Υπερήχων λύση των βιοϊατρικών κυττάρων στη βιομηχανική παραγωγή

Τα βιομηχανικά είδη βακτηρίων όπως το E. coli, καθώς και οι γενετικά τροποποιημένοι τύποι θηλαστικών και φυτικών κυττάρων χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιοτεχνολογία για να εκφράσουν μόρια. Προκειμένου να απελευθερωθούν αυτά τα συνθετικά βιομόρια, απαιτείται μια αξιόπιστη τεχνική κυτταρικής διαταραχής. Υπερήχους υψηλής απόδοσης είναι μια αποδεδειγμένη μέθοδος για αποτελεσματική και αξιόπιστη λύση κυττάρων – Εύκολα επεκτάσιμη σε μεγάλες αποδόσεις. Hielscher Υπέρηχοι σας προσφέρει υψηλής απόδοσης υπερήχων εξοπλισμό για αποτελεσματική λύση κυττάρων, προκειμένου να παράγει μεγάλους όγκους υψηλής ποιότητας βιο-μορίων.

Εξαγωγή μορίων από κυτταρικά εργοστάσια

Για την παραγωγή ενός ευρέος φάσματος βιομορίων, διάφορα τροποποιημένα μικρόβια και φυτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργοστάσια μικροβιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana και φύκια, μεταξύ πολλών άλλων. Αυτά τα εργοστάσια κυττάρων μπορούν να παράγουν πρωτεΐνες, λιπίδια, βιοχημικά, πολυμερή, βιοκαύσιμα και ελαιοχημικά, τα οποία χρησιμοποιούνται ως τρόφιμα ή πρώτες ύλες για βιομηχανικές εφαρμογές. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται ως κυτταρικά εργοστάσια καλλιεργούνται σε κλειστούς βιοαντιδραστήρες, όπου μπορούν να επιτύχουν υψηλή απόδοση, ειδικότητα και χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις.
Για να απομονωθούν τα μόρια-στόχοι από τις βιομηχανικές κυτταροκαλλιέργειες, τα κύτταρα πρέπει να διαταραχθούν έτσι ώστε να απελευθερωθεί το ενδοκυτταρικό υλικό. Οι υπερηχητικοί διαταράκτες κυττάρων είναι καθιερωμένοι ως εξαιρετικά αξιόπιστη και αποτελεσματική τεχνική για την αποσύνθεση των κυττάρων και την απελευθέρωση της ένωσης.

Τα εργοστάσια μικροβιακών κυττάρων είναι μεταβολικά τροποποιημένα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση διαφόρων πολύτιμων ενώσεων. Υπερήχων διαταραχή κυττάρων είναι μια αποτελεσματική και αξιόπιστη μέθοδος για την απελευθέρωση των πολύτιμων ενώσεων από το εσωτερικό του κυττάρου.
μελέτη και γραφικό: ©Villaverde, 2010.

Πλεονεκτήματα των υπερηχητικών κυτταρικών διαταρακτών

Ως μη θερμική, ήπια, αλλά εξαιρετικά αποτελεσματική τεχνολογία, οι υπερηχητικοί διαταράκτες χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο και τη βιομηχανία για τη λύση κυττάρων και την παραγωγή εκχυλισμάτων υψηλής ποιότητας, π.χ. χρησιμοποιούνται για την απομόνωση μορίων από κυτταρικά εργοστάσια.

Ισχύς-υπερηχογράφημα για αποτελεσματική διάσπαση εργοστασίων μικροβιακών κυττάρων

Μηχανισμός και επιδράσεις των διαταρακτών κυττάρων υπερήχων:
Η διαταραχή των υπερηχητικών κυττάρων χρησιμοποίησε τη δύναμη των κυμάτων υπερήχων. Ο υπερηχητικός ομογενοποιητής / διαταράκτης κυττάρων είναι εξοπλισμένος με έναν καθετήρα (γνωστός και ως sonotrode) κατασκευασμένος από κράμα τιτανίου που ταλαντώνεται σε υψηλή συχνότητα περίπου 20 kHz. Αυτό σημαίνει ότι ο υπερηχητικός καθετήρας συνδέει 20.000 δονήσεις ανά δευτερόλεπτο στο υγρό με υπερήχους. Τα κύματα υπερήχων που συνδέονται με το υγρό χαρακτηρίζονται από εναλλασσόμενους κύκλους υψηλής πίεσης / χαμηλής πίεσης. Κατά τη διάρκεια ενός κύκλου χαμηλής πίεσης, το υγρό διαστέλλεται και προκύπτουν μικρές φυσαλίδες κενού. Αυτές οι πολύ μικρές φυσαλίδες αναπτύσσονται σε αρκετούς εναλλασσόμενους κύκλους πίεσης μέχρι να μην μπορούν να απορροφήσουν περαιτέρω ενέργεια. Σε αυτό το σημείο, οι φυσαλίδες σπηλαίωσης εκρήγνυνται βίαια και δημιουργούν τοπικά ένα εξαιρετικό ενεργειακά πυκνό περιβάλλον. Αυτό το φαινόμενο είναι γνωστό ως ακουστική σπηλαίωση και χαρακτηρίζεται από τοπικά πολύ υψηλές θερμοκρασίες, πολύ υψηλές πιέσεις και δυνάμεις διάτμησης. Αυτές οι διατμητικές τάσεις διασπούν αποτελεσματικά τα κυτταρικά τοιχώματα και αυξάνουν τη μεταφορά μάζας μεταξύ του εσωτερικού του κυττάρου και του περιβάλλοντος διαλύτη. Ως καθαρά μηχανική τεχνική, χρησιμοποιούνται ευρέως υπερηχητικά παραγόμενες δυνάμεις διάτμησης και η συνιστώμενη διαδικασία για τη διαταραχή των βακτηριακών κυττάρων, καθώς και για την απομόνωση πρωτεϊνών. Ως απλή και ταχεία μέθοδος διαταραχής κυττάρων, κατεργασία με υπερήχους είναι ιδανική για την απομόνωση μικρών, μεσαίων και μεγάλων όγκων. Οι ψηφιακοί υπερήχων της Hielscher είναι εξοπλισμένοι με ένα σαφές μενού ρυθμίσεων για ακριβή έλεγχο υπερήχων. Όλα τα δεδομένα υπερήχων αποθηκεύονται αυτόματα σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD και είναι απλά προσβάσιμα. Εξελιγμένες επιλογές απαγωγής θερμότητας, όπως εξωτερική ψύξη, υπερήχηση σε λειτουργία παλμών κ.λπ., κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αποσύνθεσης υπερήχων εξασφαλίζουν τη διατήρηση της ιδανικής θερμοκρασίας διεργασίας και, ως εκ τούτου, την ακεραιότητα των εκχυλισμένων θερμοευαίσθητων ενώσεων.

Η έρευνα υπογραμμίζει τα πλεονεκτήματα της υπερηχητικής κυτταρικής διαταραχής και εκχύλισης

Ο καθηγητής Chemat et al. (2017) συνεχίζει στη μελέτη τους ότι «η εκχύλιση με υπερήχους είναι μια πράσινη και οικονομικά βιώσιμη εναλλακτική λύση στις συμβατικές τεχνικές για τρόφιμα και φυσικά προϊόντα. Τα κύρια οφέλη είναι η μείωση του χρόνου εκχύλισης και επεξεργασίας, η ποσότητα ενέργειας και διαλυτών που χρησιμοποιούνται, οι λειτουργίες μονάδων και το CO₂ εκπομπές».
Οι Gabig-Ciminska et al. (2014) χρησιμοποίησαν έναν ομογενοποιητή υψηλής πίεσης και έναν υπερηχητικό dsintegrator κυττάρων στη μελέτη τους για τη λύση των σπορίων προκειμένου να απελευθερώσουν DNA. Συγκρίνοντας και τις δύο μεθόδους κυτταρικής διαταραχής, η ερευνητική ομάδα καταλήγει στο συμπέρασμα ότι όσον αφορά την κυτταρική λύση για DNA σπορίων, «η ανάλυση έχει γίνει με τη χρήση κυτταρικών λυμάτων από την ομογενοποίηση υψηλής πίεσης. Στη συνέχεια, συνειδητοποιήσαμε ότι μια διαταραχή κυττάρων υπερήχων έχει εξαιρετικά πλεονεκτήματα για το σκοπό αυτό. Είναι αρκετά γρήγορο και μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία για μικρούς όγκους δειγμάτων». (Gabig-Ciminska κ.ά., 2014)

Βιομόρια από Κυτταρικά Εργοστάσια Παραγωγής Τροφίμων

Τα εργοστάσια μικροβιακών κυττάρων είναι μια βιώσιμη και αποτελεσματική μεθοδολογία παραγωγής που χρησιμοποιεί μικροβιακούς οργανισμούς για την παραγωγή υψηλών αποδόσεων αυτοφυών και μη μεταβολιτών μέσω μεταβολικής βιο-μηχανικής μικροβιακών μικροοργανισμών όπως βακτήρια, ζύμες, μύκητες κ.λπ. Τα χύδην ένζυμα παράγονται, για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας μικροοργανισμούς όπως Aspergillus oryzae, μύκητες και βακτήρια. Αυτά τα χύδην ένζυμα χρησιμοποιούνται για την παραγωγή τροφίμων και ποτών, καθώς και στη γεωργία, τη βιοενέργεια και την οικιακή φροντίδα.
Ορισμένα βακτήρια όπως το Acetobacter xylinum και το Gluconacetobacter xylinus παράγουν κυτταρίνη κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ζύμωσης, όπου οι νανοΐνες συντίθενται σε μια διαδικασία από κάτω προς τα πάνω. Η βακτηριακή κυτταρίνη (επίσης γνωστή ως μικροβιακή κυτταρίνη) είναι χημικά ισοδύναμη με τη φυτική κυτταρίνη, αλλά έχει υψηλό βαθμό κρυσταλλικότητας και υψηλής καθαρότητας (χωρίς λιγνίνη, ημικυτταρίνη, πηκτίνη και άλλα βιογενή συστατικά) καθώς και μια μοναδική δομή τρισδιάστατου (3D) δικτυωτού δικτύου που υφαίνεται από νανοΐνες κυτταρίνης. (πρβλ. Zhong, 2020) Σε σύγκριση με την κυτταρίνη φυτικής προέλευσης, η βακτηριακή κυτταρίνη είναι πιο βιώσιμη και η κυτταρίνη που παράγεται είναι καθαρή χωρίς να απαιτούνται πολύπλοκα βήματα καθαρισμού. Υπερήχους και εκχύλιση με διαλύτη χρησιμοποιώντας NaOH ή SDS (δωδεκυλοθειικό νάτριο) είναι πολύ αποτελεσματικά για την απομόνωση της βακτηριακής κυτταρίνης από τα βακτηριακά κύτταρα.

Βιομόρια από Κυτταρικά Εργοστάσια για Παραγωγή Φαρμάκων και Εμβολίων

Ένα από τα πιο σημαντικά φαρμακευτικά προϊόντα που προέρχονται από εργοστάσια κυττάρων είναι η ανθρώπινη ινσουλίνη. Για τη βιομηχανική παραγωγή ινσουλίνης, χρησιμοποιούνται κυρίως E. coli και Saccharomyces cerevisiae. Δεδομένου ότι τα βιοσυνθετικά μόρια νανομεγέθους προσφέρουν υψηλή βιοσυμβατότητα, τα βιολογικά νανοσωματίδια όπως η φερριτίνη είναι πλεονεκτικά για πολλές εφαρμογές βιοπαραγωγής. Επιπλέον, η παραγωγή μεταβολικά τροποποιημένων μικροβίων είναι συχνά σημαντικά πιο αποτελεσματική στις ληφθείσες αποδόσεις. Για παράδειγμα, η παραγωγή αρτεμισινικού οξέος, ρεσβερατρόλης και λυκοπενίου έχει δεκαπλασιαστεί έως αρκετές εκατοντάδες φορές και έχει ήδη καθιερωθεί ή βρίσκεται σε εξέλιξη σε παραγωγή βιομηχανικής κλίμακας. (πρβλ. Liu κ.ά.· Μικροβ. Κυτταρικό γεγονός. 2017)
Για παράδειγμα, τα νανο-μεγέθη βιομόρια με βάση πρωτεΐνες με αυτοσυναρμολογούμενες ιδιότητες, όπως η φερριτίνη και τα σωματίδια που μοιάζουν με ιούς, είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντα για την ανάπτυξη εμβολίων, καθώς μιμούνται τόσο το μέγεθος όσο και τη δομή των παθογόνων και είναι επιδεκτικά επιφανειακής σύζευξης αντιγόνων για την προώθηση της αλληλεπίδρασης με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Τέτοια μόρια εκφράζονται στα λεγόμενα κυτταρικά εργοστάσια (π.χ. τροποποιημένα στελέχη E. coli), τα οποία παράγουν ένα συγκεκριμένο μόριο-στόχο.

Πρωτόκολλο για λύση με υπερήχους και E. coli BL21 για απελευθέρωση φερριτίνης

Η φερριτίνη είναι μια πρωτεΐνη, η κύρια λειτουργία της οποίας είναι η αποθήκευση σιδήρου. Η φερριτίνη παρουσιάζει πολλά υποσχόμενες δυνατότητες ως αυτοσυναρμολογούμενα νανοσωματίδια σε εμβόλια, όπου χρησιμοποιείται ως όχημα παράδοσης εμβολίων (π.χ. πρωτεΐνες ακίδας SARS-Cov-2). Η επιστημονική έρευνα του Sun et. al. (2016) δείχνει ότι η ανασυνδυασμένη φερριτίνη μπορεί να απελευθερωθεί ως διαλυτή μορφή από Escherichia coli σε χαμηλές συγκεντρώσεις NaCl (≤50 mmol / L). Προκειμένου να εκφραστεί η φερριτίνη στο E. coli BL21 και να απελευθερωθεί η φερτίνη, εφαρμόστηκε με επιτυχία το ακόλουθο πρωτόκολλο. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pET-28a/φερριτίνης μετατράπηκε στο στέλεχος E coli BL21 (DE3). Τα κύτταρα φερριτίνης E coli BL21 (DE3) καλλιεργήθηκαν σε μέσα ανάπτυξης LB με 0,5% καναμυκίνη στους 37°C και επήχθησαν σε OD600 0,6 με 0,4% ισοπροπυλο-β-D-θειογαλακτοπυρανοζίτη για 3 ώρες στους 37°C. Η τελική καλλιέργεια στη συνέχεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 8000g για 10 λεπτά στους 4°C και συλλέχθηκε το σφαιρίδιο. Στη συνέχεια, το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε μέσο LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% εκχύλισμα ζύμης) / ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mmol / L Tris, 50 mmol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA, pH 7,6) και διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλύματος NaCl (0, 50, 100, 170 και 300 mmol / L), αντίστοιχα. Για τη λύση βακτηριακών κυττάρων, υπερήχηση εφαρμόστηκε σε λειτουργία παλμού: π.χ., χρησιμοποιώντας το Υπερήχων UP400St σε πλάτος 100% με κύκλο λειτουργίας 5 δευτερολέπτων ON, 10 δευτερολέπτων OFF, για 40 κύκλους) και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 10 000g επί 15 λεπτά στους 4°C. Το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλοθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Όλα τα πηκτώματα με δωδεκυλοθειικό νάτριο σαρώθηκαν με σαρωτή υψηλής ανάλυσης. Οι εικόνες γέλης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Magic Chemi 1D. Για βέλτιστη διαύγεια, ανιχνεύθηκαν πρωτεϊνικές ζώνες προσαρμόζοντας τις παραμέτρους. Τα δεδομένα για τις ζώνες δημιουργήθηκαν από τεχνικά τριπλάσια. (βλ. Sun et al., 2016)

Υπερηχητικοί κυτταρικοί διαταράκτες για βιομηχανική λύση των εργοστασίων κυττάρων

Υπερήχων λύση και εκχύλιση είναι μια αξιόπιστη και άνετη μέθοδος για την απελευθέρωση μεταβολιτών από τα εργοστάσια κυττάρων, βοηθώντας έτσι μια αποτελεσματική παραγωγή των μορίων στόχου. Οι υπερηχητικοί κυτταρικοί διαταράκτες είναι διαθέσιμοι από το εργαστήριο στο βιομηχανικό μέγεθος και οι διαδικασίες μπορούν να κλιμακωθούν εντελώς γραμμικές.
Hielscher Υπέρηχοι είναι ο ικανός συνεργάτης σας για υψηλής απόδοσης υπερήχων διαταράκτες και έχει μακροχρόνια εμπειρία στον τομέα της εμφύτευσης υπερήχων συστήματα σε πάγκο-top και βιομηχανικές ρυθμίσεις.
Όταν πρόκειται για εξελιγμένο υλικό και λογισμικό, Hielscher Υπέρηχοι συστήματα διαταραχής κυττάρων πληροί όλες τις απαιτήσεις για βέλτιστο έλεγχο της διαδικασίας, εύκολη λειτουργία και φιλικότητα προς το χρήστη. Οι πελάτες και ο χρήστης των υπερήχων Hielscher εκτιμούν το όφελος που Hielscher υπερήχων διαταράκτες κυττάρων και εξολκέες επιτρέπουν την ακριβή παρακολούθηση και τον έλεγχο της διαδικασίας – μέσω ψηφιακής οθόνης αφής και τηλεχειριστηρίου προγράμματος περιήγησης. Όλα τα σημαντικά δεδομένα υπερήχων (π.χ. καθαρή ενέργεια, συνολική ενέργεια, πλάτος, διάρκεια, θερμοκρασία, πίεση) αποθηκεύονται αυτόματα ως αρχείο CSV σε μια ενσωματωμένη κάρτα SD. Αυτό βοηθά στην επίτευξη αναπαραγώγιμων και επαναλαμβανόμενων αποτελεσμάτων και διευκολύνει την τυποποίηση της διαδικασίας καθώς και την εκπλήρωση των ορθών παρασκευαστικών πρακτικών (cGMP).
Φυσικά, Hielscher υπερήχων επεξεργαστές είναι κατασκευασμένα για 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα λειτουργία υπό πλήρες φορτίο και μπορεί επομένως να λειτουργήσει αξιόπιστα σε ρυθμίσεις βιομηχανικής παραγωγής. Λόγω της υψηλής ευρωστίας και της χαμηλής συντήρησης, ο χρόνος διακοπής λειτουργίας του εξοπλισμού υπερήχων είναι πραγματικά χαμηλός. Τα χαρακτηριστικά CIP (clean-in-place) και SIP (sterilize-in-place) ελαχιστοποιούν τον επίπονο καθαρισμό, ειδικά επειδή όλα τα υγρά μέρη είναι λείες μεταλλικές επιφάνειες (χωρίς κρυφά στόμια ή ακροφύσια).

Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων μας: