Πλασμιδιακό παρασκεύασμα χρησιμοποιώντας υπερήχους

Υπερήχους είναι μια αξιόπιστη τεχνική για τον κατακερματισμό του πλασμιδιακού DNA. Το ακριβώς ελεγχόμενο πλάτος, ο τρόπος παλμών και ο έλεγχος της θερμοκρασίας είναι τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά ενός υπερηχητικού για μη καταστροφικό κατακερματισμό πλασμιδίων. Επιπλέον, η χρήση ορισμένων παραγόντων βοηθά στην προστασία από την αποικοδόμηση των πλασμιδίων. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις για ελεγχόμενο κατακερματισμό πλασμιδίων από μεμονωμένα φιαλίδια, ταυτόχρονα υπερήχηση πολλών δειγμάτων καθώς και πλάκες πολλαπλών φρεατίων. Μάθετε περισσότερα σχετικά με τον επιτυχή κατακερματισμό των υπερηχητικών πλασμιδίων!

Διάτμηση πλασμιδίων με υπερήχους

Όταν τα δείγματα DNA υποβάλλονται σε υπερηχητικά κύματα, οι υπερηχητικές δονήσεις δημιουργούν ακουστική σπηλαίωση στο υγρό που διατμεί ή σπάει μόρια DNA υψηλού μοριακού βάρους μέσω μηχανικών δυνάμεων. Κατεργασία με υπερήχους είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για πειράματα διάτμησης χύδην DNA, συμπεριλαμβανομένων εφαρμογών, όπως η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP), για την οποία τα μικρά μεγέθη θραυσμάτων είναι απολύτως ζωτικής σημασίας για την επίτευξη υψηλής ανάλυσης. (πρβλ. Τσενγκ κ.ά., 2012)
Το πλασμιδιακό DNA (pDNA) είναι ειδική μορφή DNA, που χαρακτηρίζεται από το σχήμα του δακτυλίου του και βρίσκεται σε βακτήρια και σε μερικούς ευκαρυώτες.
Το supercoiled pDNA είναι η επιθυμητή μορφή πλασμιδιακού DNA καθώς δείχνει τα καλύτερα αποτελέσματα σε διαδικασίες down-stream όπως η αυτοματοποιημένη αλληλούχιση και η μετάγγιση. Υπερήχους είναι κατάλληλο για τον κατακερματισμό του pDNA, συμπεριλαμβανομένου του υπερσυντηρημένου pDNA, με επιτυχία.
Οι Thompson et al. (2008) έδειξαν ότι η κατεργασία με υπερήχους πλασμιδίου, η οποία είναι γνωστό ότι κατακερματίζει το υπερσυντηρημένο DNA, είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για τη βελτίωση των μηκών ανάγνωσης της αλληλουχίας phred20 σε σημείο που δεν διαφέρουν σημαντικά από το πρότυπο ελέγχου του Beckman Coulter ή τα ενζυματικά γραμμικά πλασμίδια.

Χρήση πλασμιακών διανυσμάτων

Τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται συχνά ως εργαλεία για την κλωνοποίηση, τη μεταφορά και το χειρισμό γονιδίων. Όταν τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται πειραματικά για τους σκοπούς αυτούς, ονομάζονται διανύσματα. Θραύσματα DNA ή γονίδια μπορούν να εισαχθούν σε ένα πλασμιδιακό φορέα, δημιουργώντας ένα λεγόμενο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Οι πλασμιδικοί φορείς χρησιμοποιούνται ως οχήματα για την προώθηση του ανασυνδυασμένου DNA σε ένα κύτταρο ξενιστή και αποτελούν βασικό συστατικό της μοριακής κλωνοποίησης.
“Οι μη ιικοί φορείς μελετώνται εκτενώς για την πιθανή χρήση τους στη γονιδιακή θεραπεία για τη θεραπεία διαφόρων περίπλοκων ασθενειών. Οι μη ιικοί φορείς προστατεύουν το πλασμιδιακό DNA από φυσική, χημική και ενζυματική αποικοδόμηση και παραδίδουν το μόριο DNA στη θέση-στόχο. Για παράδειγμα, τα κατιονικά λιποσώματα, η χιτοζάνη και άλλα θετικά φορτισμένα νανοσωματίδια σχηματίζουν σύμπλοκα με πλασμιδιακό DNA μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Ωστόσο, τα εύκολα σχηματισμένα κατιονικά λιποσώματα/σύμπλοκα πλασμιδιακού DNA είναι σχετικά μεγάλα (δηλαδή, 300-400 nm) και ετερογενή στη φύση καθιστώντας τα δύσκολα στη χρήση σε φαρμακευτικές εφαρμογές. Το μεγάλο και ετερογενές πλασμιδιακό DNA / λιποσώματα, το πλασμιδιακό DNA / αερολύματα και τα σύμπλοκα πλασμιδίου DNA / πεπτιδίων μπορούν να μειωθούν σε μικρότερα και ομοιογενή σωματίδια χρησιμοποιώντας υπερήχους.” (Sarker et al., 2019)
Ένα εξέχον παράδειγμα για τη χρήση πλασμιδιακών διανυσμάτων είναι το CRISPR–Cas9. Το σύστημα CRISPR-Cas9 παραδίδεται συνήθως στα κύτταρα ως ένα μόνο μεγάλο πλασμίδιο ή πολλαπλά μικρότερα πλασμίδια που κωδικοποιούν μια αλληλουχία στόχου, έναν οδηγό CRISPR και ένα Cas9.

Υπερηχητική προετοιμασία νανοσωματιδίων PLGA φορτωμένων με DNA με νανοκατακρήμνιση

Οι Jo et al. (2020) χρησιμοποίησαν πολυ(γαλακτικό-συν-γλυκολικό οξύ) (PLGA) για να σχηματίσουν έναν φορέα νανοσωματιδίων για την παράδοση ενός μοντέλου πλασμιδίου CRISPR–Cas9 σε πρωτογενή μακροφάγα που προέρχονται από το μυελό των οστών. Για τη νανοκατακρήμνιση των νανοσωματιδίων PLGA, χρησιμοποιήθηκε PLGA με δύο διαφορετικές τελικές ομάδες (ομάδες εστέρα και αμίνης) με στόχο τα θετικά φορτισμένα τελικά καπάκια αμίνης να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα και τη φόρτωση της ενθυλάκωσης λόγω των αλληλεπιδράσεων φορτίου μεταξύ αυτού και της αρνητικά φορτισμένης ραχοκοκαλιάς του DNA. Σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης πολυπροπυλενίου 50 mL, 100 mg Pluronic F127 διαλύθηκαν σε 20 mL αυτόκλειστο DI νερό με ανάμιξη στροβίλου ακολουθούμενη από 30 λεπτά ήπιας υπερήχησης χρησιμοποιώντας ένα λουτρό υπερήχων (δείτε το CupHorn). Προστέθηκε μια αυτόκλειστη μαγνητική ράβδος ανάδευσης και το διάλυμα αναμειγνύεται στις 600 σ.α.λ. για 30 λεπτά ενώ τα άλλα διαλύματα έγιναν. Πλαστικά εργαστηριακά σκεύη χρησιμοποιήθηκαν αντί για γυάλινα σκεύη σε όλη τη διάρκεια για να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική προσρόφηση του DNA. Διαλύματα PLGA διαλυμένου σε DMF (44,48 mg/ml) και TIPS πεντακένιο διαλυμένο σε THF (0,667 mg/ml) έγιναν ξεχωριστά. Το PLGA αφέθηκε να βρέχεται σε DMF για 30 λεπτά πριν υποστεί κατεργασία με υπερήχους για 30 λεπτά (για το πλήρες πρωτόκολλο βλέπε Jo et al., 2020)

Προστασία πλασμιδιακού DNA κατά τη διάρκεια της υπερήχησης

Το DNA, συμπεριλαμβανομένων των πλασμιδίων και των υπερκείμενων πλασμιδίων, είναι εξαιρετικά ευαίσθητη αποικοδόμηση. Όλες οι διαθέσιμες μέθοδοι κατακερματισμού είναι γνωστές για ορισμένα μειονεκτήματα. Ο υπερηχητικός κατακερματισμός του DNA είναι μία από τις προτιμώμενες μεθόδους, καθώς η ελεγχόμενη υπερήχηση σε συνδυασμό με προστατευτικά μέτρα επιτρέπει τη μείωση της διάτμησης και της θερμότητας που προκαλείται από την καταστροφή των κλώνων του DNA.
Εκτός από τις ρυθμίσεις χαμηλού πλάτους, τον τρόπο παλμών και τον έλεγχο της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της διάτμησης του DNA με υπερήχους, η χρήση ορισμένων παραγόντων έδειξε σημαντική προστατευτική επίδραση έναντι της υποβάθμισης του DNA. Για παράδειγμα, διάφορα πολυμερή, πεπτίδια και λιπίδια προστατεύουν το πλασμιδιακό DNA κατά τη διάρκεια της υπερήχους.

Η σταθερότητα του πλασμιδιακού DNA και των νανοσυμπλεγμάτων πλασμιδίου DNA/IL κατά της υπερηχητικής διατμητικής καταπόνησης διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης. Τόσο το πλασμιδιακό DNA όσο και τα νανοσυμπλεγμένα πλασμιδίων DNA/IL υποβλήθηκαν σε υπερηχητική διατμητική τάση για διαφορετικά χρονικά σημεία. Το πλασμιδιακό DNA εκτέθηκε σε υπερηχητικό διατμητικό στρες για 0, 10, 20, 30 και 40 λεπτά. Ωστόσο, τα νανοσυμπλέγματα DNA/IL πλασμιδίων εκτέθηκαν σε υπερηχητική διατμητική τάση για 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 και 120 λεπτά.
(μελέτη και εικόνα: ©Sarker et al., 2019)

Οι Sarker et al. (2019) έδειξαν ότι όταν οι νανοδομές πλασμιδιακού DNA / ιοντικού υγρού (pDNA / IL) υποβλήθηκαν σε υπερηχητική διατμητική τάση για 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 και 120 λεπτά και συμπλοκοποιήθηκαν με τον εμπορικά διαθέσιμο κατιονικό παράγοντα παράδοσης γονιδίων λιποφεκταμίνη, το ποσοστό των θετικών φθοριζόντων κυττάρων ήταν 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, και 50%, αντίστοιχα (βλ. διάγραμμα παρακάτω). Το ποσοστό των θετικών φθοριζόντων κυττάρων αυξήθηκε όταν οι νανοδομές υποβλήθηκαν σε υπερηχητική διατμητική τάση για 10 και 20 λεπτά και στη συνέχεια μειώθηκε αργά.

Επίδραση του ιοντικού υγρού [Bmim][PF6] στην παροχή πλασμιδιακού DNA στα κύτταρα COS7. Τα νανοσυμπλεγμένα πλασμιδιακού DNA/IL (ιοντικό υγρό) υποβλήθηκαν σε υπερηχητική διατμητική καταπόνηση για έως και 120 λεπτά και συμπλοκοποιήθηκαν με LA πριν από την παράδοσή τους σε κύτταρα COS7. Τα δεδομένα δείχνουν τον μέσο αριθμό (%) των θετικών σε GFP κυττάρων HeLa που μετρήθηκαν σε 10 διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία και το πείραμα εκτελέστηκε πολλές φορές σε τρεις διαφορετικές ημέρες. (Μελέτη και διάγραμμα: ©Sarker et al., 2019)

Υπερηχητικό παρασκεύασμα λύσης

Πρωτόκολλο λύσης κυττάρων υπερήχων
Ξεκινήστε με ένα εμπλουτισμένο δείγμα κυττάρων που παρασκευάστηκε μέσω μιας μεθόδου διαχωρισμού κυττάρων (π.χ. διαχωρισμός ανοσομαγνητικών κυττάρων, ταξινόμηση κυττάρων που ενεργοποιείται με φθορισμό (FACS), φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας, απομόνωση κυττάρων ανοσοαισθητοποίησης).
Τα κυτταρικά δείγματα πρέπει να δείχνουν έναν όγκο ενός ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που είναι κατάλληλος για τον πειραματικό στόχο και τον υπερηχητικό τύπο καθετήρα.
Τα υποτονικά ρυθμιστικά προτιμώνται καθώς ενισχύουν τη λύση των υπερηχητικών κυττάρων. Είναι σημαντικό τα πρόσθετα και η συγκέντρωση αλάτων να χρησιμοποιούνται με τον κατάλληλο τρόπο.
Επιλέξτε τη συσκευή λύσης υπερήχων: Για έμμεση υπερήχηση φιαλιδίων, συνιστάται το VialTweeter ή το CupHorn. Για τις πολυδιατροφικές πλάκες, το UIP400MTP είναι ο ιδανικός υπερηχητικός παράγοντας. Και η κλασική υπερήχηση τύπου καθετήρα, ένας υπερηχητικός ομογενοποιητής ως UP100H ή UP200Ht με μικρο-άκρη είναι οι πιο κατάλληλοι.
Πρωτόκολλο για υπερήχηση τύπου καθετήρα: Τοποθετήστε τον καθετήρα υπερήχων στον όγκο του δείγματος σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης και κάντε υπερήχους για περίπου 10 δευτερόλεπτα. Ανάλογα με το δείγμα DNA, η υπερήχηση μπορεί να επαναληφθεί μία ή δύο φορές. Η απαιτούμενη εισροή ενέργειας υπερήχων (Ws / mL) εξαρτάται από το ιξώδες του δείγματος και τον τύπο DNA. Η ψύξη μέσω λουτρού πάγου και ο τρόπος παλμών του υπερηχητικού βοηθά στην πρόληψη της θερμικής υποβάθμισης του δείγματος.
Μετά από υπερηχητική λύση, το δείγμα φυγοκεντρείται για να διαχωρίσει τα συντρίμμια σφαιριδίων (που περιέχουν μη εκλυμένα κύτταρα, πυρήνες και μη λυμένα οργανίδια)
Εάν το δείγμα δεν υποβληθεί σε άμεση περαιτέρω επεξεργασία, μπορεί να αποθηκευτεί σε κατάλληλη θερμοκρασία για να διατηρηθεί η βιωσιμότητά του.

Υπερηχητικοί για κατακερματισμό DNA

Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες πλατφόρμες με υπερήχους για DNA, RNA, και χρωματίνη κατακερματισμό. Αυτές οι διαφορετικές πλατφόρμες περιλαμβάνουν υπερήχους ανιχνευτές (sonotrodes), έμμεσες λύσεις κατεργασίας με υπερήχους για την ταυτόχρονη προετοιμασία δειγμάτων πολλαπλών σωλήνων ή πολυ-καλά πλάκες (π.χ. πλάκες 96 φρεάτια, πλάκες μικροτιτθήσεων), sonoreactors, και υπερήχων cuphorns. Όλες οι πλατφόρμες για διάτμηση DNA τροφοδοτούνται από επεξεργαστές υπερήχων υψηλής απόδοσης με συχνότητα, οι οποίοι είναι με ακρίβεια ελεγχόμενοι και παρέχουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.

Υπερήχων επεξεργαστές για οποιοδήποτε αριθμό και μέγεθος δείγματος

Με τους υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων της Hielscher VialTweeter (για έως και 10 δοκιμαστικούς σωλήνες) και UIP400MTP (για μικροσελίδες / πλάκες πολλαπλών κιλών) καθίσταται εύκολα δυνατή η μείωση του χρόνου επεξεργασίας του δείγματος λόγω της έντονης και επακριβώς ελεγχόμενης υπερήχησης, επιτυγχάνοντας παράλληλα την επιθυμητή κατανομή και απόδοση μεγέθους θραύσματος DNA. Ο κατακερματισμός του DNA υπερήχων καθιστά τα βήματα προετοιμασίας πλασμιδίων αποτελεσματικά, αξιόπιστα και επεκτάσιμα. Τα πρωτόκολλα μπορούν να κλιμακωθούν γραμμικά από ένα σε πολλά δείγματα εφαρμόζοντας σταθερές παραμέτρους υπερήχων.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.