Ultraschallgestützte Herstellung hochgereinigter Schizophyllan-Beta-Glucane

Schizophyllan ist ein β-Glucan aus Pilzen mit immunmodulierenden Eigenschaften. Für eine hohe medizinische Wirksamkeit muss Schizophyllan ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, um eine verbesserte Bioverfügbarkeit zu erzielen. Die Ultraschallbehandlung reduziert nachweislich das Molekulargewicht von Schizophyllan. Als zuverlässige und wirksame Methode lässt sich die Beschallung einfach zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan einsetzen.

Schizophyllum-Pilze und ultraschallgestützte Beta-Glucan-Extraktion

Arten der Pilzgattung Schizophyllum wachsen in der Natur nach Regenzeiten auf verrottenden Bäumen. Die Fruchtkörper werden in der darauffolgenden Trockenzeit gesammelt. Schizophyllum-Arten sind reich an biochemischen Verbindungen wie Glucanen und werden daher besonders in tropischen Ländern als Nahrungs- und Heilmittel verwendet. Aufgrund seiner immunmodulierenden, antimykotischen, antineoplastischen und antiviralen Eigenschaften hat Schizophyllum commune, auch als Gemeiner Spaltblättling bekannt, das Interesse von Biotechnologie- und Pharmaunternehmen geweckt.
Das Polysaccharid Schizophyllan, auch bekannt als Sizofiran, Sonifilan oder Sizofilan, ist das wichtigste β-Glucan in Schizophyllum-Pilzen, die dieses hochwirksame bioaktive β-Glucan liefern.
Schizophyllum commune wächst in der Natur auf Bäumen; das Myzel kann auch in Fermentationsbrühe kultiviert werden. Für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen ist niedermolekulares Schizophyllan wesentlich wirksamer als hochmolekulares Schizophyllan. Dies liegt daran, dass niedermolekulares Schizophyllan eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und höhere Resorptionsraten aufweist. Darüber hinaus ist hochmolekulares Schizophyllan in der Anwendung häufig problematisch, da seine wässrigen Lösungen eine hohe Viskosität aufweisen.
Die Molekülverkleinerung mittels Ultraschall ist eine hochwirksame und zuverlässige Technik zur Senkung des Molekulargewichts von Schizophyllan und verbessert dadurch die Qualität des β-Glucan-Moleküls.

Protokoll zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan

Da Schizophyllan mit Molekulargewicht eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit und bessere Anwendungseigenschaften aufweist, untersuchte das Forschungsteam von Smirnou die Ultraschallbehandlung zur Spaltung und Verkleinerung des β-Glucan-Moleküls Schizophyllan.

Ultraschallbehandlung von Schizophyllan

Das β-1.3(1.6)-Glucan Schizophyllan (SPG) wurde durch Submerskultivierung des Pilzes S. commune in einem Bioreaktor mit Saccharose als Substrat hergestellt.
Nach Abschluss der Kultivierung wurde die Kulturbrühe mit demineralisiertem Wasser auf eine Schizophyllan-Konzentration von 2 g/L verdünnt und mit dem Ultraschallprozessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Deutschland) im Kreislaufbetrieb unter folgenden Parametern und Bedingungen beschallt: Volumenstrom des Mediums 50 mL/s, Frequenz 20 kHz, Ausgangsleistung 2000 W, Sonotrodentyp BS2d22, Boostertyp B2-1.4 und Amplitude 100%. Die Temperatur der Kulturbrühe betrug zu Beginn der Beschallung 25°C. Die ultraschallbehandelte Kulturbrühe (spezifischer Energieeintrag 100 Ws/mL) wurde bei einem Druck von 1,5 bar und 40°C durch einen Seitz HS800-Tiefenfilter filtriert. Das ultraschallbehandelte Schizophyllan (uSPG) für die chemische Charakterisierung wurde bei Labortemperatur mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol aus dem Filtrat ausgefällt und bei 60°C für 12h getrocknet. uSPG-Lösungen für immunologische Untersuchungen wurden wie folgt hergestellt: (1) Das Filtrat der ultraschallbehandelten Kulturbrühe wurde bei 0,8 bar durch eine 0,1m2 große PES-Kassette der Pall Centramate T-Serie (Trenngrenze 100 kDa) diafiltriert. Die Diafiltration wurde fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit des Retentats 20 μS/cm betrug; (2) die Lösung wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L aufkonzentriert und durch Autoklavieren bei 120°C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, wobei dem Kulturbrühefiltrat jedoch NaOH in einer Konzentration von 0,2 M zugesetzt und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration für 30 min bei Labortemperatur inkubiert wurde.

Analytische Methoden

Die Myzelausbeute wurde gravimetrisch ermittelt: Die Kulturbrühe wurde im Verhältnis 1:4 mit Wasser verdünnt und bei 10.000 × g und 25°C für 20 min zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit der dreifachen Menge Wasser gewaschen, bei 60°C getrocknet und gewogen. Schizophyllan wurde mit der dreifachen Menge Isopropylalkohol aus dem Überstand ausgefällt, bei 60°C für 24h getrocknet und seine Ausbeute gravimetrisch bestimmt. Der pO2 in der Kulturbrühe wurde mit der optischen Sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz) gemessen.
Die dynamische Viskosität der Kulturbrühe wurde mit einem HAAKE Visco Tester 6L mit den Spindeln 1L und 2L bei 4°C und einer Drehzahl von 30 rpm gemessen. Die Filtrationsgeschwindigkeit wurde aus der Filtrationszeit von 500 mL Kulturbrühe durch einen 200 × 200 mm großen Seitz HS800-Tiefenfilter (Pall, USA) bei einem Druck von 1,5 bar und 40°C berechnet.
Das Molekulargewicht von uSPG wurde mittels SEC-MALLS an einem HPLC-System Alliance (Waters) mit in Reihe geschalteten Säulen PL aquagel OH60 und PL aquagel OH40 gemessen, und der Detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) wurde durch Diafiltration auf eine uSPG-Konzentration von 1 g/L aufkonzentriert und durch Autoklavieren bei 120°C/20 min sterilisiert. Denaturiertes uSPG wurde auf ähnliche Weise hergestellt, wobei dem Kulturbrühefiltrat jedoch NaOH in einer Konzentration von 0,2 M zugesetzt und die alkalisierte Lösung vor der Diafiltration für 30 min bei Labortemperatur inkubiert wurde.

Ergebnisse:
Die Ultraschallbehandlung wurde direkt auf die myzelhaltige Kulturbrühe von S. commune nach 144 h Kultivierung angewendet, um die nachgelagerte Aufarbeitung von SPG zu erleichtern.
 
Eigenschaften von beschalltem Schizophyllan: Ultraschallbehandeltes Schizophyllan (uSPG) wurde mit Alkohol aus dem Kulturbrühefiltrat ausgefällt und charakterisiert. Mittels SEC-MALLS wurde das Mw von uSPG auf etwa 1 MDa geschätzt. Das durchschnittliche Molekulargewicht von Schizophyllan aus Flüssigfermentation beträgt ungefähr 5 MDa, während es bei der Feststoffkultivierung bis zu 10 MDa erreichen kann. Beim Vergleich des Molekulargewichts von ultraschallbehandeltem Schizophyllan mit den Molekulargewichten von nativem, unbehandeltem Schizophyllan lässt sich eine durch Ultraschall bewirkte Reduktion um den Faktor 5 bis 10 feststellen.
Das beschallte Polysaccharid uSPG enthielt 0,7%w/w Protein und 1,0%w/w Glührückstand. Das uSPG-Hydrolysat bestand zu mehr als 99% aus Glucose. Die analytischen Ergebnisse zeigen, dass die Beschallung die Hauptkette des β-Glucans an zufälligen Stellen spaltet, während die Seitenketten intakt bleiben, wodurch Größe und Molekulargewicht von Schizophyllan reduziert werden. Immunologische Untersuchungen an weitgehend protein- und endotoxinfreiem uSPG zeigten, dass ultraschallbehandeltes Schizophyllan mit niedrigem Mw eine ausgeprägte immunmodulatorische Aktivität aufweist.

 
Reduzierte Viskosität: Die Ultraschallbehandlung führte zu einer deutlichen Abnahme der Viskosität der Kulturbrühe. Während der Ultraschallbehandlung änderte sich die Viskosität der Kulturbrühe nichtlinear: Zu Beginn der Beschallung nahm sie rasch ab, später verlangsamte sich die Abnahme. Ein spezifischer Energieeintrag von 100 Ws/mL reichte aus, um die Viskosität der Kulturbrühe um nahezu den Faktor 7 zu reduzieren.

Verbesserte Filtration: Die ultraschallbehandelte Kulturbrühe floss schneller durch den Filter als die unbehandelte Kulturbrühe (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/mL) mit hochmolekularem SPG. Zudem reduzierte die Ultraschallbehandlung den Produktverlust während der Filtration erheblich. Das Filtrat der unbehandelten Kulturbrühe mit hochmolekularem SPG (spezifischer Energieeintrag 0 Ws/mL) enthielt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, während die SPG-Konzentration vor der Tiefenfiltration 2 g/L betrug. Dagegen enthielt das Filtrat der mit 100 Ws/mL ultraschallbehandelten Kulturbrühe SPG in einer Konzentration von 2,2 ± 0,2 g/L, was einem nahezu vollständigen Ausbleiben von Produktverlust entspricht.

Schlussfolgerung: Das Forschungsteam kommt zu dem Schluss, dass die Ultraschallbehandlung eine effiziente Technologie zur Herstellung von niedermolekularem Schizophyllan ist, das anschließend in Kosmetik und Medizin eingesetzt werden kann. Bei Anwendung auf die gesamte Kulturbrühe einschließlich Myzel bietet die Ultraschallbehandlung bestimmte Vorteile für die Schizophyllan-Produktion. Sie reduziert Produktverluste bei der nachgelagerten Aufarbeitung und ermöglicht durch den effizienten Einsatz der Ultrafiltration die Herstellung eines hochgereinigten Polysaccharids.
Darüber hinaus stellten die Forschenden fest, dass sich die Ultraschallbehandlung von Schizophyllan einfach skalieren lässt. Ein Ultraschalldesintegrator UIP2000hdT der Pilotanlage verarbeitete 1 Liter Kulturbrühe in 110 s im Durchflussbetrieb. Die Produktivität des Systems lässt sich durch die Reihenschaltung zusätzlicher Ultraschallgeräte einfach steigern.

 
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