Herstellung von reinen Schizophyllan-Beta-Glucanen mit Ultraschall

Schizophyallan ist ein Pilz β-Glucan mit immunmodulierenden Eigenschaften. Für hochaktive medizinische Wirkungen muss Schizophyllan ein niedriges Molekulargewicht haben, um eine verbesserte Bioverfügbarkeit zu zeigen. Es wurde nachgewiesen, dass Ultraschall das Molekulargewicht von Schizophyllan reduziert. Als zuverlässige und effektive Methode kann die Beschallung leicht zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan eingesetzt werden.

Schizophyllum-Pilze und Ultraschall-Beta-Glucan-Extraktion

Arten des Schizophyllum-Pilzes wachsen in der Natur auf verrottenden Bäumen nach der Regenzeit. Die Fruchtkörper werden in der folgenden Trockenzeit geerntet. Schizophyllum-Arten sind reich an biochemischen Verbindungen wie Glucanen und werden daher vor allem in tropischen Ländern als Nahrung und Medizin konsumiert. Aufgrund seiner immunmodulatorischen, antimykotischen, antineoplastischen und antiviralen Eigenschaften hat Schizophyllum commune, auch bekannt als Spaltkiemenpilz, Biotech- und Pharmaunternehmen angezogen.
Das Polysaccharid Schizophyllan, auch bekannt als Sizofiran, Sonifilan oder Sizofilan, ist das wichtigste β-Glucan, das in Schizophyllum-Pilzen vorkommt, die das hochwirksame bioaktive β-Glucan Schizophyllan bieten.
Schizophyllum commune Pilze wachsen in der Natur auf Bäumen, das Mycellium kann auch in Fermentationsbrühe kultiviert werden. Für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen ist niedermolekulares Schizophyllan weitaus wirksamer als hochmolekulares Schizophyllan. Dies liegt daran, dass Schizophyllan mit niedrigem Molekulargewicht eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und Absorptionsraten aufweist. Darüber hinaus ist Schizophyllan mit hohem Molekulargewicht in Anwendungen oft problematisch, da es zu einer hohen Viskosität seiner wässrigen Lösungen führt.
Die Ultraschall-Zerkleinerungsreduktion ist eine hochwirksame und zuverlässige Technik, um das Molekulargewicht von Schizophyllan zu senken und dadurch die Qualität des β-Glucan-Moleküls zu erhöhen.

Protokoll zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan

Da Schizophyllan mit Molekulargewicht eine drastisch bessere Bioverfügbarkeit und Anwendungseigenschaften aufweist, untersuchte das Forschungsteam von Smirnou die Ultraschalluntersuchung zur Spaltung und Größenreduktion des β-Glucan-Moleküls Schizophyllan.

Ultraschall von Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan-Schizophyllan (SPG) wurde durch submerse Kultivierung des Pilzes S. commune in einem Bioreaktor unter Verwendung von Saccharose als Substrat hergestellt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe mit demineralisiertem Wasser auf eine Schizophyllankonzentration von 2 g/L verdünnt und mit dem Ultraschallprozessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Deutschland) im Recycle-Modus bei folgenden Parametern und Bedingungen: Mediumdurchfluss 50 mL/s, Frequenz 20 kHz, Leistung 2000 W, Sonotrode Typ BS2d22, Booster Typ B2-1,4 und Amplitude 100%. Die Temperatur der Kulturbrühe zu Beginn der Beschallung betrug 25 °C. Die mit Ultraschall beschallte Kulturbouillon (spezifischer Energieeintrag 100 Ws/mL) wurde unter 1,5 bar Druck bei 40°C durch Seitz HS800 Tiefenfilter filtriert. Das ultraschallisierte Schizophyllan (uSPG) zur chemischen Charakterisierung wurde aus dem Filtrat mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol bei Labortemperatur ausgefällt und bei 60 °C für 12 Stunden getrocknet. uSPG-Lösungen für immunologische Studien wurden wie folgt hergestellt: (1) Das mit Ultraschall beschallte Kulturbouillon wurde durch eine 0,1 m2 Pall Centramate T-Serie PES-Kassette (100 kDa Cut-off) bei 0,8 bar diafiltriert und die Diafiltration fortgesetzt, bis die Retentatleitfähigkeit 20 μS/cm betrug; (2) Die Lösung wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/l konzentriert und durch Autoklavieren bei 120 °C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass NaOH dem Filtrat der Kulturbrühe in einer Konzentration von 0,2 M zugesetzt wurde und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration 30 Minuten lang bei Labortemperatur inkubiert wurde.

Analysemethoden

Die Myzelausbeute wurde gravimetrisch geschätzt: Kulturbrühe wurde 1:4 mit Wasser verdünnt, 10000 × g bei 25°C für 20 min zentrifugiert, der Niederschlag mit der dreifachen Menge Wasser gewaschen, bei 60°C getrocknet und gewogen. Schizophyllan wurde aus dem Überstand mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol ausgefällt, 24 Stunden lang bei 60°C getrocknet und seine Ausbeute gravimetrisch bestimmt. pO2 in der Kulturbouillon wurde mit der optischen Sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz) gemessen.
Die dynamische Viskosität der Kulturbrühe wurde auf dem HAAKE Visco Tester 6L mit den Spindeln 1L und 2L bei 4°C und einer Drehzahl von 30 U/min gemessen. Die Filtrationsgeschwindigkeit wurde aus der Filtrationszeit von 500 mL Kulturbrühe durch 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) Tiefenfilter bei 1,5 bar Druck und 40°C berechnet.
Das uSPG-Molekulargewicht wurde mit Hilfe von SEC-MALLS auf dem HPLC-System Alliance (Waters) mit in Reihe geschalteten PL aquagel OH60 und PL aquagel OH40 Säulen gemessen, und der Detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L konzentriert und durch Autoklavieren bei 120 °C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass NaOH dem Filtrat der Kulturbrühe in einer Konzentration von 0,2 M zugesetzt wurde und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration 30 Minuten lang bei Labortemperatur inkubiert wurde.

Ergebnisse:
Die Ultraschallbehandlung wurde direkt auf die S. commune 144-h-Kulturbouillon mit Myzel aufgetragen, um die Weiterverarbeitung mit SPG zu erleichtern.
 
Eigenschaften von beschalltem Schizophyllan: Ultraschall-Schizophyllan (uSPG) wurde aus Kulturbrühefiltrat durch Alkohol ausgefällt und charakterisiert. SEC-MALLS schätzte die Mw von uSPG auf etwa 1 MDa. Das durchschnittliche Molekulargewicht von Schizophyllan aus flüssiger Fermentation beträgt etwa 5 MDa, während es im Festkörperanbau bis zu 10 MDa erreichen kann. Vergleicht man das Molekulargewicht von ultraschallisiertem Schizophyllan mit den Molekulargewichten von nativem unbehandeltem Schizophyllan, so kann ein 5- bis 10-fach reduziertes Molekulargewicht aufgrund der Ultraschallbehandlung beobachtet werden.
Das beschallte Polysaccharid uSPG enthielt nach der Zündung 0,7 Gew.-% Protein und 1,0 Gew.-% Rückstand. uSPG-Hydrolysat bestand zu mehr als 99 % aus Glukose. Die Analyseergebnisse deuten darauf hin, dass die Beschallung das β-Glucan-Rückgrat zufällig spaltet und die Seitenäste intakt bleiben, wodurch die Größe und das Molekulargewicht von Schizophyllan reduziert werden. Immunologische Untersuchungen an im Wesentlichen protein- und endotoxinfreien uSPG zeigten, dass ultraschalliertes Low-Mw-Schizophyllan eine ausgeprägte immunmodulatorische Aktivität aufweist.

 
Reduzierte Viskosität: Die Ultraschallbehandlung führte zu einer signifikanten Verringerung der Viskosität der Kulturbrühe. Während der Ultraschallbehandlung änderte sich die Viskosität der Kulturbrühe nichtlinear: Die Viskositätsabnahme war zu Beginn der Ultraschallbehandlung schnell, verlangsamte sich jedoch später. Der spezifische Energieeintrag von 100 Ws/mL reichte aus, um die Viskosität der Kulturbrühe fast um das 7-fache zu reduzieren.

Verbesserte Filtration: Die ultraschallbehandelte Kulturbouillon durchströmte den Filter schneller als die unbehandelte Kulturbouillon (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/mL) mit hochmolekularem SPG. Außerdem wurde der Produktverlust während der Filtration durch Ultraschall deutlich reduziert. Das Filtrat der unbehandelten Kulturbouillon mit hochmolekularem SPG (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/ml) enthielt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, während die SPG-Konzentration vor der Tiefenfiltration 2 g/L betrug. Im Gegensatz dazu enthielten beide Filtrate von 100 Ws/ml, die mit Ultraschall beschallt wurden, SPG in einer Konzentration von 2,2 ± 0,2 g/L, was einem nahezu Nullproduktverlust entspricht.

Schlussfolgerung: In ihrer Schlussfolgerung fasst das Forschungsteam zusammen, dass die Ultraschallverarbeitung eine effiziente Technologie zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan ist, das dann in Kosmetika und Medizin eingesetzt werden kann. Ultraschall, wenn er auf vollständige Kulturbrühe mit Myzel angewendet wird, bringt bestimmte Vorteile für die Schizophyllanproduktion. Es reduziert Produktverluste bei der Weiterverarbeitung und ermöglicht die Herstellung von hochreinen Polysacchariden durch den effizienten Einsatz von Ultrafiltration.
Darüber hinaus fanden die Forscher heraus, dass die Ultraschallverarbeitung von Schizophyllan leicht skalierbar ist. Eine Einheit des Ultraschall-Desintegrators UIP2000hdT der Pilotanlage verarbeitete 1 Liter Kulturbrühe in 110 s im Durchflussmodus. Die Produktivität des Systems kann durch den sequentiellen Anschluss zusätzlicher Ultraschallgeräte leicht gesteigert werden.

 
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Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die Verarbeitung von Pilzglucanen

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In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallhomogenisatoren: