Παρασκευή πλασμιδίων με κατεργασία με υπερήχους

Η κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη τεχνική για τον κατακερματισμό του πλασμιδιακού DNA. Το επακριβώς ελεγχόμενο πλάτος ταλάντωσης, η παλμική λειτουργία και ο έλεγχος της θερμοκρασίας είναι τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά μιας συσκευής υπερήχων για τον κατακερματισμό πλασμιδίων χωρίς πρόκληση βλάβης. Επιπλέον, η χρήση ορισμένων παραγόντων συμβάλλει στην προστασία από την αποικοδόμηση των πλασμιδίων. Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες λύσεις για τον ελεγχόμενο κατακερματισμό πλασμιδίων, από την επεξεργασία μεμονωμένων φιαλιδίων έως την ταυτόχρονη κατεργασία πολυάριθμων δειγμάτων με υπερήχους, καθώς και πλακών πολλαπλών βοθρίων. Μάθετε περισσότερα για τον επιτυχή κατακερματισμό πλασμιδίων με υπερήχους!

Διάτμηση πλασμιδίων με κατεργασία με υπερήχους

Όταν τα δείγματα DNA υποβάλλονται σε υπερηχητικά κύματα, οι δονήσεις που παράγονται από τους υπερήχους δημιουργούν ακουστική σπηλαίωση στο υγρό, η οποία διατέμνει ή διασπά μόρια DNA υψηλού μοριακού βάρους μέσω μηχανικών δυνάμεων. Η κατεργασία με υπερήχους είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος για πειράματα διάτμησης DNA σε μαζική κλίμακα, συμπεριλαμβανομένων εφαρμογών όπως η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP), για τις οποίες τα μικρά μεγέθη θραυσμάτων είναι απολύτως κρίσιμα για την επίτευξη υψηλής διακριτικής ικανότητας. (βλ. Tseng et al., 2012)
Το πλασμιδιακό DNA (pDNA) είναι μια συγκεκριμένη μορφή DNA, που χαρακτηρίζεται από το δακτυλιοειδές σχήμα της και απαντάται στα βακτήρια και σε ορισμένους ευκαρυωτικούς οργανισμούς.
Το υπερελικωμένο pDNA είναι η επιθυμητή μορφή πλασμιδιακού DNA, καθώς παρουσιάζει τα καλύτερα αποτελέσματα σε επακόλουθες διεργασίες, όπως η αυτοματοποιημένη αλληλούχηση και η διαμόλυνση. Η κατεργασία με υπερήχους είναι κατάλληλη για τον επιτυχή κατακερματισμό του pDNA, συμπεριλαμβανομένου του υπερελικωμένου pDNA.
Οι Thompson et al. (2008) κατέδειξαν ότι η κατεργασία πλασμιδίων με υπερήχους, η οποία είναι γνωστό ότι κατακερματίζει το υπερελικωμένο DNA, αποτελεί αποτελεσματικό τρόπο αύξησης του μήκους των αναγνώσεων αλληλουχίας ποιότητας phred20, σε σημείο ώστε τα μήκη αυτά να μη διαφέρουν σημαντικά από εκείνα που λαμβάνονται με τη μήτρα ελέγχου της Beckman Coulter ή με ενζυμικά γραμμικοποιημένα πλασμίδια.

Χρήση πλασμιδιακών φορέων

Τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται συχνά ως εργαλεία για την κλωνοποίηση, τη μεταφορά και τον χειρισμό γονιδίων. Όταν τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται πειραματικά για αυτούς τους σκοπούς, ονομάζονται φορείς. Θραύσματα DNA ή γονίδια μπορούν να εισαχθούν σε έναν πλασμιδιακό φορέα, δημιουργώντας ένα λεγόμενο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Οι πλασμιδιακοί φορείς χρησιμοποιούνται ως οχήματα για την εισαγωγή ανασυνδυασμένου DNA σε ένα κύτταρο ξενιστή και αποτελούν βασικό συστατικό της μοριακής κλωνοποίησης.
“Οι μη ιικοί φορείς μελετώνται εκτενώς ως προς την πιθανή χρήση τους στη γονιδιακή θεραπεία για την αντιμετώπιση διαφόρων σύνθετων ασθενειών. Οι μη ιικοί φορείς προστατεύουν το πλασμιδιακό DNA από τη φυσική, χημική και ενζυμική αποικοδόμηση και μεταφέρουν το μόριο DNA στη θέση-στόχο. Για παράδειγμα, τα κατιονικά λιποσώματα, η χιτοζάνη και άλλα θετικά φορτισμένα νανοσωματίδια σχηματίζουν σύμπλοκα με το πλασμιδιακό DNA μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Ωστόσο, τα σύμπλοκα κατιονικών λιποσωμάτων/πλασμιδιακού DNA, τα οποία σχηματίζονται εύκολα, είναι σχετικά μεγάλα (δηλ. 300–400 nm) και ετερογενή ως προς τη φύση τους, γεγονός που δυσχεραίνει τη χρήση τους σε φαρμακευτικές εφαρμογές. Τα μεγάλα και ετερογενή σύμπλοκα πλασμιδιακού DNA/λιποσωμάτων, πλασμιδιακού DNA/αερολυμάτων και πλασμιδιακού DNA/πεπτιδίων μπορούν να μετατραπούν σε μικρότερα και ομοιογενή σωματίδια με κατεργασία με υπερήχους.” (Sarker et al., 2019)
Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα χρήσης πλασμιδιακών φορέων είναι το CRISPR–Cas9. Το σύστημα CRISPR–Cas9 συνήθως εισάγεται στα κύτταρα ως ένα μεγάλο πλασμίδιο ή ως πολλαπλά μικρότερα πλασμίδια που κωδικοποιούν μια αλληλουχία-στόχο, έναν οδηγό CRISPR και την Cas9.

Παρασκευή νανοσωματιδίων PLGA φορτωμένων με DNA μέσω νανοκατακρήμνισης με τη χρήση υπερήχων

Οι Jo et al. (2020) χρησιμοποίησαν πολυ(γαλακτικό-συν-γλυκολικό οξύ) (PLGA) για να σχηματίσουν έναν νανοσωματιδιακό φορέα για τη μεταφορά ενός πρότυπου πλασμιδίου CRISPR–Cas9 σε πρωτογενή μακροφάγα προερχόμενα από τον μυελό των οστών. Για τη νανοκατακρήμνιση των νανοσωματιδίων PLGA, χρησιμοποιήθηκε PLGA με δύο διαφορετικές τελικές ομάδες (εστερικές και αμινομάδες), με στόχο οι θετικά φορτισμένες τελικές αμινομάδες να αυξήσουν την απόδοση ενθυλάκωσης και τη φόρτωση μέσω των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ αυτών και του αρνητικά φορτισμένου σκελετού του DNA. Σε κωνικό σωλήνα φυγοκέντρησης από πολυπροπυλένιο των 50 mL, διαλύθηκαν 100 mg Pluronic F127 σε 20 mL απιονισμένου νερού αποστειρωμένου σε αυτόκαυστο, με ανάμειξη σε αναδευτήρα vortex και στη συνέχεια ήπια κατεργασία με υπερήχους για 30 min σε λουτρό υπερήχων (βλ. CupHorn). Προστέθηκε μια μαγνητική ράβδος ανάδευσης αποστειρωμένη σε αυτόκαυστο και το διάλυμα αναδεύτηκε στις 600 RPM για 30 min, ενώ παρασκευάζονταν τα υπόλοιπα διαλύματα. Σε όλα τα στάδια χρησιμοποιήθηκαν πλαστικά εργαστηριακά σκεύη αντί για γυάλινα, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική προσρόφηση του DNA. Παρασκευάστηκαν χωριστά διαλύματα PLGA διαλυμένου σε DMF (44,48 mg/ ml) και πεντακενίου TIPS διαλυμένου σε THF (0,667 mg/ml). Το PLGA αφέθηκε σε ηρεμία να διαβραχεί σε DMF για 30 min, προτού υποβληθεί σε κατεργασία με υπερήχους για 30 min. (για το πλήρες πρωτόκολλο βλ. Jo et al., 2020)

Προστασία πλασμιδιακού DNA κατά την κατεργασία με υπερήχους

Το DNA, συμπεριλαμβανομένων των πλασμιδίων και των υπερελικωμένων πλασμιδίων, είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στην αποικοδόμηση. Όλες οι διαθέσιμες μέθοδοι κατακερματισμού είναι γνωστό ότι παρουσιάζουν ορισμένα μειονεκτήματα. Ο κατακερματισμός DNA με υπερήχους είναι μία από τις προτιμώμενες μεθόδους, καθώς η ελεγχόμενη κατεργασία με υπερήχους σε συνδυασμό με προστατευτικά μέτρα επιτρέπει τη μείωση της βλάβης των αλυσίδων DNA που προκαλείται από τη διάτμηση και τη θερμότητα.
Εκτός από τις ρυθμίσεις χαμηλού πλάτους ταλάντωσης, την παλμική λειτουργία και τον έλεγχο της θερμοκρασίας κατά τη διάτμηση DNA με υπερήχους, η χρήση ορισμένων παραγόντων επέδειξε σημαντική προστατευτική δράση έναντι της αποικοδόμησης του DNA. Για παράδειγμα, διάφορα πολυμερή, πεπτίδια και λιπίδια προστατεύουν το πλασμιδιακό DNA κατά την κατεργασία με υπερήχους.

Η σταθερότητα του πλασμιδιακού DNA και των νανοσυμπλόκων πλασμιδιακού DNA/IL έναντι της διατμητικής τάσης που προκαλείται από υπερήχους διερευνήθηκε με δοκιμασία ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Τόσο το πλασμιδιακό DNA όσο και τα νανοσύμπλοκα πλασμιδιακού DNA/IL υποβλήθηκαν σε διατμητική τάση προκαλούμενη από υπερήχους για διαφορετικές χρονικές διάρκειες. Το πλασμιδιακό DNA εκτέθηκε σε διατμητική τάση προκαλούμενη από υπερήχους για 0, 10, 20, 30 και 40 λεπτά. Ωστόσο, τα νανοσύμπλοκα πλασμιδιακού DNA/IL εκτέθηκαν σε διατμητική τάση προκαλούμενη από υπερήχους για 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 και 120 λεπτά.
(μελέτη και εικόνα: ©Sarker et al., 2019)

Οι Sarker et al. (2019) έδειξαν ότι, όταν οι νανοδομές πλασμιδιακού DNA / ιοντικού υγρού (pDNA/IL) υποβλήθηκαν σε διατμητική τάση προκαλούμενη από υπερήχους για 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 και 120 min και σχημάτισαν σύμπλοκα με τον εμπορικά διαθέσιμο κατιονικό παράγοντα μεταφοράς γονιδίων lipofectamine, τα ποσοστά των θετικών στον φθορισμό κυττάρων ήταν 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% και 50%, αντίστοιχα (βλ. διάγραμμα παρακάτω). Το ποσοστό των θετικών στον φθορισμό κυττάρων αυξήθηκε όταν οι νανοδομές υποβλήθηκαν σε διατμητική τάση προκαλούμενη από υπερήχους για 10 και 20 min και στη συνέχεια μειώθηκε αργά.

Επίδραση του ιοντικού υγρού [Bmim][PF6] στη μεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα COS7. Τα νανοσύμπλοκα πλασμιδιακού DNA/IL (ιοντικού υγρού) υποβλήθηκαν σε διατμητική τάση προκαλούμενη από υπερήχους για έως και 120 λεπτά και σχημάτισαν σύμπλοκα με LA πριν από τη μεταφορά τους σε κύτταρα COS7. Τα δεδομένα δείχνουν τον μέσο αριθμό (%) των θετικών στην GFP κυττάρων HeLa που καταμετρήθηκαν σε 10 διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία και το πείραμα πραγματοποιήθηκε πολλές φορές σε τρεις διαφορετικές ημέρες. (Μελέτη και διάγραμμα: ©Sarker et al., 2019)

Παρασκευή κυτταρικού λύματος με υπερήχους

Πρωτόκολλο κυτταρικής λύσης με υπερήχους
Ξεκινήστε με ένα εμπλουτισμένο δείγμα κυττάρων που παρασκευάστηκε με μέθοδο κυτταρικού διαχωρισμού (π.χ. ανοσομαγνητικός διαχωρισμός κυττάρων, κυτταρική διαλογή ενεργοποιούμενη από φθορισμό (FACS), φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας, απομόνωση κυττάρων βάσει ανοσοπυκνότητας).
Τα κυτταρικά δείγματα πρέπει να περιέχουν όγκο ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κατάλληλο για τον πειραματικό στόχο και τη συσκευή υπερήχων τύπου ακίδας.
Προτιμώνται τα υποτονικά ρυθμιστικά διαλύματα, καθώς ενισχύουν την κυτταρική λύση με υπερήχους. Είναι σημαντικό να χρησιμοποιούνται κατάλληλα τα πρόσθετα και η συγκέντρωση αλάτων.
Επιλέξτε τη συσκευή λύσης με υπερήχους: Για έμμεση κατεργασία φιαλιδίων με υπερήχους, συνιστώνται το VialTweeter ή το CupHorn. Για πλάκες πολλαπλών βοθρίων, το UIP400MTP είναι η ιδανική συσκευή υπερήχων. Και για την κλασική κατεργασία με υπερήχους τύπου ακίδας, καταλληλότερος είναι ένας ομογενοποιητής υπερήχων, όπως ο UP100H ή ο UP200Ht με μικροακίδα.
Πρωτόκολλο κατεργασίας με υπερήχους τύπου ακίδας: Τοποθετήστε την ακίδα της συσκευής υπερήχων μέσα στον όγκο του δείγματος σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης και εφαρμόστε κατεργασία με υπερήχους για περίπου 10 δευτερόλεπτα. Ανάλογα με το δείγμα DNA, η κατεργασία με υπερήχους ενδέχεται να επαναληφθεί μία ή δύο ακόμη φορές. Η απαιτούμενη εισροή ενέργειας υπερήχων (Ws/mL) εξαρτάται από το ιξώδες του δείγματος και τον τύπο του DNA. Η ψύξη με παγόλουτρο και η παλμική λειτουργία της συσκευής υπερήχων συμβάλλουν στην αποτροπή της θερμικής αποδόμησης του δείγματος.
Μετά τη λύση με υπερήχους, το δείγμα φυγοκεντρείται για να διαχωριστούν τα υπολείμματα στο ίζημα (που περιέχουν μη λυμένα κύτταρα, πυρήνες και μη λυμένα οργανίδια)
Εάν το δείγμα δεν υποβληθεί αμέσως σε περαιτέρω επεξεργασία, μπορεί να αποθηκευτεί σε κατάλληλη θερμοκρασία ώστε να διατηρηθεί η βιωσιμότητά του.

Συσκευές υπερήχων για τον κατακερματισμό DNA

Η Hielscher Ultrasonics προσφέρει διάφορες πλατφόρμες που βασίζονται στους υπερήχους για τον κατακερματισμό DNA, RNA και χρωματίνης. Αυτές οι διαφορετικές πλατφόρμες περιλαμβάνουν ακίδες υπερήχων (ηχοτρόδια), λύσεις έμμεσης κατεργασίας με υπερήχους για την ταυτόχρονη προετοιμασία δειγμάτων σε πολλαπλά σωληνάρια ή πλάκες πολλαπλών βοθρίων (π.χ. πλάκες 96 βοθρίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης), αντιδραστήρες υπερήχων και ηχοτρόδια υπερήχων τύπου κυπέλλου. Όλες οι πλατφόρμες για τη διάτμηση DNA τροφοδοτούνται από επεξεργαστές υπερήχων υψηλών επιδόσεων με συντονισμένη συχνότητα, οι οποίοι επιτρέπουν ακριβή έλεγχο και παρέχουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.

Επεξεργαστές υπερήχων για οποιονδήποτε αριθμό και μέγεθος δειγμάτων

Με τις συσκευές υπερήχων πολλαπλών δειγμάτων VialTweeter (για έως και 10 δοκιμαστικούς σωλήνες) και UIP400MTP (για μικροπλάκες/ πλάκες πολλαπλών βοθρίων) της Hielscher, καθίσταται εύκολη η μείωση του χρόνου επεξεργασίας των δειγμάτων χάρη στην έντονη και επακριβώς ελεγχόμενη κατεργασία με υπερήχους, ενώ παράλληλα επιτυγχάνονται η επιθυμητή κατανομή μεγεθών των θραυσμάτων DNA και η επιθυμητή απόδοση. Ο κατακερματισμός DNA με υπερήχους καθιστά τα στάδια παρασκευής πλασμιδίων αποδοτικά, αξιόπιστα και κλιμακώσιμα. Τα πρωτόκολλα μπορούν να κλιμακωθούν γραμμικά από ένα σε πολυάριθμα δείγματα, εφαρμόζοντας σταθερές παραμέτρους υπερήχων.
Οι συσκευές υπερήχων τύπου ακίδας με ένα έως πέντε δάκτυλα είναι ιδανικές για την προετοιμασία μικρότερου αριθμού δειγμάτων. Οι εργαστηριακές συσκευές υπερήχων της Hielscher διατίθενται με διαφορετικά επίπεδα ισχύος, ώστε να μπορείτε να επιλέξετε την ιδανική συσκευή διάρρηξης με υπερήχους για την εφαρμογή σας που σχετίζεται με το DNA.