Κατακερματισμός χρωματίνης με κατεργασία με υπερήχους
Ο κατακερματισμός της χρωματίνης αποτελεί κρίσιμο βήμα σε πολλές ροές εργασίας της επιγενετικής και της μοριακής βιολογίας, ιδιαίτερα στην ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP), στη ChIP-seq και σε συναφείς αναλύσεις. Στόχος είναι ο κατακερματισμός της χρωματίνης σε αναπαραγώγιμα σύμπλοκα DNA-πρωτεϊνών, με παράλληλη διατήρηση της ακεραιότητας των επιτόπων και ελαχιστοποίηση της απώλειας δείγματος. Μεταξύ των διαθέσιμων μεθόδων, ο κατακερματισμός της χρωματίνης με υπερήχους έχει εξελιχθεί σε μια ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση, επειδή παρέχει αξιόπιστο κατακερματισμό χωρίς αντιδραστήρια και με εξαιρετική αναπαραγωγιμότητα.
Τι πρέπει να λάβω υπόψη κατά τον κατακερματισμό της χρωματίνης;
Ο αποτελεσματικός κατακερματισμός της χρωματίνης απαιτεί προσεκτικό έλεγχο των πειραματικών παραμέτρων. Ο ακατάλληλος κατακερματισμός μπορεί να υπονομεύσει τα επακόλουθα πειράματα ChIP, δημιουργώντας θραύσματα που είναι είτε υπερβολικά μεγάλα είτε υπερβολικά αποδομημένα είτε παρουσιάζουν ανομοιογένεια μεταξύ των δειγμάτων.
Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες είναι η επιθυμητή κατανομή μεγέθους των θραυσμάτων. Για τις περισσότερες εφαρμογές ChIP και ChIP-seq, τα θραύσματα χρωματίνης μεταξύ 100 και 600 ζευγών βάσεων είναι βέλτιστα. Αυτό το εύρος μεγέθους επιτρέπει αποτελεσματική ανοσοκατακρήμνιση, παρέχοντας παράλληλα επαρκή διακριτική ικανότητα για γονιδιωματική χαρτογράφηση.
Ένας ακόμη βασικός παράγοντας είναι η αποτελεσματικότητα σχηματισμού διασταυρούμενων δεσμών πριν από την κατεργασία με υπερήχους. Οι περισσότερες ροές εργασίας ChIP περιλαμβάνουν μονιμοποίηση με φορμαλδεΰδη για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών-DNA. Ωστόσο, ο υπερβολικός σχηματισμός διασταυρούμενων δεσμών μπορεί να καταστήσει τη χρωματίνη πιο ανθεκτική στον κατακερματισμό, απαιτώντας μεγαλύτερους χρόνους κατεργασίας με υπερήχους και αυξάνοντας ενδεχομένως την έκθεση σε θερμότητα.
Ο έλεγχος της θερμοκρασίας είναι επίσης καθοριστικός. Η κατεργασία με υπερήχους παράγει ενέργεια τοπικά, η οποία μπορεί να αυξήσει τη θερμοκρασία του δείγματος. Οι αυξημένες θερμοκρασίες ενδέχεται να προκαλέσουν βλάβη στο DNA ή μετουσίωση των πρωτεϊνών, επηρεάζοντας την αναγνώρισή τους από τα αντισώματα κατά τη ChIP. Για τον λόγο αυτό, πολλοί ερευνητές εκτελούν κύκλους παλμικής κατεργασίας με υπερήχους σε συνδυασμό με διαστήματα ψύξης, ώστε να διατηρούν τη σταθερότητα του δείγματος.
Η συγκέντρωση και ο όγκος του δείγματος επηρεάζουν επίσης την αποτελεσματικότητα του κατακερματισμού. Τα εναιωρήματα χρωματίνης υψηλής συγκέντρωσης ενδέχεται να απαιτούν μεγαλύτερους χρόνους κατεργασίας με υπερήχους, ενώ οι μικροί όγκοι δείγματος απαιτούν ακριβή παροχή ενέργειας για την αποφυγή υπερβολικής επεξεργασίας.
Τέλος, η επιλογή της συσκευής κατεργασίας με υπερήχους επηρεάζει σημαντικά την πειραματική αναπαραγωγιμότητα. Οι συσκευές που έχουν σχεδιαστεί για τον κατακερματισμό της χρωματίνης παρέχουν συνήθως ελεγχόμενη ενέργεια υπερήχων και τυποποιημένο χειρισμό των δειγμάτων, επιτρέποντας ομοιόμορφο κατακερματισμό σε πολλαπλά δείγματα.
Κατακερματισμός DNA με υπερήχους κατά τη ChIP – ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης
Ποια συσκευή κατεργασίας με υπερήχους πρέπει να επιλέξω για τον κατακερματισμό της χρωματίνης;
Οι διαφορετικές εργαστηριακές ροές εργασίας απαιτούν διαφορετικές διατάξεις κατεργασίας με υπερήχους. Το βέλτιστο σύστημα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον ρυθμό επεξεργασίας των δειγμάτων, τον όγκο και την πειραματική διάταξη.
Συσκευή κατεργασίας με υπερήχους τύπου εμβαπτιζόμενου καθετήρα
Μια συσκευή κατεργασίας με υπερήχους τύπου εμβαπτιζόμενου καθετήρα μεταδίδει ενέργεια υπερήχων απευθείας στο δείγμα μέσω ενός καθετήρα τιτανίου. Αυτή η διάταξη παρέχει πολύ υψηλή πυκνότητα ενέργειας και είναι επομένως κατάλληλη για ισχυρή διάρρηξη της χρωματίνης σε μεμονωμένα δείγματα.
Οι συσκευές υπερήχων με εμβαπτιζόμενο καθετήρα είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για:
- Μικρό έως μέτριο αριθμό δειγμάτων
- Χρωματίνη που κατακερματίζεται δύσκολα
- Ευέλικτα πειραματικά πρωτόκολλα
Συσκευή κατεργασίας πολλαπλών σωληναρίων με υπερήχους – VialTweeter
Για εργαστήρια που επεξεργάζονται πολλαπλά δείγματα ταυτόχρονα, η συσκευή κατεργασίας πολλαπλών σωληναρίων με υπερήχους VialTweeter παρέχει μια λύση με υψηλή αναπαραγωγιμότητα. Το σύστημα μεταδίδει την ενέργεια υπερήχων έμμεσα μέσω της βάσης στήριξης των φιαλιδίων, επιτρέποντας τον κατακερματισμό μέσα σε αρκετά σφραγισμένα σωληνάρια υπό πανομοιότυπες συνθήκες.
Αυτή η διάταξη προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα:
- Παράλληλος κατακερματισμός χρωματίνης σε πολλαπλά δείγματα
- Εξάλειψη της επιμόλυνσης από τον καθετήρα
- Υψηλή αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των σωληναρίων
- Απλοποιημένη ροή εργασίας για την προετοιμασία δειγμάτων ChIP
Τέτοια συστήματα πολλαπλών σωληναρίων είναι ιδιαίτερα κατάλληλα για πειράματα ChIP ρουτίνας και μελέτες με μέτριο ρυθμό επεξεργασίας δειγμάτων.
Συσκευή κατεργασίας μικροπλακών με υπερήχους – UIP400MTP
Οι επιγενετικές μελέτες με υψηλό ρυθμό επεξεργασίας δειγμάτων βασίζονται ολοένα περισσότερο στην επεξεργασία δειγμάτων σε μικροπλάκες. Η συσκευή κατεργασίας μικροπλακών με υπερήχους UIP400MTP έχει σχεδιαστεί για τον κατακερματισμό της χρωματίνης απευθείας σε τυπικές μικροπλάκες, χωρίς μεταφορά των δειγμάτων.
Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει:
- Ταυτόχρονη επεξεργασία δεκάδων ή εκατοντάδων δειγμάτων
- Ροές εργασίας κατάλληλες για αυτοματοποίηση
- Ομοιόμορφη κατανομή της ενέργειας υπερήχων σε όλα τα βοθρία
- Σημαντική μείωση των βημάτων χειρισμού των δειγμάτων
Για μεγάλα έργα μαζικού ελέγχου με ChIP-seq ή επιγενετικές μελέτες υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, η κατεργασία με υπερήχους σε μικροπλάκες παρέχει εξαιρετική δυνατότητα κλιμάκωσης και αποδοτικότητα. Η συσκευή υπερήχων UIP400MTP για πλάκες πολλαπλών βοθρίων είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για ενσωμάτωση σε συστήματα χειρισμού υγρών και αυτοματοποιημένες εργαστηριακές ροές εργασίας.
Γιατί να επιλέξετε την κατεργασία με υπερήχους έναντι άλλων τεχνικών διάτμησης της χρωματίνης;
Σε σύγκριση με τις ενζυμικές προσεγγίσεις, η κατεργασία με υπερήχους για ChIP παρέχει κατακερματισμό χωρίς μεροληψία, καθώς η διεργασία δεν εξαρτάται από ενζυμική δραστικότητα ειδική για συγκεκριμένες αλληλουχίες. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για επιγενετικές μελέτες σε ολόκληρο το γονιδίωμα, όπου η ομοιόμορφη κάλυψη είναι απαραίτητη.
Ένα ακόμη σημαντικό πλεονέκτημα είναι η δυνατότητα κλιμάκωσης. Τα συστήματα υπερήχων μπορούν να επεξεργαστούν μεμονωμένα δείγματα, πολλαπλά σωληνάρια ή ολόκληρες μικροπλάκες, επιτρέποντας στα εργαστήρια να επιλέγουν την καταλληλότερη διαμόρφωση για τη διεκπεραιωτική ικανότητα των πειραμάτων τους.
Τέλος, η κατεργασία με υπερήχους παρέχει εξαιρετικό έλεγχο των παραμέτρων κατακερματισμού. Ρυθμίζοντας τους κύκλους παλμών, τη διάρκεια και τα επίπεδα ισχύος, οι ερευνητές μπορούν να επιτυγχάνουν αξιόπιστα την επιθυμητή κατανομή μεγέθους των θραυσμάτων.
Κατακερματισμός της χρωματίνης με βελτιστοποιημένη κατεργασία δειγμάτων ChIP με υπερήχους.
(a) χωρίς διάτμηση (μεγάλου μήκους θραύσματα στην πηκτή)·
(b) βέλτιστο προφίλ κατακερματισμού (εμπλουτισμός σε θραύσματα μήκους 200–600 bp)·
(c) υπερβολικός κατακερματισμός του DNA (υπερεκπροσώπηση θραυσμάτων μήκους μικρότερου από 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
Σύγκριση τεχνικών διάτμησης της χρωματίνης
| Μέθοδος διάτμησης της χρωματίνης | Αρχή λειτουργίας | Πλεονεκτήματα | Περιορισμοί |
| Κατεργασία με υπερήχους | Η ακουστική ενέργεια υψηλής συχνότητας κατακερματίζει μηχανικά τη χρωματίνη. | Κατακερματισμός χωρίς αντιδραστήρια, αποτελέσματα υψηλής αναπαραγωγιμότητας, ρυθμιζόμενη κατανομή μεγέθους των θραυσμάτων, συμβατότητα με χρωματίνη με διασταυρούμενους δεσμούς, δυνατότητα κλιμάκωσης από μεμονωμένα σωληνάρια έως διατάξεις πολλαπλών δειγμάτων και μικροπλακών. | Απαιτεί εξοπλισμό κατεργασίας με υπερήχους και βελτιστοποίηση των παραμέτρων της κατεργασίας με υπερήχους. |
| Ενζυμική πέψη (MNase) | Η μικροκοκκική νουκλεάση πέπτει το DNA μεταξύ των νουκλεοσωμάτων. | Ήπιος κατακερματισμός και χρησιμότητα για την ανάλυση χρωματίνης στη φυσική της κατάσταση. | Ενζυμική μεροληψία, προτίμηση αλληλουχίας, δυσκολία ελέγχου της πέψης, πιθανή μεταβλητότητα μεταξύ πειραμάτων. |
| Μηχανική διάτμηση (βελόνα / σύριγγα) | Η χρωματίνη διαρρηγνύεται μέσω επανειλημμένης άσκησης μηχανικής δύναμης. | Απλή μέθοδος που απαιτεί ελάχιστο εξοπλισμό. | Χαμηλή αναπαραγωγιμότητα, περιορισμένος έλεγχος του μεγέθους των θραυσμάτων, απαιτεί πολλή εργασία για πολλαπλά δείγματα. |
| Νεφελοποίηση | Ο πεπιεσμένος αέρας εξωθεί το DNA μέσα από μικρά στόμια, προκαλώντας κατακερματισμό. | Ταχεία διαδικασία κατακερματισμού. | Πιθανή απώλεια δείγματος, περιορισμένη δυνατότητα κλιμάκωσης, απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό. |
Πώς προσδιορίζω ποσοτικά και αξιολογώ ποιοτικά την απόδοση ανάκτησης χρωματίνης μετά τον κατακερματισμό με υπερήχους;
Μετά την κατεργασία με υπερήχους για ChIP, οι ερευνητές πρέπει να αξιολογούν τόσο την ποσότητα όσο και την ποιότητα της κατακερματισμένης χρωματίνης. Αυτό το βήμα επαλήθευσης διασφαλίζει ότι ο κατακερματισμός της χρωματίνης πληροί τις απαιτήσεις των επακόλουθων εφαρμογών, όπως η ChIP-qPCR ή η ChIP-seq.
Ο ποσοτικός προσδιορισμός συνήθως ξεκινά με τη μέτρηση της συγκέντρωσης του DNA. Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι, όπως η ανάλυση Nanodrop, ή φθορισμομετρικές δοκιμασίες, όπως ο ποσοτικός προσδιορισμός DNA με Qubit, παρέχουν αξιόπιστες εκτιμήσεις της απόδοσης ανάκτησης χρωματίνης μετά την αναστροφή των διασταυρούμενων δεσμών και τον καθαρισμό.
Ωστόσο, η συγκέντρωση του DNA από μόνη της δεν αποκαλύπτει εάν ο κατακερματισμός ήταν επιτυχής. Για τον λόγο αυτό, οι ερευνητές αξιολογούν την κατανομή μεγέθους των θραυσμάτων χρησιμοποιώντας ηλεκτροφορητικές τεχνικές. Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης παραμένει μια ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση για την οπτικοποίηση των θραυσμάτων DNA και την επαλήθευση ότι η πλειονότητά τους βρίσκεται εντός του επιδιωκόμενου εύρους μεγέθους.
Τα πιο προηγμένα εργαστήρια χρησιμοποιούν συχνά συστήματα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης, όπως το Agilent Bioanalyzer ή το TapeStation. Αυτές οι πλατφόρμες παρέχουν ακριβή προφίλ κατανομής μεγέθους και επιτρέπουν στους ερευνητές να εντοπίζουν υπερβολικό κατακερματισμό ή ατελή διάτμηση.
Κατά την αξιολόγηση της ποιότητας της χρωματίνης μετά τον κατακερματισμό με υπερήχους, οι ερευνητές συνήθως επιβεβαιώνουν ότι:
- Η πλειονότητα των θραυσμάτων DNA βρίσκεται εντός του εύρους 100–600 bp
- Η κατανομή των θραυσμάτων είναι συνεπής μεταξύ επαναληπτικών δειγμάτων
- Η αποικοδόμηση του DNA είναι ελάχιστη
- Η συνολική απόδοση χρωματίνης είναι επαρκής για την προγραμματισμένη δοκιμασία ChIP
Ο κατάλληλος ποιοτικός έλεγχος διασφαλίζει ότι το στάδιο κατακερματισμού της χρωματίνης με υπερήχους παράγει αναπαραγώγιμα και βιολογικά ουσιαστικά αποτελέσματα.
Συμπέρασμα: Κατακερματισμός χρωματίνης με υπερήχους για αξιόπιστη έρευνα
Ο αξιόπιστος κατακερματισμός της χρωματίνης είναι θεμελιώδης για την επιτυχή έρευνα με ChIP και την επιγενετική έρευνα. Ο κατακερματισμός με υπερήχους προσφέρει μια ισχυρή λύση, επειδή επιτρέπει την ακριβή και αναπαραγώγιμη διάρρηξη της χρωματίνης χωρίς αντιδραστήρια, σε ένα ευρύ φάσμα πειραματικών διατάξεων.
Βελτιστοποιώντας προσεκτικά τις παραμέτρους κατεργασίας με υπερήχους, επαληθεύοντας την κατανομή μεγέθους των θραυσμάτων και επιλέγοντας το κατάλληλο σύστημα κατεργασίας με υπερήχους – είτε μια συσκευή υπερήχων με καθετήρα, είτε το VialTweeter για πολλαπλά σωληνάρια, είτε τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας – οι ερευνητές μπορούν να επιτύχουν ομοιόμορφο κατακερματισμό της χρωματίνης που υποστηρίζει αποτελέσματα ChIP και ChIP-seq υψηλής ποιότητας.
Καθώς η επιγενετική έρευνα συνεχίζει να εξελίσσεται προς υψηλότερη διεκπεραιωτική ικανότητα και μεγαλύτερη πειραματική αναπαραγωγιμότητα, ο κατακερματισμός της χρωματίνης με υπερήχους παραμένει μία από τις πιο ευέλικτες και αξιόπιστες μεθόδους που είναι διαθέσιμες στα σύγχρονα εργαστήρια μοριακής βιολογίας.
Σχεδιασμός, κατασκευή και συμβουλευτικές υπηρεσίες – Ποιότητα κατασκευής από τη Γερμανία
Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι ευρέως γνωστές για τα υψηλότερα πρότυπα ποιότητας και σχεδιασμού τους. Η ανθεκτικότητα και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των συσκευών υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher ανταποκρίνονται με ευκολία σε αντίξοες συνθήκες και απαιτητικά περιβάλλοντα.
Η Hielscher Ultrasonics είναι εταιρεία πιστοποιημένη κατά ISO και δίνει ιδιαίτερη έμφαση στις συσκευές υπερήχων υψηλών επιδόσεων που διαθέτουν τεχνολογία αιχμής και είναι φιλικές προς τον χρήστη. Φυσικά, οι συσκευές υπερήχων της Hielscher συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις CE και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.
Βάση σωληναρίων που υποβάλλεται σε κατεργασία με υπερήχους στο UIP400MTP για τον κατακερματισμό χρωματίνης
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Συχνές ερωτήσεις
Τι είναι η χρωματίνη;
Η χρωματίνη είναι το δομικό σύμπλοκο του DNA και των πρωτεϊνών που συνδέονται με αυτό, το οποίο οργανώνει το γενετικό υλικό μέσα στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων. Οι κύριες πρωτεΐνες της χρωματίνης είναι οι ιστόνες, γύρω από τις οποίες τυλίγεται το DNA για να σχηματίσει νουκλεοσώματα. Αυτή η οργάνωση συμπυκνώνει το DNA, ενώ ταυτόχρονα ρυθμίζει την πρόσβαση στη γενετική πληροφορία για διεργασίες όπως η μεταγραφή, η αντιγραφή και η επιδιόρθωση του DNA.
Ποιοι είναι οι τύποι χρωματίνης;
Η χρωματίνη ταξινομείται γενικά σε δύο κύριες μορφές: την ευχρωματίνη και την ετεροχρωματίνη. Η ευχρωματίνη έχει χαλαρή συσκευασία και είναι μεταγραφικά ενεργή, επιτρέποντας την εύκολη πρόσβαση του μεταγραφικού μηχανισμού στα γονίδια. Η ετεροχρωματίνη έχει πυκνότερη συσκευασία και είναι μεταγραφικά ανενεργή, περιέχοντας συνήθως επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA ή γονίδια που βρίσκονται σε σίγηση. Η ετεροχρωματίνη μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε ιδιοσυστατική ετεροχρωματίνη, η οποία παραμένει μόνιμα συμπυκνωμένη, και προαιρετική ετεροχρωματίνη, η οποία μπορεί να εναλλάσσεται μεταξύ ενεργής και ανενεργής κατάστασης ανάλογα με τις κυτταρικές συνθήκες.
Τι είναι η διασταυρούμενη σύνδεση;
Η διασταυρούμενη σύνδεση είναι μια βιοχημική διεργασία που χρησιμοποιείται για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ βιομορίων μέσω του σχηματισμού ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ τους. Στην έρευνα της χρωματίνης, η διασταυρούμενη σύνδεση χρησιμοποιείται συνήθως για τη διατήρηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών–DNA μέσα στη χρωματίνη πριν από την ανάλυση. Χημικοί παράγοντες όπως η φορμαλδεΰδη χρησιμοποιούνται συνήθως για τη δημιουργία αναστρέψιμων ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ του DNA και των πρωτεϊνών που συνδέονται με αυτό, ουσιαστικά «παγώνοντας» τις μοριακές αλληλεπιδράσεις σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή. Αυτή η σταθεροποίηση επιτρέπει τον κατακερματισμό και την επεξεργασία των συμπλόκων χρωματίνης χωρίς να χάνονται οι φυσικές συνδέσεις μεταξύ του DNA και των ρυθμιστικών πρωτεϊνών, κάτι που είναι απαραίτητο για τεχνικές όπως η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP).
Τι είναι η ChIP;
Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP) είναι μια τεχνική μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών και DNA εντός της χρωματίνης. Σε αυτή τη μέθοδο, τα σύμπλοκα DNA–πρωτεϊνών αρχικά σταθεροποιούνται, συνήθως με διασταυρούμενη σύνδεση, και στη συνέχεια η χρωματίνη κατακερματίζεται. Αντισώματα ειδικά για μια πρωτεΐνη-στόχο χρησιμοποιούνται για την ανοσοκατακρήμνιση των συμπλόκων πρωτεϊνών–DNA, επιτρέποντας την απομόνωση και την ανάλυση των σχετιζόμενων αλληλουχιών DNA.
Σε τι χρησιμεύει η ChIP;
Η ChIP χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό γονιδιωματικών περιοχών στις οποίες προσδένονται συγκεκριμένες πρωτεΐνες που σχετίζονται με το DNA, όπως μεταγραφικοί παράγοντες, τροποποιήσεις ιστονών ή ρυθμιστικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη χρωματίνη. Η τεχνική εφαρμόζεται ευρέως για τη μελέτη της γονιδιακής ρύθμισης, των επιγενετικών τροποποιήσεων, των θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων και της δομής της χρωματίνης. Όταν συνδυάζεται με αναλυτικές μεθόδους που ακολουθούν, όπως η ποσοτική PCR (ChIP-qPCR) ή η αλληλούχηση υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας (ChIP-seq), επιτρέπει τη χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών–DNA σε ολόκληρο το γονιδίωμα.
Ποιοι είναι οι τύποι της ChIP;
Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης, ανάλογα με τον πειραματικό σχεδιασμό και την επακόλουθη ανάλυση. Οι πιο συνηθισμένες προσεγγίσεις περιλαμβάνουν τη ChIP-qPCR, η οποία ποσοτικοποιεί τον εμπλουτισμό συγκεκριμένων γονιδιωματικών περιοχών, τη ChIP-seq, η οποία χρησιμοποιεί αλληλούχηση νέας γενιάς για τη χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών–DNA σε ολόκληρο το γονιδίωμα, και τη ChIP-chip, η οποία συνδυάζει τη ChIP με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA. Πρόσθετες παραλλαγές, όπως η ChIP φυσικής χρωματίνης (N-ChIP), η οποία αναλύει χρωματίνη χωρίς διασταυρούμενες συνδέσεις, και η ChIP διασταυρούμενα συνδεδεμένης χρωματίνης (X-ChIP), η οποία χρησιμοποιεί χημική διασταυρούμενη σύνδεση για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών–DNA, χρησιμοποιούνται επίσης ευρέως, ανάλογα με το βιολογικό ερώτημα που διερευνάται.
Κατακερματισμός χρωματίνης υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας με τη συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP
Η Hielscher Ultrasonics κατασκευάζει ομογενοποιητές υπερήχων υψηλής απόδοσης από εργαστηριακή έως βιομηχανική κλίμακα.