικό καθετήρα και εισάγετε τον υπερηχητικό καθετήρα στο σωλήνα 1.5ml.

• Για τη λύση C. elegans με το UP200St ή UP200Ht, υπερήχους θα πρέπει να πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ένα microtip (π.χ., 2mm καθετήρα S26d2; δείτε την εικόνα αριστερά) σε πλάτος 40% για 1sec με παύσεις 30sec ενδιάμεσα. 5 κύκλοι υπερήχων για κάθε 1 δευτερόλεπτο με παύσεις 30sec είναι ιδανικοί για τη λύση του C. elegans. Εάν εκτελέσετε τη λύση για πρώτη φορά, μπορείτε να ελέγξετε την εξέλιξη της λύσης σε μικρά κλάσματα του δείγματος μετά από κάθε παλμό χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο.
• Η λύση ολοκληρώνεται με επιτυχία όταν διαταράσσονται τα σκουλήκια. Υπερήχηση έχει ως αποτέλεσμα τη θραύση των πυρήνων και γίνεται ορατή όταν το δείγμα παίρνει ιξώδες ή αφρούς. Για να αποφύγετε την υποβάθμιση του δείγματος, χρησιμοποιήστε περισσότερους παλμούς εάν χρειάζεται. Μην αυξάνετε το χρόνο κάθε κύκλου παλμών υπερήχων για να πάρετε υψηλής ποιότητας εκχυλίσματα πρωτεΐνης.
• Καθαρίστε το προϊόν λύσης κυττάρων με φυγοκέντρηση των υπερηχητικά λυμένων σκουληκιών στις 14.000rpm για 10min στους 4ºC.
• Στη συνέχεια, μεταφέρετε το υπερκείμενο υγρό σε νέο σωλήνα και προετοιμαστείτε για ανοσοκατακρήμνιση ή άλλες δοκιμασίες.

Σημείωση για ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης: Προετοιμάστε το ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης για το παραπάνω πρωτόκολλο λύσης υπερήχων ως εξής:

Λύση υψηλής απόδοσης του C. elegans σε πλάκες 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας το UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (νηματώδη ενηλίκων)
UIP400MTP 80% πλάτος, 20 κύκλοι (κάθε κύκλος υπερήχων: 30 sec ON, 30 sec OFF)
Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης:

• Επιλογή 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• Επιλογή 2) για συνανοσοκατακρήμνιση (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (κοκτέιλ πλήρους αναστολέα πρωτεϊνάσης)

Κατακερματισμός DNA υψηλής απόδοσης
C. elegans (νηματώδη ενηλίκων) DNA 200-300bp: UIP400MTP υπερήχων πλάκας – Σετ 80% πλάτος, 30παλμοί – κάθε 30 δευτερόλεπτα επάνω, 30 δευτερόλεπτα μακριά

UIP400MTP Ο υπερηχητής πλάκας για την προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης υπερήχων ομοιόμορφα δείγματα σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων, μικροτιτλοδότησης και πλάκες 96 φρεατίων

Υπερήχων λύση του C. elegans για ποσοτικές δοκιμασίες καθαρισμού συγγένειας

Τα έμβρυα C. elegans (∼2 εκατομμύρια ανά αντίγραφο) συλλέχθηκαν πρόσφατα σε βιολογικό τριπλό με λεύκανση νεαρών ερμαφρόδιτων και υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο (κύκλος: 0,5 s, πλάτος: 40-45%, 5 εγκεφαλικά επεισόδια? συνεδρία, 5 συνεδρίες, διάστημα μεταξύ συνεδριών: 30 s; UP200S υπερήχων επεξεργαστή με μικρο-άκρη S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (συνολικός όγκος: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% γλυκερόλη, μείγμα αναστολέα πρωτεάσης, 0.1% Nonidet P-40 υποκατάστατο). Μετά από υπερήχους, το υποκατάστατο Nonidet P-40 προστέθηκε έως και 1% και τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν με περιστροφή κεφαλής πάνω από την ουρά στους 4 ° C για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα 20.000 × g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, το καθαρισμένο προϊόν λύσης αναρροφήθηκε χωρίς να διαταραχθεί η ανώτερη λιπιδική στιβάδα και χωρίστηκε κατά το ήμισυ είτε στα σφαιρίδια αγαρόζης κατά της GFP είτε στα φραγμένα σφαιρίδια ελέγχου (40–50 μl). Μετά την περιστροφή της ουράς στους 4°C για 60–90 λεπτά, τα σφαιρίδια πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιείχε 0,1% υποκατάστατο Nonidet P-40, ακολουθούμενο από δύο φορές πλύσης είτε στο ρυθμιστικό διάλυμα I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) είτε στο ρυθμιστικό διάλυμα II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ή και τα δύο. Για τα pull-down GFP:MBK-2, πραγματοποιήθηκαν δύο ξεχωριστά πειράματα χρησιμοποιώντας διαφορετικές συνθήκες πλύσης. Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με τροχιακή ανάδευση σε 50 μl ουρίας 6 m/2 M θειουρίας σε θερμοκρασία δωματίου. Για τα πειράματα έλξης MBK-1::GFP, οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν δύο φορές με ανακίνηση σε 50μl χλωριούχου γουανιδινίου 8 m στους 90°C, ακολουθούμενη από καθίζηση αιθανόλης. Τα δείγματα εκλουσμένης πρωτεΐνης στη συνέχεια χωνεύτηκαν σε διάλυμα.
(πρβλ. Chen et al., 2016)

Υπερήχων ομογενοποίηση σκουληκιών και λύση

Για τη διαδικασία λύσης και εκχύλισης πρωτεϊνών C.elegans, συλλέχθηκαν 30.000 nemotodes του σχετικού σταδίου ανά δείγμα και πλύθηκαν σε παγωμένο S-βασικό, συμπυκνώθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1500 rpm για 2 λεπτά, πλύθηκαν έξι φορές με παγωμένο S-βασικό για την απομάκρυνση των υπολειμματικών βακτηρίων και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε πάγο μέχρι να είναι έτοιμα για χρήση. Για την εκχύλιση πρωτεΐνης, τα σκουλήκια ενηλίκων ζώων αφέθηκαν να σχηματίσουν ένα συμπαγές σφαιρίδιο μετά την τελευταία πλύση S-basal. Τα σφαιρίδια σκουληκιών στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε 1 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης [20 mM φωσφορικού καλίου, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, αναστολείς πρωτεάσης (Sigma P2714)] και υποβλήθηκαν σε άμεση επεξεργασία.
∼30.000 σκουλήκια βαρύτητας-ενηλίκων (που αντιστοιχούν σε ∼100 mg υγρού βάρους), υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό τύπο καθετήρα (π.χ. UP50H με microtip MS2) σε πλάτος 40% για 10 κύκλους 3 δευτερολέπτων επάνω, 30 δευτερόλεπτα μακριά, σε 1 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης. (πρβλ. Baskharan et al. 2012)

Υπερήχων εκχύλιση λιπιδίων από C. elegans

Στη λιπιδιωματική, έναν κλάδο της μεταβολομικής, χαρακτηρίζεται και αναλύεται το λιπιδικό συμπλήρωμα των βιολογικών συστημάτων. Τα C. elegans χρησιμοποιούνται ευρέως στη λιπιδιωματική για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των μεταβολικών λιπιδίων και των επιπτώσεών τους στην υγεία και τη διάρκεια ζωής.
Υπερήχων λύση και εκχύλιση χρησιμοποιείται για την απελευθέρωση λιπιδίων όπως σφιγγολιπίδια από έμβρυα C. elegans, προνύμφες, και ενήλικα σκουλήκια. Υπερήχους χρησιμοποιείται για την παρασκευή ομογενοποιημένων σκουληκιών και στη συνέχεια για την εξαγωγή των λιπιδίων από το δείγμα.
Πρωτόκολλο για εκχύλιση λιπιδίων με υπερήχους από C. elegans
Το σφαιρίδιο C. elegans αποψύχεται σε πάγο και επαναιωρείται με 0,5 ml υπερνερού. 
Κατεργασία με υπερήχους των δειγμάτων C. elegans σε δοκιμαστικούς σωλήνες 1,5mL, διατηρώντας παράλληλα τα δείγματα συνεχώς σε πάγο.
Κατεργασία με υπερήχους μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας έναν καθετήρα-υπερήχων όπως το UP200Ht, η μονάδα προετοιμασίας δείγματος υπερήχων VialTweeter (ταυτόχρονη υπερήχηση 10 δειγμάτων) ή το UIP400MTP (για την υπερήχηση πλακών πολλαπλών φρεατίων, όπως πλάκες 96 φρεατίων). Για υπερηχητική λύση με το UP200Ht χρησιμοποιήστε το μικρο-άκρο S26d2. Προρυθμίστε τη λειτουργία κύκλου υπερήχων στο ψηφιακό μενού. Ρυθμίστε το πλάτος στο 10% και τη λειτουργία κύκλου υπερήχων 2 sec παλμούς 20 κύκλων με παύση 30 sec. μεταξύ κάθε έκρηξης παλμών υπερήχων.
Μεταφέρετε τα υπερκείμενα σε γυάλινους σωλήνες με βιδωτό πώμα. 
Εκτελείται εκχύλιση Folch προσθέτοντας 1 ml υπερνερού σε κάθε γυάλινο σωλήνα, ακολουθούμενη από την προσθήκη 6 ml μείγματος χλωροφορμίου/μεθανόλης (αναλογία = 2:1) σε κάθε γυάλινο σωλήνα.
Vortex κάθε γυάλινο σωλήνα για 30 δευτερόλεπτα για 4 φορές. 
Φυγοκεντρήστε τους σωλήνες στα 1.258 x g για 15 λεπτά (Eppendorf, 5810 R) για περαιτέρω ενίσχυση του διαχωρισμού φάσης. 
Μεταφέρετε το κατώτερο υδρόφοβο κλάσμα σε καθαρό γυάλινο σωλήνα με γυάλινη πιπέτα Παστέρ. 
Ξηραίνεται το κατώτερο υδρόφοβο κλάσμα υπό ροή αζώτου σε εξατμιστή αζώτου. 
Αποθηκεύστε το αποξηραμένο σφαιρίδιο σε καταψύκτη -80 °C μέχρι τη χρήση.

Υπερήχων προετοιμασία των λυμάτων σκουληκιών

Προϊόν λύσης σκουληκιών: Τα σκουλήκια σταδίου L4 συλλέχθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 μΜ KH₂Τ.Κ.₄, 85,56 mM NaCl και 0,87 mM MgSO₄) προκειμένου να απομακρυνθούν όλα τα βακτήρια. Μετά την αφαίρεση όσο το δυνατόν περισσότερου ρυθμιστικού διαλύματος M9, τα σκουλήκια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM φωσφορικό β-γλυκερόλη, 0,1% (v/v) Triton X-100, φθοριούχο νάτριο 50 mM, ορθοβαναδικό νάτριο 1 mM, πυροφωσφορικό νάτριο 5 mM, φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο 0,2 mM και αναστολέας πρωτεάσης. Τα σκουλήκια καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποψύχθηκαν στους 37 ° C για τρεις φορές, στη συνέχεια τα σκουλήκια υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε ξηρό πάγο με μια υπερηχητική μονάδα VialTweeter για την ταυτόχρονη προετοιμασία 10 σωλήνων δείγματος. Κατεργασία με υπερήχους πραγματοποιήθηκε σε πλάτος 50% σε 10 κύκλους των 2 sec. με παύση 30 sec μεταξύ των εκρήξεων υπερήχων. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12000 rpm στους 4°C για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο υγρό συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -70°C. Ένα κλάσμα χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών από τη δοκιμασία Bradford.
Προσδιορισμός ολικής γλουταθειόνης, GSH και GSSG: Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γλουταθειόνης, τα προϊόντα λύσης και ο προσδιορισμός έγιναν την ίδια ημέρα. Οι προνύμφες L4 που τρέφονταν με γλυκόζη και ελέγχονταν συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα M9 τρεις φορές. Μετά την αφαίρεση όσο το δυνατόν περισσότερου ρυθμιστικού διαλύματος M9, τα σκουλήκια επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο μεταφωσφορικό οξύ (5% w? v), στη συνέχεια τα σκουλήκια υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο με υπερηχητικό VialTweeter σε πλάτος 50% σε δέκα κύκλους υπερήχων 2 sec. με παύση 30 sec. μεταξύ κάθε κύκλου. Στη συνέχεια, φυγοκεντρείται στις 12000 σ.α.λ. στους 4 ̊C για 15 λεπτά.
(πρβλ. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Προετοιμασία δείγματος πριν από την ανοσοκατακρήμνιση και τη δυτική κηλίδωση

Εν συντομία, για εμβρυϊκά εκχυλίσματα, οι προνύμφες C. elegans L1 αναπτύχθηκαν σε μεγάλης κλίμακας υγρές καλλιέργειες S-medium μέχρι την ενηλικίωση. Τα έμβρυα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο χλωρίνης και αιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% γλυκερόλη, 0.05% NP-40, 1􏰅 κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης 1 και II 1􏰅), γρήγορα κατεψυγμένα σε υγρό άζωτο και λύθηκαν με διαταραχή των υπερηχητικών κυττάρων χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό με microtip όπως το UP200Ht με S26d2 για 10 παλμούς άνω των 10 δευτερολέπτων σε πλάτος 30%. Εάν πρέπει να παρασκευαστεί μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων, ο υπερήχων VialTweeter ή συνιστάται η UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator για καλά πιάτα. Μετά από κατεργασία με υπερήχους, τα εκχυλίσματα καθαρίστηκαν εκ των προτέρων με φυγοκέντρηση στα 30.000g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το προ-καθαρισμένο εκχύλισμα (300μg ολικής πρωτεΐνης) επωάστηκε με 40μ􏰂g αντι-CDC-25.1 καθαρισμένου αντισώματος συγγένειας (αυτή η μελέτη) διασυνδεδεμένο με την πρωτεΐνη Α-αγαρόζη, ή ως μάρτυρας, μια παρόμοια ποσότητα ανοσοσφαιρίνης κουνελιού (Ig)G διασταυρωμένη με την πρωτεΐνη Α-αγαρόζη χρησιμοποιήθηκε σε συνολικό όγκο 200μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει 1% NP-40, η συμπερίληψη του οποίου μείωσε τη μη ειδική δέσμευση πρωτεϊνών στη μήτρα. Τα δείγματα περιστράφηκαν για 1 ώρα στους 4°C, τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και εκλούστηκαν με 30μl γλυκίνης/HCl και 200 mM NaCl, pH 2,2. Μετά την ανοσοκατακρήμνιση, τα εκλούσματα αραιώθηκαν σε 30μ􏰂l ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS, θερμάνθηκαν στους 95 ° C για 4 λεπτά και τυπικά το 3% του συνόλου για την είσοδο και το 30% για τα εκλούσματα εφαρμόστηκαν στο SDS-PAGE ακολουθούμενο από Western blotting με αντι-CDC-25.1 (1:400), αντι-LIN-23 (1:750), αντι-ουβικουιτίνη (1:1000), αντι-GSK3􏰁 (1:500) ή αντι-􏰁β-ακτίνη (1:2000) αντισώματα. Όταν τα εκχυλίσματα δεν υποβλήθηκαν σε ανοσοκατακρήμνιση, η ίδια ποσότητα ολικής πρωτεΐνης που προέρχεται από αυτά τα εκχυλίσματα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, θερμάνθηκε στους 95 ° C και στη συνέχεια εφαρμόστηκε απευθείας στο SDS-PAGE και αναλύθηκε με Western blotting. (πρβλ. Segref et al. 2020)

Υπερήχων Λύση υπό έλεγχο θερμοκρασίας Prescise

Ο ακριβής και αξιόπιστος έλεγχος της θερμοκρασίας είναι ζωτικής σημασίας κατά το χειρισμό βιολογικών δειγμάτων. Οι υψηλές θερμοκρασίες προκαλούν θερμικά επαγόμενη αποικοδόμηση πρωτεϊνών σε δείγματα.
Όπως όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων, κατεργασία με υπερήχους δημιουργεί θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελεγχθεί καλά όταν χρησιμοποιείτε το VialTweeter. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας ενώ τα προετοιμάζουμε με το VialTweeter και το VialPress για ανάλυση.

1. Παρακολούθηση της θερμοκρασίας δείγματος: Ο υπερηχητικός επεξεργαστής UP200St, ο οποίος οδηγεί το VialTweeter, είναι εξοπλισμένος με ένα έξυπνο λογισμικό και έναν αισθητήρα θερμοκρασίας με δυνατότητα σύνδεσης. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στο UP200St και τοποθετήστε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε έναν από τους σωλήνες δείγματος. Μέσω ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του UP200St ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασιών για το δείγμα σας με υπερήχους. Ο υπερηχητικός θα σταματήσει αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και θα σταματήσει έως ότου η θερμοκρασία δείγματος μειωθεί στη χαμηλότερη τιμή της ρυθμισμένης θερμοκρασίας ∆. Στη συνέχεια, η υπερήχηση ξεκινά αυτόματα και πάλι. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την υποβάθμιση που προκαλείται από τη θερμότητα.
2. Το μπλοκ VialTweeter μπορεί να προψυχθεί. Βάλτε το μπλοκ VialTweeter (μόνο το sonotrode χωρίς μορφοτροπέα!) στο ψυγείο ή τον καταψύκτη για να προψύξετε το μπλοκ τιτανίου βοηθά στην αναβολή της αύξησης της θερμοκρασίας στο δείγμα. Εάν είναι δυνατόν, το ίδιο το δείγμα μπορεί επίσης να προψυχθεί.
3. Χρησιμοποιήστε ξηρό πάγο για να κρυώσει κατά τη διάρκεια της υπερήχησης. Χρησιμοποιήστε ένα ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter στον ξηρό πάγο έτσι ώστε η θερμότητα να μπορεί να διαλυθεί γρήγορα.

Βρείτε τον βέλτιστο υπερηχητικό κυτταρικό διαταράκτη για την εφαρμογή λύσης

Hielscher Υπέρηχοι είναι μακροχρόνια έμπειρος κατασκευαστής υψηλής απόδοσης υπερήχων διαταράκτες κυττάρων και ομογενοποιητές για εργαστήρια, πάγκο-top και συστήματα βιομηχανικής κλίμακας. Το μέγεθος της βακτηριακής κυτταροκαλλιέργειας, ο στόχος έρευνας ή παραγωγής και ο όγκος του κυττάρου που πρέπει να επεξεργαστεί ανά ώρα ή ημέρα είναι βασικοί παράγοντες για να βρείτε τον σωστό υπερηχητικό κυτταρικό διαταράκτη για την εφαρμογή σας.
Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες λύσεις για την ταυτόχρονη υπερήχηση των πολλαπλών δειγμάτων (μέχρι 10 φιαλίδια), καθώς και δείγματα μάζας (δηλαδή, πλάκες μικροτιτλοδότησης? πλάκες 96-φρεάτιο), το κλασικό εργαστήριο-τύπου καθετήρα υπερήχων με διαφορετικά επίπεδα ισχύος από 50 να 400 watts σε πλήρως βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων με έως 16.000watts ανά μονάδα για εμπορική διαταραχή κυττάρων και εκχύλιση πρωτεϊνών σε μεγάλη παραγωγή. Όλοι οι υπερήχων Hielscher είναι κατασκευασμένοι για τη λειτουργία 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα/365 υπό πλήρες φορτίο. Η ευρωστία και η αξιοπιστία είναι βασικά χαρακτηριστικά των συσκευών υπερήχων μας.
Όλοι οι ψηφιακοί ομογενοποιητές υπερήχων είναι εξοπλισμένοι με έξυπνο λογισμικό, έγχρωμη οθόνη αφής και αυτόματο πρωτόκολλο δεδομένων, που καθιστούν τη συσκευή υπερήχων σε ένα βολικό εργαλείο εργασίας στο εργαστήριο και τις εγκαταστάσεις παραγωγής.
Ενημερώστε μας, τι είδους κύτταρα, τι όγκο, με ποια συχνότητα και με ποιο στόχο πρέπει να επεξεργαστείτε τα βιολογικά σας δείγματα. Θα σας προτείνουμε τον καταλληλότερο διαταράκτη κυττάρων υπερήχων για τις απαιτήσεις της διαδικασίας σας.

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερηχητικών συστημάτων μας από συμπαγείς ομογενοποιητές χειρός και MultiSample Ultrasonicators σε βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων για εμπορικές εφαρμογές: