Herstellung von reinen Schizophyllan-Beta-Glucanen mit Ultraschall
Schizophyallan ist ein β-Glucan aus Pilzen mit immunmodulatorischen Eigenschaften. Für hochaktive medizinische Wirkungen muss Schizophyllan ein niedriges Molekulargewicht haben, um eine bessere Bioverfügbarkeit zu zeigen. Es ist erwiesen, dass die Ultraschallbehandlung das Molekulargewicht von Schizophyllan verringert. Als zuverlässige und wirksame Methode kann die Beschallung problemlos zur Herstellung von Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht eingesetzt werden.
Schizophyllum-Pilze und Beta-Glucan-Extraktion mit Ultraschall
Arten des Schizophyllum-Pilzes wachsen in der Natur nach Regenzeiten auf verrottenden Bäumen. Die Fruchtkörper werden in der folgenden Trockenzeit gesammelt. Schizophyllum-Arten sind reich an biochemischen Verbindungen wie Glucanen und werden daher vor allem in tropischen Ländern als Nahrungsmittel und Medizin verzehrt. Aufgrund seiner immunmodulatorischen, antimykotischen, antineoplastischen und antiviralen Eigenschaften hat Schizophyllum commune, auch bekannt als Splitgill-Pilz, das Interesse von Biotech- und Pharmaunternehmen geweckt.
Das Polysaccharid Schizophyllan, auch bekannt als Sizofiran, Sonifilan oder Sizofilan, ist das wichtigste β-Glucan in Schizophyllum-Pilzen, die das hochwirksame bioaktive β-Glucan Schizophyllan enthalten.
Schizophyllum commune-Pilze wachsen in der Natur auf Bäumen, das Mycellium kann auch in Fermentationsbrühe gezüchtet werden. Für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen ist Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht weitaus wirksamer als Schizophyllan mit hohem Molekulargewicht. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und Absorptionsrate aufweist. Darüber hinaus ist Schizophyllan mit hohem Molekulargewicht in der Anwendung oft problematisch, da es zu einer hohen Viskosität seiner wässrigen Lösungen führt.
Die Zerkleinerung mit Ultraschall ist eine hochwirksame und zuverlässige Technik zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan, wodurch die Qualität des β-Glucanmoleküls erhöht wird.

Das Ultraschallgerät UIP2000hdT wurde erfolgreich zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan, einem β-Glucan aus Pilzen, eingesetzt
Protokoll für die Herstellung von Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht
Da das Molekulargewicht von Schizophyllan eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und Anwendungseigenschaften aufweist, untersuchte das Forscherteam von Smirnou die Ultraschallbehandlung zur Spaltung und Größenreduktion des β-Glucanmoleküls Schizophyllan.
Ultraschallbehandlung von Schizophyllan
β-1.3(1.6)-Glucan Schizophyllan (SPG) wurde durch submerse Kultivierung des Pilzes S. commune in einem Bioreaktor unter Verwendung von Saccharose als Substrat hergestellt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe mit entmineralisiertem Wasser auf eine Schizophyllan-Konzentration von 2 g/L verdünnt und mit dem Ultraschallgerät Ultraschallprozessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Deutschland) im Recycle-Modus mit folgenden Parametern und Bedingungen: Mediendurchfluss 50 mL/s, Frequenz 20 kHz, Leistung 2000 W, Sonotrode Typ BS2d22, Booster Typ B2-1.4 und Amplitude 100%. Die Temperatur der Kulturbrühe betrug zu Beginn der Beschallung 25°C. Die beschallte Kulturbrühe (spezifischer Energieeintrag 100 Ws/mL) wurde durch Seitz HS800 Tiefenfilter unter 1,5 bar Druck bei 40°C filtriert. Das ultraschallbehandelte Schizophyllan (uSPG) für die chemische Charakterisierung wurde aus dem Filtrat mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol bei Labortemperatur ausgefällt und 12 Stunden lang bei 60°C getrocknet. uSPG-Lösungen für immunologische Untersuchungen wurden wie folgt hergestellt: (1) Das mit Ultraschall behandelte Kulturbrühefiltrat wurde durch eine 0,1 m2 große Pall Centramate T-Serie PES-Kassette (100 kDa cut-off) bei 0,8 bar diafiltriert und die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit des Retentats 20 μS/cm betrug; (2) die Lösung wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L konzentriert und durch Autoklavieren bei 120°C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, außer dass dem Kulturbrühefiltrat NaOH in einer Konzentration von 0,2 M zugesetzt wurde und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration 30 Minuten lang bei Labortemperatur inkubiert wurde.
Analytische Methoden
Die Myzelausbeute wurde gravimetrisch bestimmt: Die Kulturbrühe wurde 1:4 mit Wasser verdünnt, 20 Minuten lang bei 25°C mit 10000 × g zentrifugiert, das Präzipitat wurde mit der dreifachen Menge Wasser gewaschen, bei 60°C getrocknet und gewogen. Schizophyllan wurde aus dem Überstand mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol ausgefällt, bei 60°C für 24 Stunden getrocknet und die Ausbeute gravimetrisch bestimmt. pO2 in der Kulturbrühe wurde mit der optischen Sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz) gemessen.
Die dynamische Viskosität der Kulturbrühe wurde auf dem HAAKE Visco Tester 6L mit Spindeln 1L und 2L bei 4°C und einer Rotationsgeschwindigkeit von 30 U/min gemessen. Die Filtrationsgeschwindigkeit wurde aus der Filtrationszeit von 500 mL Kulturbrühe durch einen 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) Tiefenfilter bei 1,5 bar Druck und 40°C berechnet.
Das uSPG-Molekulargewicht wurde mittels SEC-MALLS auf dem HPLC-System Alliance (Waters) mit in Reihe geschalteten PL aquagel OH60- und PL aquagel OH40-Säulen gemessen, und der Detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L konzentriert und durch Autoklavieren bei 120°C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, mit dem Unterschied, dass NaOH in einer Konzentration von 0,2 M zum Filtrat der Kulturbrühe hinzugefügt und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration 30 Minuten lang bei Labortemperatur inkubiert wurde.

UIP2000hdT zur Verringerung des Molekulargewichts von Schizophyllan

Ultraschallhomogenisator UP400St (400W, 24kHz) für die Verarbeitung von Schizophyllan
Die Ultraschallbehandlung wurde direkt auf die 144-h-Kulturbrühe von S. commune mit Myzel angewandt, um die nachfolgende Verarbeitung von SPG zu erleichtern.
Merkmale von sonifiziertem Schizophyllan: Ultraschallbehandeltes Schizophyllan (uSPG) wurde mit Alkohol aus dem Filtrat der Kulturbrühe ausgefällt und charakterisiert. SEC-MALLS schätzte das Mw von uSPG auf etwa 1 MDa. Das durchschnittliche Molekulargewicht von Schizophyllan aus der Flüssigfermentation beträgt etwa 5 MDa, während es bei der Kultivierung im festen Zustand bis zu 10 MDa erreichen kann. Vergleicht man das Molekulargewicht von ultraschallbehandeltem Schizophyllan mit dem Molekulargewicht von nativem, unbehandeltem Schizophyllan, so lässt sich eine 5- bis 10-fache Verringerung des Molekulargewichts infolge der Ultraschallbehandlung feststellen.
Das beschallte Polysaccharid uSPG enthielt 0,7 % (Gewicht/Gewicht) Protein und 1,0 % (Gewicht/Gewicht) Rückstand nach der Entzündung. Das uSPG-Hydrolysat bestand zu mehr als 99 % aus Glucose. Die Analyseergebnisse deuten darauf hin, dass die Beschallung das β-Glucan-Grundgerüst willkürlich spaltet und die Seitenäste intakt bleiben, wodurch sich Größe und Molekulargewicht des Schizophyllans verringern. Immunologische Untersuchungen an im Wesentlichen protein- und endotoxinfreiem uSPG zeigten, dass ultraschallbehandeltes Low-Mw-Schizophyllan eine ausgeprägte immunmodulatorische Aktivität aufweist.

AFM-Abbildung (oben) und topografisches Profil (unten) von nativem ultraschallbehandeltem Schizophyllan. Messung im Semikontaktmodus mit einer Auflösung von 512 × 512 pxs2. Bedingungen: Goldbeschichtung, Federkonstante 15,3 N/m, Spitzenkonuswinkel <22°.r />(picture and study: ©Smirnou et al., 2017)
Reduzierte Viskosität: Die Ultraschallbehandlung führte zu einer deutlichen Abnahme der Viskosität der Kulturbrühe. Während der Ultraschallbehandlung änderte sich die Viskosität der Kulturbrühe nichtlinear: Zu Beginn der Ultraschallbehandlung nahm die Viskosität schnell ab, später verlangsamte sie sich jedoch. Eine spezifische Energiezufuhr von 100 Ws/ml reichte aus, um die Viskosität der Kulturbrühe fast um das 7-fache zu verringern.

Ultraschallbehandlung von S.commune-Kulturbrühe, die durch Pilzkultivierung im Bioreaktor für 144 Stunden gewonnen wurde. Auswirkung der Dauer der Ultraschallbehandlung (ausgedrückt als spezifische Energiezufuhr in Ws/ml) auf die Geschwindigkeit der Tiefenfiltration der Kulturbrühe (schwarze Säule) und die Schizophyllan-Konzentration (SPG) im Filtrat (graue Säule). Bedingungen der Ultraschallbehandlung: Ultraschallprozessor UIP2000hd (20 kHz, 2000W)Sonotrode BS2d22, Booster B2-1.4, Amplitude 100%, Durchflussrate 50 mL/s.
(Bild und Studie: ©Smirnou et al., 2017)
Verbesserte Filtration: Die ultraschallbehandelte Kulturbrühe floss schneller durch den Filter als die unbehandelte Kulturbrühe (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/ml) mit hochmolekularem SPG. Außerdem verringerte die Ultraschallbehandlung den Produktverlust während der Filtration erheblich. Das Filtrat der unbehandelten Kulturbrühe mit hochmolekularem SPG (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/mL) enthielt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, während die SPG-Konzentration vor der Tiefenfiltration 2 g/L betrug. Im Gegensatz dazu enthielt das Filtrat einer mit 100 Ws/mL ultraschallbehandelten Kultur SPG in einer Konzentration von 2,2 ± 0,2 g/L, was einem Produktverlust von nahezu Null entspricht.

Ultraschallbehandlung von S.commune-Kulturbrühe, die durch Pilzkultivierung im Bioreaktor für 144 Stunden gewonnen wurde. Auswirkung der Dauer der Ultraschallbehandlung (ausgedrückt als spezifische Energiezufuhr in Ws/ml) auf die Geschwindigkeit der Tiefenfiltration der Kulturbrühe (schwarze Säule) und die Schizophyllan-Konzentration (SPG) im Filtrat (graue Säule). Bedingungen der Ultraschallbehandlung: Ultraschallprozessor UIP2000hd (20 kHz, 2000W)Sonotrode BS2d22, Booster B2-1.4, Amplitude 100%, Durchflussrate 50 mL/s.
(Bild und Studie: ©Smirnou et al., 2017)

AFM-Abbildung (oben) und topografisches Profil (unten) von denaturiertem, mit Ultraschall behandeltem Schizophyllan. Messung im Semikontaktmodus mit einer Auflösung von 512 × 512 pxs2. Bedingungen: Goldbeschichtung, Federkonstante 15,3 N/m, Spitzenkonuswinkel < 22°.
(Bild und Studie: ©Smirnou et al., 2017)
Außerdem stellten die Forscher fest, dass die Ultraschallverarbeitung von Schizophyllan leicht skalierbar ist. Ein Gerät der Pilotanlage, der Ultraschall-Desintegrator UIP2000hdT, verarbeitete 1 Liter Kulturbrühe in 110 Sekunden im Durchflussmodus. Die Produktivität des Systems lässt sich durch den Anschluss zusätzlicher Ultraschalleinheiten leicht steigern.
Lesen Sie mehr über das einfache Scale-up der Pilzextraktion!
Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die Verarbeitung von Glucan aus Pilzen
Die Fragmentierung von Polysacchariden wie Glucanen sowie anderen bioaktiven Verbindungen wie Chitin und Chitosan kann mit Hielscher Hochleistungs-Ultraschallgeräten zuverlässig durchgeführt werden. Unsere Ultraschallgeräte können hohe Amplituden liefern, bieten eine präzise Steuerbarkeit der Prozessparameter und können rund um die Uhr unter hoher Belastung und in anspruchsvollen Umgebungen betrieben werden. Die Geräte von Hielscher Ultrasonics erfüllen diese Anforderungen zuverlässig. Neben der herausragenden Ultraschallleistung zeichnen sich die Hielscher Ultraschallgeräte durch eine hohe Energieeffizienz aus, was einen wesentlichen wirtschaftlichen Vorteil darstellt – insbesondere wenn sie in der kommerziellen Großproduktion eingesetzt werden.
Hielscher-Ultraschallgeräte sind Hochleistungssysteme, die mit Zubehör wie Sonotroden, Boostern, Reaktoren oder Durchflusszellen ausgestattet werden können, um Ihre Prozessanforderungen optimal zu erfüllen.Mit digitalem Farbdisplay, der Möglichkeit zur Voreinstellung von Beschallungsläufen, automatischer Datenaufzeichnung auf einer integrierten SD-Karte, Browser-Fernsteuerung und vielen weiteren Features sind höchste Prozesskontrolle und Benutzerfreundlichkeit gewährleistet. Gepaart mit Robustheit und hoher Belastbarkeit sind Hielscher-Ultraschallsysteme Ihr zuverlässiges Arbeitspferd in der Produktion.Die Reduktion des Molekulargewichts von β-Glucanen wie Schizophyllan erfordert leistungsstarken Ultraschall, um eine gezielte Spaltung und ein hochwertiges Schizophyllan-Endprodukt zu erhalten, das für pharmazeutische Anwendungen genutzt werden kann.
Weitere Informationen über die Extraktion von Beta-Glucan aus Pilzen mit Ultraschall und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung finden Sie hier!
In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallhomogenisatoren:
Batch-Volumen | Durchfluss | Empfohlenes Ultraschallgerät |
---|---|---|
1 bis 500ml | 10 bis 200ml/min | UP100H |
10 bis 2000ml | 20 bis 400ml/min | UP200Ht, UP400St |
0.1 bis 20l | 0,2 bis 4l/min | UIP2000hdT |
10 bis 100l | 2 bis 10l/min | UIP4000hdT |
n.a. | 10 bis 100l/min | UIP16000 |
n.a. | größere | Cluster aus UIP16000 |
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Literatur / Literaturhinweise
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
Wissenswertes
Schizophyllan – A β-Glucan aus Pilzen
Schizophyllan, auch bekannt als Sizofiran, SPG, Sonifilan, Sizofilan, ist ein neutrales extrazelluläres Polysaccharid, das von dem Pilz Schizophyllum commune Fries, einer Art der Basidiomyceten, produziert wird. Schizophyllan ist ein lösliches Beta-D-Glucan, dessen genauer Wirkmechanismus noch nicht vollständig geklärt ist, aber dieses spezifische β-Glucan zeigt immunmodulatorische und antitumorale Wirkungen. Obwohl der genaue Wirkmechanismus von Sizofiran noch nicht vollständig geklärt ist, scheint dieser Wirkstoff das Immunsystem zu stimulieren, indem er die Zytokinproduktion erhöht, Makrophagen und Langerhans-Zellen aktiviert und die Aktivität polymorphkerniger Leukozyten (PML) und natürlicher Killerzellen (NK) steigert. Sizofiran erwies sich als eher unwirksam gegen Magenkrebs, verlängerte aber die Überlebenszeit bei Patienten mit Kopf- und Halskrebs. Bei Gebärmutterhalskrebs verlängerte Sizofiran die Überlebenszeit und die Zeit bis zum Wiederauftreten bei Fällen im Stadium II, nicht aber im Stadium III, und zeigte zusätzliche Wirksamkeit, wenn es direkt in die Tumormasse injiziert wurde. Sonifilan wird in Japan als biologischer Response Modifier (BRM) zusammen mit einer Strahlentherapie zur Krebsbehandlung eingesetzt. In Südkorea wurde es 1998 für Gebärmutterhalskrebs eingeführt.

Hielscher Ultrasonics fertigt Hochleistungs-Ultraschall-Homogenisatoren vom Labor bis zum voll-kommerziellen Industriemaßstab.