Υπερηχητική λύση βιομηχανιωμένων κυττάρων στη βιομηχανική παραγωγή

Βιομηχανωμένα είδη βακτηρίων όπως το E. coli καθώς και γενετικά τροποποιημένοι τύποι θηλαστικών και φυτικών κυττάρων χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιοτεχνολογία για την έκφραση μορίων. Προκειμένου να απελευθερωθεί αυτά τα συνθετικά βιο-μόρια, απαιτείται μια αξιόπιστη τεχνική κυτταρικής διαταραχής. Υπερήχους υψηλής απόδοσης είναι μια αποδεδειγμένη μέθοδος για αποτελεσματική και αξιόπιστη λύση κυττάρων – εύκολα επεκτάσιμη σε μεγάλες μεταβές. Hielscher Ultrasonics σας προσφέρει υψηλής απόδοσης υπερηχητικό εξοπλισμό για αποτελεσματική κυτταρική λύση, προκειμένου να παράγουν μεγάλους όγκους υψηλής ποιότητας βιο-μορίων.

Εξαγωγή μορίων από εργοστάσια κυττάρων

Για την παραγωγή ενός ευρέος φάσματος βιομορίων, διάφορα κατασκευασμένα μικρόβια και φυτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργοστάσια μικροβίων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Στρεπτομύκης, Κορυνεβακτηρίδιο γλουταμινικό, Lactococcus lacti, Κυανοβακτήρια, Σακχαρομύκης cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Νικοτιάνα μπενθαμιάνα και φύκια, μεταξύ πολλών άλλων. Αυτά τα εργοστάσια κυττάρων μπορούν να παράγουν πρωτεΐνες, λιπίδια, βιοχημικά, πολυμερή, βιοκαύσιμα και ελαιοχημικά, τα οποία χρησιμοποιούνται ως τρόφιμα ή πρώτες ύλες για βιομηχανικές εφαρμογές. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται ως εργοστάσια κυττάρων καλλιεργούνται σε κλειστούς βιοδραστήρια, όπου μπορούν να επιτύχουν υψηλή απόδοση, εξειδίκευση και χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις.
Για να απομονωθούν τα μόρια-στόχοι από τις βιομηχανοποιούμενες καλλιέργειες κυττάρων, τα κύτταρα πρέπει να διαταραχθούν έτσι ώστε να απελευθερωθεί το ενδοκυτταρικό υλικό. Υπερήχων διαταράκτες κυττάρων είναι καλά καθιερωμένη ως εξαιρετικά αξιόπιστη και αποτελεσματική τεχνική για την αποσύνθεση των κυττάρων και την σύνθετη απελευθέρωση.

Τα εργοστάσια μικροβιακής κυττάρων είναι μεταβολικά κατασκευασμένα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση διαφόρων πολύτιμων ενώσεων. Υπερήχων διαταραχή των κυττάρων είναι μια αποτελεσματική και αξιόπιστη μέθοδος για την απελευθέρωση των πολύτιμων ενώσεων από το εσωτερικό των κυττάρων.
μελέτη και γραφικό: ©Villaverde, 2010.

Πλεονεκτήματα των υπερηχητικών διαταράκτες κυττάρων

Ως μη θερμική, ήπια, αλλά εξαιρετικά αποτελεσματική τεχνολογία, οι υπερηχητικοί διαταράκτες χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο και τη βιομηχανία για τη βελτίωση των κυττάρων και την παραγωγή υψηλής ποιότητας εκχυλισμάτων, π.χ. που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση μορίων από κυτταρικά εργοστάσια.

Υπερηχογράφημα ισχύος για αποτελεσματική διακοπή των εργοστασίων μικροβιακής κυττάρων

Μηχανισμός και επιδράσεις των υπερηχητικών κυτταρικών διαταράκτες:
Υπερήχων διαταραχή κυττάρων χρησιμοποίησε τη δύναμη των κυμάτων υπερήχων. Ο υπερηχητικός ομογενοποιητής / κυτταρικός διασπαστής είναι εξοπλισμένος με καθετήρα (aka sonotrode) κατασκευασμένο από κράμα τιτανίου που ταλαντεύεται σε υψηλή συχνότητα περίπου 20 kHz. Αυτό σημαίνει ότι ο υπερηχητικός καθετήρας ζευγαρώνει 20.000 δονήσεις ανά δευτερόλεπτο στο υπερήχων υγρό. Τα κύματα υπερήχων που συνδέονται με το υγρό χαρακτηρίζονται από εναλλασσόμενους κύκλους υψηλής πίεσης / χαμηλής πίεσης. Κατά τη διάρκεια ενός κύκλου χαμηλής πίεσης, το υγρό διαστέλλεται και προκύπτουν μικρές φυσαλίδες κενού. Αυτές οι πολύ μικρές φυσαλίδες αναπτύσσονται σε διάφορους εναλλασσόμενους κύκλους πίεσης μέχρι να μην μπορούν να απορροφήσουν περαιτέρω ενέργεια. Σε αυτό το σημείο, οι φυσαλίδες σπηλαίωσης εκρήγνυνται βίαια και δημιουργούν τοπικά ένα εξαιρετικό περιβάλλον γεμάτο ενέργεια. Αυτό το φαινόμενο είναι γνωστό ως ακουστική σπηλαίωση και χαρακτηρίζεται από τοπικά πολύ υψηλές θερμοκρασίες, πολύ υψηλές πιέσεις και δυνάμεις κουράς. Αυτές οι καταπονήσεις διάτμησης σπάνε αποτελεσματικά τα κυτταρικά τοιχώματα και αυξάνουν τη μεταφορά μάζας μεταξύ του εσωτερικού του κυττάρου και του γύρω διαλύτη. Ως καθαρά μηχανική τεχνική, χρησιμοποιούνται ευρέως οι υπερηχητικά παραγόμενες δυνάμεις διάτμησης και η συνιστώμενη διαδικασία για βακτηριακή κυτταρική διαταραχή, καθώς και για απομόνωση πρωτεϊνών. Ως απλή και ταχεία μέθοδος κυτταρικής διαταραχής, η κατεργασία με υπερήχους είναι ιδανική για την απομόνωση μικρών, μεσαίων και μεγάλων όγκων. Οι ψηφιακοί υπερήχοι hielscher είναι εξοπλισμένοι με ένα σαφές μενού ρυθμίσεων για ακριβή έλεγχο κατεργασίας με υπερήχους. Όλα τα δεδομένα κατεργασίας με υπερήχους αποθηκεύονται αυτόματα σε ενσωματωμένη κάρτα SD και είναι απλά προσβάσιμα. Εξελιγμένες επιλογές διάχυσης θερμότητας όπως εξωτερική ψύξη, κατεργασία με υπερήχους σε λειτουργία παλμών κ.λπ.

Η έρευνα υπογραμμίζει τα πλεονεκτήματα της διαταραχής και της εκχύλισης των υπερηχητικών κυττάρων

Ο καθηγητής Chemat et al. (2017) συνεχίζει στη μελέτη του ότι "η εκχύλιση με υπερήχους είναι μια πράσινη και οικονομικά βιώσιμη εναλλακτική λύση στις συμβατικές τεχνικές για τα τρόφιμα και τα φυσικά προϊόντα. Τα κύρια οφέλη είναι η μείωση του χρόνου εκχύλισης και επεξεργασίας, η ποσότητα ενέργειας και διαλυτών που χρησιμοποιούνται, οι εργασίες μονάδας και το CO₂ εκπομπές."
Gabig-Ciminska et al. (2014) χρησιμοποίησε ομογενοποιητή υψηλής πίεσης και ένα υπερηχητικό κύτταρο dsintegrator στη μελέτη τους για τη λύση των σπόρων προκειμένου να απελευθερώσει DNA. Συγκρίνοντας και τις δύο μεθόδους κυτταρικής διαταραχής, η ερευνητική ομάδα καταλήγει στο συμπέρασμα ότι όσον αφορά τη λύση των κυττάρων για το DNA των σπορών, "η ανάλυση έχει γίνει με τη χρήση κυτταρικών λυσικών από την ομογενοποίηση υψηλής πίεσης. Στη συνέχεια, συνειδητοποιήσαμε ότι μια διαταραχή των υπερηχητικών κυττάρων έχει εξαιρετικά πλεονεκτήματα για το σκοπό αυτό. Είναι μάλλον γρήγορο και μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία για μικρούς όγκους δειγμάτων." (Γκαμπίγκ-Τσιμίνσκα κ.ά., 2014)

Βιομόρια από εργοστάσια κυττάρων για την παραγωγή τροφίμων

Τα εργοστάσια μικροβιακής κυττάρων είναι μια βιώσιμη και αποτελεσματική μεθοδολογία παραγωγής που χρησιμοποιεί μικροοργανισμούς για την παραγωγή υψηλών αποδόσεων γηγενών και μη ιθαγενών μεταβολιτών με μεταβολική βιομηχανολογία μικροβιακής μικροοργανισμών όπως βακτήρια, ζυμομύκητες, μύκητες κλπ. Τα χύμα ένζυμα παράγονται για παράδειγμα χρησιμοποιώντας μικροοργανισμούς auch όπως Aspergillus oryzae, μύκητες και βακτήρια. Αυτά τα χύμα ένζυμα χρησιμοποιούνται για την παραγωγή τροφίμων και ποτών, καθώς και για τη γεωργία, τη βιοενέργεια και την οικιακή φροντίδα.
Ορισμένα βακτήρια όπως το Acetobacter xylinum και το Gluconacetobacter xylinus παράγουν κυτταρίνη κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ζύμωσης, όπου οι νανοΐνες συντίθενται σε μια διαδικασία από κάτω προς τα πάνω. Η βακτηριακή κυτταρίνη (επίσης γνωστή ως μικροβιακή κυτταρίνη) είναι χημικά ισοδύναμη με τη φυτική κυτταρίνη, αλλά έχει υψηλό βαθμό κρυσταλλικότητας και υψηλής καθαρότητας (χωρίς λιγνίνη, ημικυτταρίνη, πηκτίνη και άλλα βιογενή συστατικά) καθώς και μια μοναδική δομή τρισδιάστατου (3D) δικτυωτικού δικτύου που υφαίνει νανοϊνό της κυτταρίνης. (πρβλ. Ζονγκ, 2020) Σε σύγκριση με την φυτική κυτταρίνη, η βακτηριακή κυτταρίνη είναι πιο βιώσιμη και η παραγόμενη κυτταρίνη δεν απαιτεί πολύπλοκα βήματα καθαρισμού. Υπερήχους και εκχύλιση με διαλύτη χρησιμοποιώντας NaOH ή SDS (θειικό νάτριο dodecyl) είναι πολύ αποτελεσματική για την απομόνωση της βακτηριακής κυτταρίνης από τα βακτηριακά κύτταρα.

Βιομόρια από εργοστάσια κυττάρων για φαρμακευτική και παραγωγή εμβολίων

Ένα από τα πιο σημαντικά φαρμακευτικά προϊόντα που προέρχονται από εργοστάσια κυττάρων είναι η ανθρώπινη ινσουλίνη. Για την παραγωγή βιομηχανωμένης ινσουλίνης, χρησιμοποιούνται κυρίως E. coli και Saccharomyces cerevisiae. Δεδομένου ότι τα βιοσυστατικά νανο-μεγέθους μόρια προσφέρουν υψηλή βιοσυμβατότητα, βιολογικά νανοσωματίδια όπως η φερριτίνη είναι επωφελή για πολυάριθμες εφαρμογές βιομηχανοποιώντας. Επιπλέον, η παραγωγή σε μεταβολικά κατασκευασμένα μικρόβια είναι συχνά σημαντικά πιο αποτελεσματική στις λαμβανθείτες αποδόσεις. Για παράδειγμα, η παραγωγή αρτεμισινικού οξέος, ρεσβερατρόλης και λυκοπενίου έχει δεκαπλασιαστεί σε αρκετές εκατοντάδες φορές και έχει ήδη καθιερωθεί ή βρίσκεται σε εξέλιξη στην παραγωγή βιομηχανικής κλίμακας. (πρβλ. Liu et al.· Μικροβλ. Κυτταρικό γεγονός. 2017)
Για παράδειγμα, τα βιομόρια μεγέθους νανο-μεγέθους με βάση τις πρωτεΐνες με αυτοσυναρμολογημένες ιδιότητες όπως η φερριτίνη και τα σωματίδια που μοιάζουν με ιούς είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντα για την ανάπτυξη εμβολίων, καθώς μιμούνται τόσο το μέγεθος όσο και τη δομή των παθογόνων παραγόντων και είναι δελεαστά στην επιφανειακή σύζευξη αντιγόνων για την προώθηση της αλληλεπίδρασης με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Τέτοια μόρια εκφράζονται στα λεγόμενα εργοστάσια κυττάρων (π.χ. κατασκευασμένα στελέχη E. coli), τα οποία παράγουν ένα συγκεκριμένο μόριο-στόχο.

Πρωτόκολλο για υπερήχων λύση και του E. coli BL21 για την απελευθέρωση φερριτίνης

Η φερριτίνη είναι μια πρωτεΐνη, η οποία κύρια λειτουργία είναι η αποθήκευση σιδήρου. Η φερριτίνη παρουσιάζει ελπιδοφόρες δυνατότητες ως αυτοσυναρμολογούμενα νανοσωματίδια στα εμβόλια, όπου χρησιμοποιείται ως όχημα παράδοσης εμβολίων (π.χ. πρωτεΐνες ακίδας SARS-Cov-2). Η επιστημονική έρευνα του Ήλιου κ.ά. Al. (2016) δείχνει ότι η ανασυνδυασμένη φερριτίνη μπορεί να απελευθερωθεί ως διαλυτή μορφή από το Escherichia coli σε χαμηλές συγκεντρώσεις NaCl (≤50 mmol/L). Προκειμένου να εκφραστεί η φερριτίνη στο E. coli BL21 και να απελευθερωθεί η φερρίνη, εφαρμόστηκε με επιτυχία το ακόλουθο πρωτόκολλο. Το ανασυνδυασμένο pET-28a/σιδηριτίνη πλασμίδα μετατράπηκε σε στέλεχος E coli BL21 (DE3). Τα κύτταρα ferritin E coli BL21 (DE3) καλλιεργήθηκαν σε μέσα ανάπτυξης LB με 0, 5% κανναμυκίνη στους 37°C και προήλθαν από OD600 από 0, 6 με 0, 4% ισοπροπυλική- β-D-θειογαλακτοπυρανοσίδη για 3 ώρες στους 37°C. Η τελική καλλιέργεια στη συνέχεια συγκομίστηκε με φυγοδικεία στα 8000g για 10 λεπτά στους 4 °C και το σφαιρίδιο συλλέχθηκε. Στη συνέχεια, το σφαιρίδιο επαναιώθησε σε μέσο LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% εκχύλισμα ζύμης)/ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) και διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλύματος NaCl (0, 50, 100, 170 και 300 mmol/L), αντίστοιχα. Για τη λύση των βακτηριακών κυττάρων, η κατεργασία με υπερήχους εφαρμόστηκε σε λειτουργία παλμού: π.χ., υπερηχοχοιρωτής UP400St σε πλάτος 100% με κύκλο λειτουργίας 5 δευτερόλεπτα ON, 10 δευτερόλεπτα OFF, για 40 κύκλους) και στη συνέχεια φυγοκεντρημένο στα 10 000g για 15 λεπτά στους 4°C. Το υπερκείμενο και το ίζημα αναλύθηκαν από ηλεκτροφόρηση τζελ πολυακρυλαμιδίου του νατρίου dodecyl (SDS-PAGE). Όλα τα τζελ με θειικό νάτριο θειικού νατρίου σαρώθηκαν με σαρωτή υψηλής ανάλυσης. Οι εικόνες gel αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Magic Chemi 1D. Για βέλτιστη διαύγεια, οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύθηκαν προσαρμόζοντας τις παραμέτρους. Τα δεδομένα για τις μπάντες δημιουργήθηκαν από τεχνικά τρικ. (πρβλ. Κυρ., 2016)

Υπερηχητικοί διαταράκτες κυττάρων για τη βιομηχανική λύση των εργοστασίων κυττάρων

Υπερήχων λύση και εκχύλιση είναι μια αξιόπιστη και άνετη μέθοδος για την απελευθέρωση μεταβολιτών από τα εργοστάσια κυττάρων βοηθώντας έτσι μια αποτελεσματική παραγωγή μορίων-στόχων. Υπερήχων κυτταρικοί διαταράκτες είναι διαθέσιμοι από εργαστήριο σε βιομηχανικό μέγεθος και οι διαδικασίες μπορούν να κλιμακωθούν εντελώς γραμμικά.
Hielscher Ultrasonics είναι ο ικανός συνεργάτης σας για υψηλής απόδοσης υπερήχων διαταράκτες και έχει μακρά εμπειρία στον τομέα της εμφύτευσης υπερήχων συστήματα σε πάγκο-κορυφή και βιομηχανικές ρυθμίσεις.
Όταν πρόκειται για εξελιγμένο υλικό και λογισμικό, Hielscher Ultrasonics συστήματα κυτταρικής διαταραχής πληροί όλες τις απαιτήσεις για βέλτιστο έλεγχο της διαδικασίας, εύκολη λειτουργία και φιλικότητα προς το χρήστη. Οι πελάτες και ο χρήστης των υπερήχων Hielscher εκτιμούν το όφελος ότι hielscher υπερήχων διαταράκτες κυττάρων και εξορύκτες επιτρέπουν την ακριβή παρακολούθηση και τον έλεγχο της διαδικασίας – μέσω ψηφιακής οθόνης αφής και τηλεχειριστηρίου προγράμματος περιήγησης. Όλα τα σημαντικά δεδομένα κατεργασίας με υπερήχους (π.χ. καθαρή ενέργεια, συνολική ενέργεια, πλάτος, διάρκεια, θερμοκρασία, πίεση) αποθηκεύονται αυτόματα ως αρχείο CSV σε ενσωματωμένη κάρτα SD. Αυτό βοηθά στην επίτευξη αναπαραγώγιμων και επαναλαμβανόμενων αποτελεσμάτων και διευκολύνει την τυποποίηση των διεργασιών, καθώς και την εκπλήρωση ορθών πρακτικών παρασκευής (cGMP).
Φυσικά, Hielscher υπερήχων επεξεργαστές έχουν κατασκευαστεί για 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα λειτουργία υπό πλήρες φορτίο και μπορεί επομένως να λειτουργήσει αξιόπιστα σε βιομηχανικές ρυθμίσεις παραγωγής. Λόγω της υψηλής στιβαρότητας και της χαμηλής συντήρησης, ο χρόνος διακοπής λειτουργίας του εξοπλισμού υπερήχων είναι πραγματικά χαμηλός. Τα χαρακτηριστικά CIP (clean-in-place) και SIP (αποστείρωση στη θέση τους) ελαχιστοποιούν τον επίπονο καθαρισμό, ειδικά επειδή όλα τα υγρά μέρη είναι λείες μεταλλικές επιφάνειες (χωρίς κρυμμένα στόμια ή ακροφύσια).

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη για την κατά προσέγγιση ικανότητα επεξεργασίας των υπερήχων μας: