Λύση βιοτεχνολογικά τροποποιημένων κυττάρων με υπερήχους στη βιομηχανική παραγωγή

Βιοτεχνολογικά τροποποιημένα είδη βακτηρίων όπως το E. coli, καθώς και γενετικά τροποποιημένοι τύποι κυττάρων θηλαστικών και φυτών, χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιοτεχνολογία για την έκφραση μορίων. Για την απελευθέρωση αυτών των συντιθέμενων βιομορίων απαιτείται μια αξιόπιστη τεχνική κυτταρικής διάρρηξης. Η κατεργασία με υπερήχους υψηλής απόδοσης αποτελεί αποδεδειγμένη μέθοδο για αποτελεσματική και αξιόπιστη κυτταρική λύση – με εύκολη κλιμάκωση σε μεγάλες δυναμικότητες επεξεργασίας. Η Hielscher Ultrasonics σάς προσφέρει εξοπλισμό υπερήχων υψηλής απόδοσης για αποτελεσματική κυτταρική λύση, με σκοπό την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων βιομορίων υψηλής ποιότητας.

Εκχύλιση μορίων από κυτταρικά εργοστάσια

Για την παραγωγή ενός ευρέος φάσματος βιομορίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα τροποποιημένα μικρόβια και φυτικά κύτταρα ως μικροβιακά κυτταρικά εργοστάσια, συμπεριλαμβανομένων των Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, κυανοβακτηρίων, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana και φυκών, μεταξύ πολλών άλλων. Αυτά τα κυτταρικά εργοστάσια μπορούν να παράγουν πρωτεΐνες, λιπίδια, βιοχημικές ουσίες, πολυμερή, βιοκαύσιμα και ελαιοχημικά, τα οποία χρησιμοποιούνται ως τρόφιμα ή ως πρώτη ύλη για βιομηχανικές εφαρμογές. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται ως κυτταρικά εργοστάσια καλλιεργούνται σε κλειστούς βιοαντιδραστήρες, όπου μπορούν να επιτύχουν υψηλή απόδοση, εξειδίκευση και χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις.
Για την απομόνωση των μορίων-στόχων από τις καλλιέργειες βιοτεχνολογικά τροποποιημένων κυττάρων, τα κύτταρα πρέπει να υποστούν διάρρηξη ώστε να απελευθερωθεί το ενδοκυτταρικό υλικό. Η χρήση διασπαστών κυττάρων με υπερήχους αποτελεί καθιερωμένη τεχνική υψηλής αξιοπιστίας και αποτελεσματικότητας για την αποδόμηση κυττάρων και την απελευθέρωση ενώσεων.

Τα μικροβιακά κυτταρικά εργοστάσια είναι κύτταρα τροποποιημένα μέσω μεταβολικής μηχανικής, τα οποία χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση διαφόρων πολύτιμων ενώσεων. Η κυτταρική διάρρηξη με υπερήχους αποτελεί αποτελεσματική και αξιόπιστη μέθοδο για την απελευθέρωση των πολύτιμων ενώσεων από το εσωτερικό των κυττάρων.
μελέτη και γραφικό: ©Villaverde, 2010.

Πλεονεκτήματα των διασπαστών κυττάρων με υπερήχους

Ως μη θερμική, ήπια, αλλά ιδιαίτερα αποτελεσματική τεχνολογία, οι διασπαστές υπερήχων χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο και στη βιομηχανία για τη λύση κυττάρων και την παραγωγή εκχυλισμάτων υψηλής ποιότητας, π.χ. για την απομόνωση μορίων από κυτταρικά εργοστάσια.

Υπέρηχοι ισχύος για αποτελεσματική διάρρηξη μικροβιακών κυτταρικών εργοστασίων

Μηχανισμός και επιδράσεις των διασπαστών κυττάρων με υπερήχους:
Η κυτταρική διάρρηξη με υπερήχους αξιοποιεί την ισχύ των υπερηχητικών κυμάτων. Ο ομογενοποιητής υπερήχων / διαρρήκτης κυττάρων είναι εξοπλισμένος με έναν καθετήρα (γνωστό και ως ηχοτρόδιο) από κράμα τιτανίου, ο οποίος ταλαντώνεται σε υψηλή συχνότητα περίπου 20 kHz. Αυτό σημαίνει ότι ο καθετήρας υπερήχων μεταφέρει 20.000 ταλαντώσεις ανά δευτερόλεπτο στο υγρό που υποβάλλεται σε κατεργασία με υπερήχους. Τα υπερηχητικά κύματα που μεταφέρονται στο υγρό χαρακτηρίζονται από εναλλασσόμενους κύκλους υψηλής πίεσης / χαμηλής πίεσης. Κατά τη διάρκεια ενός κύκλου χαμηλής πίεσης, το υγρό διαστέλλεται και δημιουργούνται μικροσκοπικές φυσαλίδες κενού. Αυτές οι πολύ μικρές φυσαλίδες μεγαλώνουν κατά τη διάρκεια αρκετών εναλλασσόμενων κύκλων πίεσης, μέχρι να μην μπορούν να απορροφήσουν άλλη ενέργεια. Σε αυτό το σημείο, οι φυσαλίδες σπηλαίωσης καταρρέουν βίαια και δημιουργούν τοπικά ένα περιβάλλον εξαιρετικά υψηλής ενεργειακής πυκνότητας. Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό ως ακουστική σπηλαίωση και χαρακτηρίζεται από τοπικά πολύ υψηλές θερμοκρασίες, πολύ υψηλές πιέσεις και δυνάμεις διάτμησης. Αυτές οι διατμητικές τάσεις διασπούν αποτελεσματικά τα κυτταρικά τοιχώματα και αυξάνουν τη μεταφορά μάζας μεταξύ του εσωτερικού του κυττάρου και του περιβάλλοντος διαλύτη. Ως αμιγώς μηχανική τεχνική, η εφαρμογή δυνάμεων διάτμησης που παράγονται με υπερήχους χρησιμοποιείται ευρέως και αποτελεί τη συνιστώμενη διαδικασία για τη διάρρηξη βακτηριακών κυττάρων, καθώς και για την απομόνωση πρωτεϊνών. Ως απλή και ταχεία μέθοδος κυτταρικής διάρρηξης, η κατεργασία με υπερήχους είναι ιδανική για απομόνωση από μικρούς, μεσαίους και μεγάλους όγκους. Οι ψηφιακές συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι εξοπλισμένες με ένα σαφές μενού ρυθμίσεων για τον ακριβή έλεγχο της κατεργασίας με υπερήχους. Όλα τα δεδομένα της κατεργασίας με υπερήχους αποθηκεύονται αυτόματα σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD και είναι εύκολα προσβάσιμα. Οι προηγμένες επιλογές απαγωγής θερμότητας, όπως η εξωτερική ψύξη, η κατεργασία με υπερήχους σε παλμική λειτουργία κ.λπ., κατά τη διαδικασία αποδιάρθρωσης με υπερήχους διασφαλίζουν τη διατήρηση της ιδανικής θερμοκρασίας της διεργασίας και, συνεπώς, την ακεραιότητα των εκχυλιζόμενων θερμοευαίσθητων ενώσεων.

Η έρευνα αναδεικνύει τα πλεονεκτήματα της κυτταρικής διάρρηξης και της εκχύλισης με υπερήχους

Ο καθηγητής Chemat και οι συνεργάτες του (2017) συνοψίζουν στη μελέτη τους ότι «η εκχύλιση με υποβοήθηση υπερήχων αποτελεί μια πράσινη και οικονομικά βιώσιμη εναλλακτική λύση έναντι των συμβατικών τεχνικών για τρόφιμα και φυσικά προϊόντα. Τα κύρια οφέλη είναι η μείωση του χρόνου εκχύλισης και επεξεργασίας, της ποσότητας ενέργειας και διαλυτών που χρησιμοποιούνται, των επιμέρους διεργασιών και των εκπομπών CO₂ .»
Οι Gabig-Ciminska και συνεργάτες (2014) χρησιμοποίησαν στη μελέτη τους έναν ομογενοποιητή υψηλής πίεσης και έναν αποδιαρθρωτή κυττάρων με υπερήχους για τη λύση σπορίων με σκοπό την απελευθέρωση DNA. Συγκρίνοντας τις δύο μεθόδους κυτταρικής διάρρηξης, η ερευνητική ομάδα καταλήγει στο συμπέρασμα ότι, όσον αφορά την κυτταρική λύση για το DNA των σπορίων, «η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυτταρικών λυμάτων από την ομογενοποίηση υψηλής πίεσης. Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι η κυτταρική διάρρηξη με υπερήχους έχει εξαιρετικά πλεονεκτήματα για τον σκοπό αυτό. Είναι αρκετά γρήγορη και μπορεί να εφαρμοστεί σε μικρούς όγκους δειγμάτων.» (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Βιομόρια από κυτταρικά εργοστάσια για την παραγωγή τροφίμων

Τα μικροβιακά κυτταρικά εργοστάσια αποτελούν μια βιώσιμη και αποδοτική μεθοδολογία παραγωγής που χρησιμοποιεί μικροβιακούς οργανισμούς για την παραγωγή υψηλών αποδόσεων ενδογενών και μη ενδογενών μεταβολιτών μέσω μεταβολικής βιομηχανικής μικροοργανισμών, όπως βακτήρια, ζύμες, μύκητες κ.λπ. Για παράδειγμα, ένζυμα μαζικής παραγωγής παράγονται με τη χρήση μικροοργανισμών όπως ο Aspergillus oryzae, μύκητες και βακτήρια. Αυτά τα ένζυμα μαζικής παραγωγής χρησιμοποιούνται στην παραγωγή τροφίμων και ποτών, καθώς και στη γεωργία, στη βιοενέργεια και στη φροντίδα του νοικοκυριού.
Ορισμένα βακτήρια, όπως τα Acetobacter xylinum και Gluconacetobacter xylinus, παράγουν κυτταρίνη κατά τη διαδικασία της ζύμωσης, κατά την οποία συντίθενται νανοΐνες μέσω μιας διαδικασίας από κάτω προς τα πάνω. Η βακτηριακή κυτταρίνη (γνωστή και ως μικροβιακή κυτταρίνη) είναι χημικά ισοδύναμη με τη φυτική κυτταρίνη, αλλά διαθέτει υψηλό βαθμό κρυσταλλικότητας και υψηλή καθαρότητα (απαλλαγμένη από λιγνίνη, ημικυτταρίνη, πηκτίνη και άλλα βιογενή συστατικά), καθώς και μια μοναδική δομή τρισδιάστατου (3D) δικτυωτού πλέγματος από συνυφασμένες νανοΐνες κυτταρίνης. (cf. Zhong, 2020) Σε σύγκριση με την κυτταρίνη φυτικής προέλευσης, η βακτηριακή κυτταρίνη είναι πιο βιώσιμη και η παραγόμενη κυτταρίνη είναι καθαρή, χωρίς να απαιτεί πολύπλοκα στάδια καθαρισμού. Η κατεργασία με υπερήχους και η εκχύλιση με διαλύτη με χρήση NaOH ή SDS (δωδεκυλοθειικό νάτριο) είναι πολύ αποτελεσματικές για την απομόνωση της βακτηριακής κυτταρίνης από τα βακτηριακά κύτταρα.

Βιομόρια από κυτταρικά εργοστάσια για την παραγωγή φαρμάκων και εμβολίων

Ένα από τα σημαντικότερα φαρμακευτικά προϊόντα που προέρχονται από κυτταρικά εργοστάσια είναι η ανθρώπινη ινσουλίνη. Για την παραγωγή ινσουλίνης μέσω βιομηχανικής χρησιμοποιούνται κυρίως τα E. coli και Saccharomyces cerevisiae. Καθώς τα βιοσυντιθέμενα μόρια νανομετρικού μεγέθους προσφέρουν υψηλή βιοσυμβατότητα, τα βιολογικά νανοσωματίδια, όπως η φερριτίνη, παρουσιάζουν πλεονεκτήματα για πολυάριθμες εφαρμογές βιοπαραγωγής. Επιπλέον, η παραγωγή σε μικρόβια που έχουν τροποποιηθεί με μεταβολική μηχανική είναι συχνά σημαντικά αποτελεσματικότερη ως προς τις επιτυγχανόμενες αποδόσεις. Για παράδειγμα, η παραγωγή αρτεμισινικού οξέος, ρεσβερατρόλης και λυκοπενίου έχει αυξηθεί από δέκα έως αρκετές εκατοντάδες φορές και έχει ήδη καθιερωθεί ή βρίσκεται υπό ανάπτυξη για παραγωγή σε βιομηχανική κλίμακα. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Για παράδειγμα, τα βιομόρια νανομετρικού μεγέθους με βάση πρωτεΐνες και ιδιότητες αυτοσυναρμολόγησης, όπως η φερριτίνη και τα ιόμορφα σωματίδια, παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη εμβολίων, καθώς μιμούνται τόσο το μέγεθος όσο και τη δομή των παθογόνων και επιτρέπουν την επιφανειακή σύζευξη αντιγόνων για την προώθηση της αλληλεπίδρασης με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Τέτοια μόρια εκφράζονται σε λεγόμενα κυτταρικά εργοστάσια (π.χ. τροποποιημένα στελέχη E. coli), τα οποία παράγουν ένα συγκεκριμένο μόριο-στόχο.

Πρωτόκολλο λύσης του E. coli BL21 με υπερήχους για την απελευθέρωση φερριτίνης

Η φερριτίνη είναι μια πρωτεΐνη της οποίας η κύρια λειτουργία είναι η αποθήκευση σιδήρου. Η φερριτίνη παρουσιάζει υποσχόμενες δυνατότητες ως αυτοσυναρμολογούμενα νανοσωματίδια σε εμβόλια, όπου χρησιμοποιείται ως φορέας χορήγησης εμβολίων (π.χ. πρωτεϊνών ακίδας του SARS-Cov-2). Η επιστημονική έρευνα των Sun et. al. (2016) δείχνει ότι η ανασυνδυασμένη φερριτίνη μπορεί να απελευθερωθεί σε διαλυτή μορφή από το Escherichia coli σε χαμηλές συγκεντρώσεις NaCl (≤50 mmol/L). Για την έκφραση της φερριτίνης στο E. coli BL21 και την απελευθέρωσή της, εφαρμόστηκε επιτυχώς το ακόλουθο πρωτόκολλο. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pET-28a/ferritin εισήχθη με μετασχηματισμό στο στέλεχος E coli BL21 (DE3). Τα κύτταρα E coli BL21 (DE3) που παράγουν φερριτίνη καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά μέσα LB με 0,5% καναμυκίνη στους 37°C και η έκφραση επάχθηκε σε OD600 0,6 με 0,4% ισοπροπυλο-β-D-θειογαλακτοπυρανοσίδη για 3 ώρες στους 37°C. Στη συνέχεια, η τελική καλλιέργεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 8000g για 10 λεπτά στους 4°C και συλλέχθηκε το ίζημα. Κατόπιν, το ίζημα επαναιωρήθηκε σε μέσο LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% εκχύλισμα ζύμης)/ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλύματος NaCl (0, 50, 100, 170 και 300 mmol/L), αντίστοιχα. Για τη λύση των βακτηριακών κυττάρων εφαρμόστηκε κατεργασία με υπερήχους σε παλμική λειτουργία: π.χ., με χρήση της συσκευής υπερήχων UP400St σε πλάτος 100% με κύκλο λειτουργίας 5 δευτερολέπτων ενεργοποίησης, 10 δευτερολέπτων απενεργοποίησης, για 40 κύκλους) και στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 10 000g για 15 λεπτά στους 4°C. Το υπερκείμενο και το ίζημα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE). Όλα τα πηκτώματα που είχαν χρωματιστεί με δωδεκυλοθειικό νάτριο σαρώθηκαν με σαρωτή υψηλής ανάλυσης. Οι εικόνες των πηκτωμάτων αναλύθηκαν με το λογισμικό Magic Chemi 1D. Για βέλτιστη ευκρίνεια, οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με προσαρμογή των παραμέτρων. Τα δεδομένα για τις ζώνες προέκυψαν από τρεις τεχνικές επαναλήψεις. (πρβλ. Sun et al., 2016)

Συσκευές κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους για βιομηχανική λύση κυτταρικών εργοστασίων

Η λύση και η εκχύλιση με υπερήχους αποτελούν μια αξιόπιστη και εύχρηστη μέθοδο για την απελευθέρωση μεταβολιτών από κυτταρικά εργοστάσια, συμβάλλοντας έτσι στην αποτελεσματική παραγωγή μορίων-στόχων. Οι συσκευές κυτταρικής διάρρηξης με υπερήχους διατίθενται σε μεγέθη από εργαστηριακά έως βιομηχανικά και οι διεργασίες μπορούν να κλιμακωθούν απολύτως γραμμικά.
Η Hielscher Ultrasonics είναι ο εξειδικευμένος συνεργάτης σας για συσκευές διάρρηξης με υπερήχους υψηλής απόδοσης και διαθέτει πολυετή εμπειρία στην εγκατάσταση συστημάτων υπερήχων σε επιτραπέζιες και βιομηχανικές εφαρμογές.
Όσον αφορά το προηγμένο υλικό και λογισμικό, τα συστήματα κυτταρικής διάρρηξης της Hielscher Ultrasonics πληρούν όλες τις απαιτήσεις για βέλτιστο έλεγχο της διεργασίας, εύκολη λειτουργία και φιλικότητα προς τον χρήστη. Οι πελάτες και οι χρήστες των συσκευών υπερήχων της Hielscher εκτιμούν το πλεονέκτημα ότι οι συσκευές κυτταρικής διάρρηξης και εκχύλισης με υπερήχους της Hielscher επιτρέπουν την ακριβή παρακολούθηση και τον έλεγχο της διεργασίας – μέσω ψηφιακής οθόνης αφής και τηλεχειρισμού από πρόγραμμα περιήγησης. Όλα τα σημαντικά δεδομένα της κατεργασίας με υπερήχους (π.χ. καθαρή ενέργεια, συνολική ενέργεια, πλάτος, διάρκεια, θερμοκρασία, πίεση) αποθηκεύονται αυτόματα ως αρχείο CSV σε ενσωματωμένη κάρτα SD. Αυτό συμβάλλει στην επίτευξη αναπαραγώγιμων και επαναλήψιμων αποτελεσμάτων και διευκολύνει την τυποποίηση της διεργασίας, καθώς και την τήρηση των Ορθών Παρασκευαστικών Πρακτικών (cGMP).
Φυσικά, οι επεξεργαστές υπερήχων της Hielscher έχουν κατασκευαστεί για λειτουργία 24/7 υπό πλήρες φορτίο και, επομένως, μπορούν να λειτουργούν αξιόπιστα σε περιβάλλοντα βιομηχανικής παραγωγής. Χάρη στην υψηλή ανθεκτικότητα και τις χαμηλές απαιτήσεις συντήρησης, ο χρόνος διακοπής λειτουργίας του εξοπλισμού υπερήχων είναι πραγματικά μικρός. Οι δυνατότητες CIP (επιτόπιος καθαρισμός) και SIP (επιτόπια αποστείρωση) ελαχιστοποιούν τον επίπονο καθαρισμό, ιδίως επειδή όλα τα μέρη που έρχονται σε επαφή με το υγρό έχουν λείες μεταλλικές επιφάνειες (χωρίς κρυφά ανοίγματα ή ακροφύσια).

Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συσκευών υπερήχων μας: