Προετοιμασία πλασμιδίου χρησιμοποιώντας υπερήχους

Υπερήχους είναι μια αξιόπιστη τεχνική για να κατακερματίσει πλασμιδικό DNA. Ακριβώς ελεγχόμενο πλάτος, λειτουργία παλμών και έλεγχος θερμοκρασίας είναι τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά ενός υπερηχητικού για μη επιβλαβή κατακερματισμό πλασμιδίων. Επιπλέον, η χρήση ορισμένων παραγόντων βοηθά στην προστασία από την αποικοδόμηση πλασμιδίων. Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες λύσεις για ελεγχόμενο κατακερματισμό πλασμιδίων από μεμονωμένα φιαλίδια, ταυτόχρονη υπερήχηση πολλών δειγμάτων, καθώς και πλάκες πολλαπλών φρεατίων. Μάθετε περισσότερα σχετικά με τον επιτυχή υπερηχητικό κατακερματισμό πλασμιδίου!

Διάτμηση πλασμιδίων χρησιμοποιώντας υπερήχους

Όταν τα δείγματα DNA υποβάλλονται σε υπερηχητικά κύματα, οι δονήσεις που παράγονται με υπερήχους δημιουργούν ακουστική σπηλαίωση στο υγρό που ψαλιδίζει ή σπάει μόρια DNA υψηλού μοριακού βάρους μέσω μηχανικών δυνάμεων. Κατεργασία με υπερήχους είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για μαζικά πειράματα διάτμησης DNA, συμπεριλαμβανομένων εφαρμογών, όπως η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP), για την οποία τα μικρά μεγέθη θραυσμάτων είναι απολύτως ζωτικής σημασίας για την επίτευξη υψηλής ανάλυσης. (πρβλ. Tseng et al., 2012)
Το πλασμιδικό DNA (pDNA) είναι ειδική μορφή DNA, που χαρακτηρίζεται από το σχήμα του δακτυλίου του και βρίσκεται σε βακτήρια και μερικούς ευκαρυώτες.
Το υπερτυλιγμένο pDNA είναι η επιθυμητή μορφή πλασμιδικού DNA, καθώς δείχνει καλύτερα αποτελέσματα σε κατάντη διαδικασίες όπως η αυτοματοποιημένη αλληλούχιση και η μόλυνση. Υπερήχους είναι κατάλληλο να κατακερματίσει pDNA, συμπεριλαμβανομένων supercoiled pDNA, με επιτυχία.
Οι Thompson et al. (2008) έδειξαν ότι η υπερήχηση πλασμιδίου, η οποία είναι γνωστό ότι κατακερματίζει το υπερτυλιγμένο DNA, είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος βελτίωσης των μηκών ανάγνωσης της αλληλουχίας phred20 στο σημείο που δεν διαφέρουν σημαντικά από το πρότυπο ελέγχου του Beckman Coulter ή τα ενζυματικά γραμμικά πλασμίδια.

Χρήση πλασμιδικών φορέων

Τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται συχνά ως εργαλεία για την κλωνοποίηση, τη μεταφορά και το χειρισμό γονιδίων. Όταν τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται πειραματικά για αυτούς τους σκοπούς, ονομάζονται φορείς. Θραύσματα DNA ή γονίδια μπορούν να εισαχθούν σε έναν πλασμιδικό φορέα, δημιουργώντας ένα λεγόμενο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Οι πλασμιδιακοί φορείς χρησιμοποιούνται ως οχήματα για την οδήγηση του ανασυνδυασμένου DNA σε ένα κύτταρο ξενιστή και αποτελούν βασικό συστατικό της μοριακής κλωνοποίησης.
“Οι μη ιικοί φορείς μελετώνται εκτενώς για την πιθανή χρήση τους στη γονιδιακή θεραπεία για τη θεραπεία διαφόρων περίπλοκων ασθενειών. Οι μη ιικοί φορείς προστατεύουν το πλασμιδικό DNA από τη φυσική, χημική και ενζυματική αποικοδόμηση και παραδίδουν το μόριο DNA στη θέση στόχου. Για παράδειγμα, τα κατιονικά λιποσώματα, η χιτοζάνη και άλλα θετικά φορτισμένα νανοσωματίδια σχηματίζουν σύμπλοκα με πλασμιδικό DNA μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Ωστόσο, τα εύκολα σχηματισμένα κατιονικά λιποσώματα / σύμπλοκα πλασμιδικού DNA είναι σχετικά μεγάλα (δηλ. 300-400 nm) και ετερογενή στη φύση, καθιστώντας δύσκολη τη χρήση τους σε φαρμακευτικές εφαρμογές. Τα μεγάλα και ετερογενή πλασμιδικά DNA / λιποσώματα, πλασμιδικό DNA / αερολύματα, και σύμπλοκα πλασμιδικού DNA / πεπτιδίων μπορούν να μειωθούν σε μικρότερα και ομοιογενή σωματίδια χρησιμοποιώντας υπερήχους.” (Sarker κ.ά., 2019)
Ένα εξέχον παράδειγμα για τη χρήση πλασμιδικών φορέων είναι το CRISPR–Cas9. Το σύστημα CRISPR-Cas9 συνήθως παραδίδεται στα κύτταρα ως ένα ενιαίο μεγάλο πλασμίδιο ή πολλαπλά μικρότερα πλασμίδια που κωδικοποιούν μια αλληλουχία στόχου, έναν οδηγό CRISPR και Cas9.

Υπερήχων προετοιμασία νανοσωματιδίων PLGA φορτωμένου με DNA με νανοκατακρήμνιση

Οι Jo et al. (2020) χρησιμοποίησαν πολυ(γαλακτικό-συν-γλυκολικό οξύ) (PLGA) για να σχηματίσουν έναν φορέα νανοσωματιδίων για την παράδοση ενός μοντέλου πλασμιδίου CRISPR-Cas9 σε πρωτογενή μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών. Για τη νανοκατακρήμνιση νανοσωματιδίων PLGA, χρησιμοποιήθηκαν PLGA με δύο διαφορετικές τελικές ομάδες (ομάδες εστέρων και αμινών) με στόχο τα θετικά φορτισμένα τελικά καπάκια αμίνης να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα της ενθυλάκωσης και τη φόρτιση λόγω των αλληλεπιδράσεων φορτίου μεταξύ αυτής και της αρνητικά φορτισμένης ραχοκοκαλιάς του DNA. Σε ένα κωνικό σωλήνα φυγοκέντρησης πολυπροπυλενίου 50 mL, 100 mg Pluronic F127 διαλύθηκε σε 20 mL αυτόκλειστου νερού DI με ανάμιξη στροβίλου ακολουθούμενη από 30 λεπτά απαλής υπερήχησης χρησιμοποιώντας λουτρό υπερήχων (βλέπε CupHorn). Προστέθηκε μια μαγνητική ράβδος ανάδευσης σε αυτόκλειστο και το διάλυμα αναμίχθηκε στις 600 σ.α.λ. για 30 λεπτά, ενώ έγιναν τα άλλα διαλύματα. Πλαστικά εργαστηριακά σκεύη χρησιμοποιήθηκαν αντί για γυάλινα σκεύη παντού για να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική προσρόφηση του DNA. Διαλύματα PLGA διαλυμένα σε DMF (44,48 mg/ml) και πεντακένιο TIPS διαλυμένα σε THF (0,667 mg/ml) παρασκευάστηκαν ξεχωριστά. Το PLGA αφέθηκε ήρεμο να βρέξει σε DMF για 30 λεπτά πριν υποβληθεί σε υπερήχους για 30 λεπτά. (για πλήρες πρωτόκολλο βλ. Jo et al., 2020)

Προστασία πλασμιδικού DNA κατά τη διάρκεια υπερήχων

Το DNA, συμπεριλαμβανομένων των πλασμιδίων και των υπερτυλιγμένων πλασμιδίων, είναι εξαιρετικά ευαίσθητη αποδόμηση. Όλες οι διαθέσιμες μέθοδοι κατακερματισμού είναι γνωστές για ορισμένα μειονεκτήματα. Υπερήχων κατακερματισμός DNA είναι μία από τις προτιμώμενες μεθόδους, δεδομένου ότι η ελεγχόμενη υπερήχηση σε συνδυασμό με προστατευτικά μέτρα επιτρέπει τη μείωση της διάτμησης και της θερμότητας που προκαλείται από βλάβη των κλώνων DNA.
Εκτός από τις ρυθμίσεις χαμηλού πλάτους, τον τρόπο παλμών και τον έλεγχο θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της διάτμησης DNA με υπερήχους, η χρήση ορισμένων παραγόντων έδειξε σημαντική προστατευτική επίδραση έναντι της υποβάθμισης του DNA. Για παράδειγμα, διάφορα πολυμερή, πεπτίδια, και λιπίδια προστατεύουν το πλασμιδικό DNA κατά τη διάρκεια υπερήχων.

Η σταθερότητα του πλασμιδικού DNA και των νανοσυμπλεγμάτων πλασμιδικού DNA / IL έναντι του υπερηχητικού στρες διάτμησης διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης. Τόσο το πλασμιδικό DNA όσο και τα νανοσύμπλοκα πλασμιδικού DNA / IL υποβλήθηκαν σε υπερηχητική τάση διάτμησης για διαφορετικά χρονικά σημεία. Το πλασμιδικό DNA εκτέθηκε σε υπερηχητικό στρες διάτμησης για 0, 10, 20, 30 και 40 λεπτά. Ωστόσο, τα νανοσύμπλοκα πλασμιδίου DNA / IL εκτέθηκαν σε υπερηχητικό στρες διάτμησης για 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 και 120 λεπτά.
(μελέτη και εικόνα: ©Sarker et al., 2019)

Οι Sarker et al. (2019) έδειξαν ότι όταν οι νανοδομές πλασμιδικού DNA / ιοντικού υγρού (pDNA / IL) υποβλήθηκαν σε υπερηχητική τάση διάτμησης για 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 και 120 λεπτά και συμπλοκοποιήθηκαν με τον εμπορικά διαθέσιμο κατιονικό παράγοντα παράδοσης γονιδίων λιποφεκταμίνη, το ποσοστό των φθοριζόντων θετικών κυττάρων ήταν 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% και 50%, αντίστοιχα (βλ. διάγραμμα παρακάτω). Το ποσοστό των φθοριζόντων θετικών κυττάρων αυξήθηκε όταν οι νανοδομές υποβλήθηκαν σε υπερηχητική τάση διάτμησης για 10 και 20 λεπτά και στη συνέχεια μειώθηκε αργά.

Επίδραση ιοντικού υγρού [Bmim][PF6] στην παροχή πλασμιδικού DNA σε κύτταρα COS7. Τα νανοσύμπλοκα Plasmid DNA / IL (ιοντικό υγρό) υποβλήθηκαν σε υπερηχητική τάση διάτμησης για έως και 120 λεπτά και συμπλοκοποιήθηκαν με LA πριν παραδοθούν σε κύτταρα COS7. Τα δεδομένα δείχνουν τον μέσο αριθμό (%) των θετικών στην GFP κυττάρων HeLa που μετρήθηκαν σε 10 διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία και το πείραμα πραγματοποιήθηκε πολλές φορές σε τρεις διαφορετικές ημέρες. (Μελέτη και διάγραμμα: ©Sarker et al., 2019)

Υπερήχων Lysate Προετοιμασία

Πρωτόκολλο λύσης κυττάρων υπερήχων
Ξεκινήστε με ένα εμπλουτισμένο δείγμα κυττάρων που παρασκευάστηκε μέσω μιας μεθόδου διαχωρισμού κυττάρων (π.χ. ανοσομαγνητικός κυτταρικός διαχωρισμός, διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένη με φθορισμό (FACS), φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας, απομόνωση κυττάρων ανοσοπυκνότητας).
Τα δείγματα κυττάρων πρέπει να δείχνουν έναν όγκο ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που είναι κατάλληλος για τον πειραματικό στόχο και τον υπερηχητικό τύπο καθετήρα.
Τα υποτονικά ρυθμιστικά διαλύματα προτιμώνται καθώς ενισχύουν την υπερηχητική κυτταρική λύση. Είναι σημαντικό τα πρόσθετα και η συγκέντρωση αλάτων να χρησιμοποιούνται με κατάλληλο τρόπο.
Επιλέξτε τη συσκευή λύσης υπερήχων: Για έμμεση υπερήχηση φιαλιδίων, συνιστάται το VialTweeter ή το CupHorn. Για πλάκες πολλαπλών πηγαδιών, το UIP400MTP είναι ο ιδανικός υπερηχητικός. Και κλασική κατεργασία με υπερήχους τύπου καθετήρα, ένας υπερηχητικός ομογενοποιητής ως UP100H ή UP200Ht με μικρο-άκρη είναι οι πλέον κατάλληλοι.
Πρωτόκολλο για κατεργασία με υπερήχους τύπου καθετήρα: Τοποθετήστε τον καθετήρα υπερήχων στον όγκο του δείγματος σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης και υπερήχων για περίπου 10 δευτερόλεπτα. Ανάλογα με το δείγμα DNA, η υπερήχηση μπορεί να επαναληφθεί μία ή δύο φορές. Η απαιτούμενη εισροή ενέργειας υπερήχων (Ws / mL) εξαρτάται από το ιξώδες του δείγματος και τον τύπο DNA. Η ψύξη μέσω λουτρού πάγου και ο τρόπος παλμών του υπερήχων βοηθά στην πρόληψη της θερμικής υποβάθμισης του δείγματος.
Μετά από λύση με υπερήχους, το δείγμα φυγοκεντρείται σε διαχωρισμένα υπολείμματα σφαιριδίων (που περιέχουν μη λυμένα κύτταρα, πυρήνες και μη λυμένα οργανίδια)
Εάν το δείγμα δεν υποστεί άμεση περαιτέρω επεξεργασία, μπορεί να αποθηκευτεί σε κατάλληλη θερμοκρασία για να διατηρηθεί η βιωσιμότητά του.

Υπερήχων για κατακερματισμό DNA

Hielscher Υπέρηχοι προσφέρει διάφορες υπερήχων με βάση τις πλατφόρμες για το DNA, RNA, και κατακερματισμό χρωματίνης. Αυτές οι διαφορετικές πλατφόρμες περιλαμβάνουν υπερηχητικούς ανιχνευτές (sonotrodes), έμμεσες λύσεις υπερήχων για την ταυτόχρονη προετοιμασία δείγματος πολλαπλών σωλήνων ή πλακών πολλαπλών φρεατίων (π.χ. πλάκες 96 φρεατίων, πλάκες μικροτιτλοδότησης), sonoreactors, και υπερήχων cuphorns. Όλες οι πλατφόρμες διάτμησης DNA τροφοδοτούνται από επεξεργαστές υπερήχων υψηλής απόδοσης συντονισμένους με συχνότητα, οι οποίοι είναι ακριβώς ελεγχόμενοι και παρέχουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.

Υπερήχων επεξεργαστές για οποιοδήποτε αριθμό δείγματος και μέγεθος

Με τους υπερήχους πολλαπλών δειγμάτων Hielscher VialTweeter (για έως και 10 δοκιμαστικούς σωλήνες) και UIP400MTP (για μικροπλάκες / πλάκες πολλαπλών φρεατίων) καθίσταται εύκολα δυνατή η μείωση του χρόνου επεξεργασίας δείγματος λόγω έντονης και επακριβώς ελεγχόμενης υπερήχων, ενώ επιτυγχάνεται η επιθυμητή κατανομή μεγέθους θραυσμάτων DNA και απόδοση. Ο υπερηχητικός κατακερματισμός DNA καθιστά τα βήματα προετοιμασίας πλασμιδίων αποτελεσματικά, αξιόπιστα και επεκτάσιμα. Τα πρωτόκολλα μπορούν να κλιμακωθούν γραμμικά από ένα έως πολλά δείγματα εφαρμόζοντας σταθερές παραμέτρους υπερήχων.
Καθετήρας υπερήχων με ένα έως πέντε δάχτυλα είναι ιδανικό για την προετοιμασία μικρότερων αριθμών δειγμάτων. Εργαστήριο υπερήχων Hielscher είναι διαθέσιμα με διαφορετικά επίπεδα ισχύος, ώστε να μπορείτε να επιλέξετε τον ιδανικό υπερηχητικό διαταράκτη για την εφαρμογή που σχετίζεται με το DNA σας.