Παρασκευή δειγμάτων C. Elegans με υπερήχους

Ο C. elegans, ένας νηματώδης σκώληκας, είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος οργανισμός μοντέλο στη βιολογία. Η παρασκευή δειγμάτων πριν από την ανάλυση απαιτεί λύση, εκχύλιση πρωτεϊνών και λιπιδίων, καθώς και κατακερματισμό RNA, διεργασίες που μπορούν να πραγματοποιηθούν αξιόπιστα μέσω κατεργασίας με υπερήχους. Οι συσκευές κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους είναι αξιόπιστες, προηγμένες και εύχρηστες συσκευές για την ταχεία παρασκευή δειγμάτων C. elegans.

Παρασκευή δειγμάτων C. elegans με υπερήχους

Οι C. elegans είναι νηματώδεις σκώληκες που χρησιμοποιούνται ευρέως σε ερευνητικά εργαστήρια για τη μελέτη της γονιδιωματικής, της αναπτυξιακής βιολογίας και των ασθενειών. Πολλά γονίδια στο γονιδίωμα του C. elegans έχουν λειτουργικά αντίστοιχα στον άνθρωπο. Επομένως, ο νηματώδης σκώληκας αποτελεί ένα εξαιρετικά χρήσιμο μοντέλο για τις ανθρώπινες ασθένειες. Άλλα πλεονεκτήματα που συμβάλλουν στην ευρεία χρήση του C. elegans είναι η εύκολη και οικονομική καλλιέργειά του σε τρυβλία που περιέχουν βακτήρια (π.χ. E. coli), η διαφάνειά του, ο εύκολος χειρισμός του, καθώς και η δυνατότητα κατάψυξης και αποθήκευσης των σκωλήκων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα.
Η ανάλυση πρωτεϊνών και λιπιδίων αποτελεί συνήθη διαδικασία στα εργαστήρια και η παρασκευή δειγμάτων με υπερήχους είναι η καθιερωμένη μέθοδος για τη λύση των νηματωδών C. elegans σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο (δηλ. έμβρυα, προνύμφες L1–L4, ενήλικα άτομα). Επειδή ο C. elegans χρησιμοποιείται επίσης ως σύστημα πρωτεϊνικής έκφρασης για την υπερέκφραση πρωτεϊνών στόχων, απαιτείται μια αξιόπιστη, αναπαραγώγιμη μέθοδος λύσης και εκχύλισης πρωτεϊνών που να παρέχει υψηλές αποδόσεις πρωτεϊνών. Τα συστήματα κυτταρικής διάρρηξης και εκχύλισης με υπερήχους διατίθενται ως ομογενοποιητές με ακίδα και ως συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων. Για την εύκολη παρασκευή δειγμάτων κάθε μεγέθους και πλήθους, η Hielscher Ultrasonics διαθέτει την ιδανική συσκευή κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για την εργαστηριακή σας διαδικασία.

Πρωτόκολλα διάρρηξης και λύσης του C. Elegans με υπερήχους

Η ομογενοποίηση και η λύση του C. elegans με υπερήχους και η επακόλουθη εκχύλιση πρωτεϊνών και λιπιδίων μπορούν να πραγματοποιηθούν με ποικίλες διαδικασίες, χρησιμοποιώντας διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα ομογενοποίησης και λύσης κ.λπ. Όλα τα πρωτόκολλα λύσης έχουν ως κοινή απαίτηση τη συνεχή διατήρηση των δειγμάτων σε πάγο, ώστε να αποτρέπεται η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών. Παρακάτω παρουσιάζουμε ορισμένα αξιόπιστα και γρήγορα πρωτόκολλα λύσης και εκχύλισης με υπερήχους για την παρασκευή δειγμάτων C. elegans υψηλής ποιότητας που περιέχουν πρωτεΐνες ή λιπίδια.

Πλεονεκτήματα της λύσης του C. elegans με υπερήχους

• αξιόπιστη
• αναπαραγώγιμη
• με ακριβή έλεγχο της θερμοκρασίας
• αξιόπιστος έλεγχος της διεργασίας
• ήπια μέθοδος
• εύκολη στην εφαρμογή
• ασφαλής

Εκχύλιση πρωτεϊνών από δείγματα C. elegans με υπερήχους

Η λύση και η εκχύλιση πρωτεϊνών από σκώληκες C. elegans με υπερήχους μπορούν να πραγματοποιηθούν με διάφορα πρωτόκολλα. Παρακάτω παρουσιάζουμε μερικά αξιόπιστα και γρήγορα πρωτόκολλα λύσης για αναπαραγώγιμα αποτελέσματα εκχύλισης πρωτεϊνών.

Ταχεία παρασκευή κυτταροδιαλυτού εκχυλίσματος από σκώληκες C. elegans με κατεργασία με υπερήχους

Με το ακόλουθο πρωτόκολλο μπορείτε να παρασκευάσετε προϊόντα λύσης C. elegans σε λιγότερο από 30 λεπτά.
Συλλογή του C. elegans
Μεταφέρετε τους επιθυμητούς σκώληκες C. elegans σε σωλήνα 1,5ml που περιέχει φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) ή συλλέξτε τους από ένα τρυβλίο εκπλένοντάς το με 1,5ml PBS. Φυγοκεντρήστε για 1min στις 2000rpm για να σχηματιστεί ίζημα. Διατηρείτε τα δείγματα συνεχώς σε πάγο.
Στη συνέχεια, πλύνετε τους σκώληκες δύο φορές με PBS.
Έπειτα, πλύνετε τους σκώληκες δύο φορές με ddH₂O.
Επαναιωρήστε τους σκώληκες σε τουλάχιστον 500ul ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης (HB). Τα δείγματα σκωλήκων είναι πλέον έτοιμα για λύση με υπερήχους.
Για υψηλότερη ποιότητα του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος, μπορείτε να μειώσετε τη βακτηριακή επιμόλυνση πλένοντας τους σκώληκες για 5min ανά μέσο σε PBS και σε στείρο, υπερκάθαρο νερό (ddH₂O) ή να πραγματοποιήσετε επίπλευση σε σακχαρόζη. Διατηρείτε τα δείγματα σκωλήκων συνεχώς σε πάγο.

Πρωτόκολλο λύσης του C. elegans με υπερήχους

• Βεβαιωθείτε ότι έχετε προετοιμάσει εκ των προτέρων τη συσκευή υπερήχων, ώστε ο ομογενοποιητής υπερήχων να είναι έτοιμος για χρήση (τοποθετημένη ακίδα, προρυθμισμένο πρόγραμμα κατεργασίας με υπερήχους). 

Εάν η συσκευή υπερήχων σας είναι τοποθετημένη σε βάση, τοποθετήστε το παγόλουτρο με τους σωλήνες των δειγμάτων σας κάτω από τον καθετήρα υπερήχων και εισαγάγετε τον καθετήρα υπερήχων στον σωλήνα των 1,5ml.

• Για τη λύση του C. elegans με το UP200St ή το UP200Ht, η κατεργασία με υπερήχους πρέπει να πραγματοποιείται με μικροακίδα (π.χ., καθετήρα S26d2 των 2mm· βλ. εικόνα αριστερά) σε πλάτος ταλάντωσης 40% για 1sec με ενδιάμεσες παύσεις 30sec. 5 κύκλοι κατεργασίας με υπερήχους διάρκειας 1 δευτερολέπτου ο καθένας, με παύσεις 30sec, είναι ιδανικοί για τη λύση του C. elegans. Εάν πραγματοποιείτε τη λύση για πρώτη φορά, μπορείτε να ελέγχετε την πρόοδό της σε μικρά κλάσματα του δείγματος μετά από κάθε παλμό, χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο.
• Η λύση ολοκληρώνεται επιτυχώς όταν οι σκώληκες έχουν υποστεί διάρρηξη. Η υπερβολική κατεργασία με υπερήχους προκαλεί θραύση των πυρήνων και γίνεται αντιληπτή όταν το δείγμα γίνεται ιξώδες ή αφρίζει. Για να αποτρέψετε την υποβάθμιση του δείγματος, χρησιμοποιήστε περισσότερους παλμούς, εάν χρειάζεται. Μην αυξάνετε τη διάρκεια κάθε κύκλου παλμών υπερήχων, ώστε να λαμβάνετε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα υψηλής ποιότητας.
• Διαυγάστε το κυτταρικό λύμα φυγοκεντρώντας τους σκώληκες που έχουν υποστεί λύση με υπερήχους στις 14.000rpm για 10min στους 4ºC.
• Στη συνέχεια, μεταφέρετε το υπερκείμενο σε νέο σωλήνα και προετοιμάστε το για ανοσοκατακρήμνιση ή άλλες δοκιμασίες.

Σημείωση για το ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης: Προετοιμάστε το ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης για το παραπάνω πρωτόκολλο λύσης με υπερήχους ως εξής:

Λύση C. elegans υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας σε πλάκες 96 βοθρίων με τη συσκευή υπερήχων για πλάκες UIP400MTP

Λύση C. elegans (ενήλικοι νηματώδεις)
UIP400MTP, πλάτος ταλάντωσης 80%, 20 κύκλοι (κάθε κύκλος κατεργασίας με υπερήχους: 30 sec λειτουργίας, 30 sec παύσης)
Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης:

• Επιλογή 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Επιλογή 2) για συνανοσοκατακρήμνιση (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (κοκτέιλ αναστολέων πρωτεϊνασών Complete)

Κατακερματισμός DNA υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας
DNA C. elegans (ενήλικοι νηματώδεις) 200–300bp: συσκευή υπερήχων για πλάκες UIP400MTP – ρυθμίστε το πλάτος ταλάντωσης στο 80%, 30 παλμοί – ο καθένας με 30sec λειτουργίας, 30sec παύσης

Η συσκευή υπερήχων για πλάκες UIP400MTP για προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας υποβάλλει ομοιόμορφα σε κατεργασία με υπερήχους δείγματα σε πλάκες πολλαπλών βοθρίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης και πλάκες 96 βοθρίων

Λύση C. elegans με υπερήχους για ποσοτικές δοκιμασίες καθαρισμού συγγένειας

Έμβρυα C. elegans (∼2 εκατομμύρια ανά επανάληψη) συλλέχθηκαν πρόσφατα σε τρεις βιολογικές επαναλήψεις με επεξεργασία νεαρών ερμαφρόδιτων ατόμων που έφεραν αυγά με λευκαντικό διάλυμα και υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους επί πάγου (κύκλος: 0,5 s, πλάτος ταλάντωσης: 40–45%, 5 παλμοί/συνεδρία, 5 συνεδρίες, διάστημα μεταξύ συνεδριών: 30 s· επεξεργαστής υπερήχων UP200S με μικροακίδα S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (συνολικός όγκος: ∼600 μl· 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% γλυκερόλη, μείγμα αναστολέων πρωτεασών, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Μετά την κατεργασία με υπερήχους, προστέθηκε Nonidet P-40 Substitute έως συγκέντρωση 1% και τα λύματα επωάστηκαν με περιστροφή άκρου προς άκρο στους 4°C για 30 min, και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 20.000 × g για 20 min στους 4°C. Στη συνέχεια, το διαυγασμένο λύμα αναρροφήθηκε χωρίς να διαταραχθεί η ανώτερη λιπιδική στιβάδα και διαιρέθηκε σε δύο ίσα μέρη, τα οποία προστέθηκαν αντίστοιχα στα σφαιρίδια αγαρόζης anti-GFP ή στα σφαιρίδια μάρτυρα που είχαν υποβληθεί σε αποκλεισμό μη ειδικών θέσεων δέσμευσης (40–50 μl). Μετά από περιστροφή άκρου προς άκρο στους 4°C για 60–90 min, τα σφαιρίδια πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιείχε 0,1% Nonidet P-40 Substitute, και ακολούθησαν δύο πλύσεις είτε με ρυθμιστικό διάλυμα I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) είτε με ρυθμιστικό διάλυμα II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) είτε και με τα δύο. Για τις δοκιμασίες κατακρήμνισης συγγένειας GFP:MBK-2, πραγματοποιήθηκαν δύο ξεχωριστά πειράματα με διαφορετικές συνθήκες πλύσης. Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με τροχιακή ανάδευση σε 50 μl διαλύματος 6 m ουρίας/2 M θειουρίας σε θερμοκρασία δωματίου. Για τα πειράματα κατακρήμνισης συγγένειας MBK-1::GFP, οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν δύο φορές με ανάδευση σε 50μl διαλύματος 8 m χλωριούχου γουανιδινίου στους 90°C, και ακολούθησε κατακρήμνιση με αιθανόλη. Στη συνέχεια, τα δείγματα των εκλουσμένων πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε πέψη εντός διαλύματος.
(πρβλ. Chen et al., 2016)

Ομογενοποίηση και λύση σκωλήκων με υπερήχους

Για τη διαδικασία λύσης και εκχύλισης πρωτεϊνών από C.elegans, συλλέχθηκαν 30.000 νηματώδεις του αντίστοιχου σταδίου ανά δείγμα και πλύθηκαν σε παγωμένο S-basal, συμπυκνώθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1500 rpm για 2 min., πλύθηκαν έξι φορές με παγωμένο S-basal για την απομάκρυνση των υπολειμματικών βακτηρίων και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε πάγο μέχρι τη χρήση. Για την εκχύλιση πρωτεϊνών, οι ωοφόροι ενήλικοι σκώληκες αφέθηκαν να σχηματίσουν συμπαγές ίζημα μετά την τελευταία πλύση με S-basal. Τα ιζήματα των σκωλήκων επαναιωρήθηκαν στη συνέχεια σε 1 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης [20 mM φωσφορικό κάλιο, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, αναστολείς πρωτεασών (Sigma P2714)] και υποβλήθηκαν αμέσως σε επεξεργασία.
∼30.000 ωοφόροι ενήλικοι σκώληκες (που αντιστοιχούν σε ∼100 mg υγρού βάρους) υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους σε πάγο, με συσκευή υπερήχων τύπου ακίδας (π.χ. UP50H με μικροακίδα MS2), σε πλάτος 40% για 10 κύκλους των 3 sec λειτουργίας και 30 sec παύσης, σε 1 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης. (πρβλ. Baskharan et al. 2012)

Εκχύλιση λιπιδίων από C. elegans με υπερήχους

Στη λιπιδωμική, έναν κλάδο της μεταβολομικής, χαρακτηρίζεται και αναλύεται το σύνολο των λιπιδίων των βιολογικών συστημάτων. Οι C. elegans χρησιμοποιούνται ευρέως στη λιπιδωμική για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των μεταβολικών λιπιδίων και των επιδράσεών τους στην υγεία και τη διάρκεια ζωής.
Η λύση και η εκχύλιση με υπερήχους χρησιμοποιούνται για την απελευθέρωση λιπιδίων, όπως τα σφιγγολιπίδια, από έμβρυα, προνύμφες και ενήλικους σκώληκες C. elegans. Η κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιείται για την παρασκευή ομογενοποιημάτων σκωλήκων και στη συνέχεια για την εκχύλιση των λιπιδίων από το δείγμα.
Πρωτόκολλο εκχύλισης λιπιδίων από C. elegans με υπερήχους
Αποψύξτε το ίζημα C. elegans σε πάγο και επαναιωρήστε το με 0,5 ml ultrawater. 
Υποβάλετε τα δείγματα C. elegans σε κατεργασία με υπερήχους σε δοκιμαστικούς σωλήνες 1,5mL, διατηρώντας τα συνεχώς σε πάγο.
Η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να πραγματοποιηθεί με συσκευή υπερήχων τύπου ακίδας, όπως το UP200Ht, τη μονάδα προετοιμασίας δειγμάτων με υπερήχους VialTweeter (ταυτόχρονη κατεργασία 10 δειγμάτων με υπερήχους) ή το UIP400MTP (για την κατεργασία πλακών πολλαπλών βοθρίων, όπως πλακών 96 βοθρίων, με υπερήχους).
Για λύση με υπερήχους με το UP200Ht, χρησιμοποιήστε τη μικροακίδα S26d2. Προρυθμίστε τη λειτουργία κύκλων υπερήχων στο ψηφιακό μενού. Ρυθμίστε το πλάτος στο 10% και τη λειτουργία κύκλων κατεργασίας με υπερήχους σε 20 κύκλους παλμών των 2 sec με παύση 30 sec. μεταξύ των διαδοχικών παλμών υπερήχων.
Μεταφέρετε τα υπερκείμενα σε γυάλινους σωλήνες με βιδωτό πώμα. 
Εκτελέστε εκχύλιση Folch προσθέτοντας 1 ml ultrawater σε κάθε γυάλινο σωλήνα και στη συνέχεια 6 ml μείγματος χλωροφορμίου/μεθανόλης (αναλογία = 2:1) σε κάθε γυάλινο σωλήνα.
Αναδεύστε κάθε γυάλινο σωλήνα σε αναδευτήρα vortex για 30 sec, 4 φορές. 
Φυγοκεντρήστε τους σωλήνες στα 1.258 x g για 15 min (Eppendorf, 5810 R), για να ενισχύσετε περαιτέρω τον διαχωρισμό των φάσεων. 
Μεταφέρετε το κατώτερο υδρόφοβο κλάσμα σε καθαρό γυάλινο σωλήνα με γυάλινη πιπέτα Pasteur. 
Ξηράνετε το κατώτερο υδρόφοβο κλάσμα υπό ροή αζώτου σε εξατμιστή αζώτου. 
Φυλάξτε το ξηραμένο ίζημα σε καταψύκτη στους -80 °C μέχρι τη χρήση. 


Παρασκευή λυμάτων σκωλήκων με υπερήχους

Λύμα σκωλήκων: Συλλέχθηκαν σκώληκες σταδίου L4 και πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl και 0,87 mM MgSO₄) για την απομάκρυνση όλων των βακτηρίων. Μετά την απομάκρυνση όσο το δυνατόν μεγαλύτερης ποσότητας ρυθμιστικού διαλύματος M9, οι σκώληκες επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-γλυκεροφωσφορικού, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM φθοριούχου νατρίου, 1 mM ορθοβαναδικού νατρίου, 5 mM πυροφωσφορικού νατρίου, 0,2 mM φθοριούχου φαινυλομεθανοσουλφονυλίου και αναστολέα πρωτεασών. Οι σκώληκες καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποψύχθηκαν στους 37°C τρεις φορές και, στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους πάνω σε ξηρό πάγο με μια μονάδα υπερήχων VialTweeter για την ταυτόχρονη παρασκευή 10 σωληναρίων δειγμάτων. Η κατεργασία με υπερήχους πραγματοποιήθηκε σε πλάτος 50%, σε 10 κύκλους των 2 sec., με παύση 30 sec μεταξύ των ριπών υπερήχων. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 rpm στους 4°C για 15 min. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -70°C. Μια υποποσότητα χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών με τη δοκιμασία Bradford.
Προσδιορισμός ολικής γλουταθειόνης, GSH και GSSG: Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γλουταθειόνης, η παρασκευή των λυμάτων και ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκαν την ίδια ημέρα. Οι προνύμφες L4 που είχαν τραφεί με γλυκόζη και οι προνύμφες ελέγχου συλλέχθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα M9. Μετά την απομάκρυνση όσο το δυνατόν μεγαλύτερης ποσότητας ρυθμιστικού διαλύματος M9, οι σκώληκες επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο μεταφωσφορικό οξύ (5% w/v) και, στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε κατεργασία με υπερήχους μέσα σε πάγο με μια συσκευή υπερήχων VialTweeter σε πλάτος 50%, σε δέκα κύκλους κατεργασίας με υπερήχους των 2 sec., με παύση 30 sec. μεταξύ κάθε κύκλου. Στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 rpm στους 4 ̊C για 15 min.
(πρβλ. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Παρασκευή δειγμάτων C. elegans πριν από την ανοσοκατακρήμνιση και την ανοσοαποτύπωση Western

Συνοπτικά, για την παρασκευή εμβρυϊκών εκχυλισμάτων, προνύμφες C. elegans L1 αναπτύχθηκαν σε υγρές καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας σε μέσο S έως την ενηλικίωση. Τα έμβρυα συλλέχθηκαν με την τυπική μέθοδο χλωρίνης και εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% γλυκερόλη, 0,05% NP-40, 1􏰅 κοκτέιλ αναστολέων πρωτεασών και 1􏰅 κοκτέιλ αναστολέων φωσφατασών I και II), καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο και λύθηκαν μέσω κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους, με χρήση συσκευής υπερήχων με μικροακίδα, όπως η UP200Ht με S26d2 για 10 παλμούς σε διάστημα 10 s σε πλάτος 30%. Εάν πρέπει να παρασκευαστεί μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων, συνιστώνται η συσκευή υπερήχων VialTweeter ή η συσκευή υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων UIP400MTP για πλάκες βοθρίων. Μετά την κατεργασία με υπερήχους, τα εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε προκαταρκτική διαύγαση με φυγοκέντρηση στα 30.000g για 20 min στους 4°C. Το προκαταρκτικά διαυγασμένο εκχύλισμα (300µg ολικής πρωτεΐνης) επωάστηκε με 40µ􏰂g αντισώματος anti-CDC-25.1 καθαρισμένου με χρωματογραφία συγγένειας (η παρούσα μελέτη), το οποίο ήταν διασταυρωμένα συνδεδεμένο με αγαρόζη–πρωτεΐνη A, ή, ως μάρτυρας, χρησιμοποιήθηκε παρόμοια ποσότητα ανοσοσφαιρίνης (Ig)G κουνελιού διασταυρωμένα συνδεδεμένης με αγαρόζη–πρωτεΐνη A, σε συνολικό όγκο 200µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιείχε 1% NP-40, η προσθήκη του οποίου μείωνε τη μη ειδική δέσμευση πρωτεϊνών στη μήτρα. Τα δείγματα περιστράφηκαν για 1 h στους 4°C, τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και πραγματοποιήθηκε έκλουση με 30µl γλυκίνης/HCl και 200 mM NaCl, pH 2,2. Μετά την ανοσοκατακρήμνιση, τα εκλούσματα αραιώθηκαν σε 30µ􏰂l ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων SDS, θερμάνθηκαν στους 95°C για 4 min και, συνήθως, 3% της συνολικής ποσότητας ως αρχικό δείγμα και 30% των εκλουσμάτων εφαρμόστηκαν σε SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση Western με αντισώματα anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ή anti-􏰁β-actin (1:2000). Όταν τα εκχυλίσματα δεν υποβάλλονταν σε ανοσοκατακρήμνιση, η ίδια ποσότητα ολικής πρωτεΐνης από αυτά τα εκχυλίσματα επαναιωρούνταν σε ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων SDS, θερμαινόταν στους 95°C και στη συνέχεια εφαρμοζόταν απευθείας σε SDS-PAGE και αναλυόταν με ανοσοαποτύπωση Western. (πρβλ. Segref et al. 2020)

Λύση με υπερήχους υπό ακριβή έλεγχο θερμοκρασίας

Ο ακριβής και αξιόπιστος έλεγχος της θερμοκρασίας είναι καθοριστικός κατά τον χειρισμό βιολογικών δειγμάτων. Οι υψηλές θερμοκρασίες προκαλούν θερμική αποδόμηση των πρωτεϊνών στα δείγματα.
Όπως όλες οι μηχανικές τεχνικές προετοιμασίας δειγμάτων, η κατεργασία με υπερήχους παράγει θερμότητα. Ωστόσο, η θερμοκρασία των δειγμάτων μπορεί να ελέγχεται αποτελεσματικά κατά τη χρήση του VialTweeter. Σας παρουσιάζουμε διάφορες επιλογές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο της θερμοκρασίας των δειγμάτων σας κατά την προετοιμασία τους με το VialTweeter και το VialPress για ανάλυση.

1. Παρακολούθηση της θερμοκρασίας του δείγματος: Ο επεξεργαστής υπερήχων UP200St, ο οποίος ενεργοποιεί το VialTweeter, διαθέτει έξυπνο λογισμικό και συνδεόμενο αισθητήρα θερμοκρασίας. Συνδέστε τον αισθητήρα θερμοκρασίας στο UP200St και εισαγάγετε το άκρο του αισθητήρα θερμοκρασίας σε έναν από τους σωλήνες δειγμάτων. Μέσω της ψηφιακής έγχρωμης οθόνης αφής, μπορείτε να ορίσετε στο μενού του UP200St ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας για την κατεργασία του δείγματός σας με υπερήχους. Η συσκευή υπερήχων θα σταματήσει αυτόματα όταν επιτευχθεί η μέγιστη θερμοκρασία και θα παραμείνει σε παύση μέχρι η θερμοκρασία του δείγματος να μειωθεί στην κατώτερη τιμή του καθορισμένου θερμοκρασιακού ∆. Στη συνέχεια, η κατεργασία με υπερήχους ξεκινά ξανά αυτόματα. Αυτή η έξυπνη λειτουργία αποτρέπει την αποδόμηση που προκαλείται από τη θερμότητα.
2. Το σώμα του VialTweeter μπορεί να προψυχθεί. Τοποθετήστε το σώμα του VialTweeter (μόνο το ηχοτρόδιο χωρίς τον μετατροπέα!) στο ψυγείο ή στον καταψύκτη για να προψύξετε το σώμα τιτανίου, γεγονός που βοηθά στην καθυστέρηση της αύξησης της θερμοκρασίας στο δείγμα. Εάν είναι δυνατόν, μπορεί επίσης να προψυχθεί το ίδιο το δείγμα.
3. Χρησιμοποιήστε ξηρό πάγο για ψύξη κατά την κατεργασία με υπερήχους. Χρησιμοποιήστε έναν ρηχό δίσκο γεμάτο με ξηρό πάγο και τοποθετήστε το VialTweeter επάνω στον ξηρό πάγο, ώστε η θερμότητα να μπορεί να απάγεται γρήγορα.

Βρείτε τη βέλτιστη συσκευή κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για την εφαρμογή λύσης σας

Η Hielscher Ultrasonics είναι κατασκευαστής με πολυετή εμπειρία στην κατασκευή συσκευών κυτταρικής διάρρηξης και ομογενοποιητών υπερήχων υψηλών επιδόσεων για εργαστήρια, επιτραπέζια συστήματα και συστήματα βιομηχανικής κλίμακας. Το μέγεθος της βακτηριακής κυτταροκαλλιέργειάς σας, ο ερευνητικός ή παραγωγικός σας στόχος και ο όγκος των κυττάρων προς επεξεργασία ανά ώρα ή ημέρα είναι καθοριστικοί παράγοντες για την επιλογή της κατάλληλης συσκευής κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για την εφαρμογή σας.
Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις για την ταυτόχρονη κατεργασία πολλαπλών δειγμάτων με υπερήχους (έως και 10 φιαλίδια), καθώς και για τη μαζική κατεργασία δειγμάτων (δηλαδή, πλάκες μικροτιτλοδότησης / πλάκες 96 βοθρίων), από την κλασική εργαστηριακή συσκευή υπερήχων με ακίδα σε διάφορα επίπεδα ισχύος από 50 έως 400 watts έως πλήρως βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων με έως και 16.000watts ανά μονάδα για εμπορική κυτταρική διάρρηξη και εκχύλιση πρωτεϊνών σε παραγωγή μεγάλης κλίμακας. Όλες οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι κατασκευασμένες για λειτουργία 24/7/365 υπό πλήρες φορτίο. Η ανθεκτικότητα και η αξιοπιστία αποτελούν βασικά χαρακτηριστικά των συσκευών υπερήχων μας.
Όλοι οι ψηφιακοί ομογενοποιητές υπερήχων διαθέτουν έξυπνο λογισμικό, έγχρωμη οθόνη αφής και αυτόματη καταγραφή δεδομένων, που καθιστούν τη συσκευή υπερήχων ένα εύχρηστο εργαλείο εργασίας στα εργαστήρια και στις εγκαταστάσεις παραγωγής.
Ενημερώστε μας για το είδος των κυττάρων, τον όγκο, τη συχνότητα επεξεργασίας και τον στόχο με τον οποίο πρέπει να επεξεργάζεστε τα βιολογικά σας δείγματα. Θα σας προτείνουμε την καταλληλότερη συσκευή κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για τις απαιτήσεις της διεργασίας σας.

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συστημάτων υπερήχων μας, από συμπαγείς ομογενοποιητές χειρός και συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων έως βιομηχανικούς επεξεργαστές υπερήχων για εμπορικές εφαρμογές: