Extraktion von Beta-Glucanen aus Pilzen mittels Ultraschallbehandlung
Materialien und Geräte
- Pilze (z. B. 100g zerkleinerte oder in Scheiben geschnittene Pilze)
- Kaltes destilliertes Wasser (z. B. 500mL)
- Mixer oder Mühle
- Bechergläser oder Glaskolben
- Filterpapier oder eine Vakuumfiltrationsapparatur
- Zentrifuge (optional)
- Alkohol (z. B. Ethanol) zur Fällung
- Kühlschrank
- Trockenschrank
Protokoll zur Beta-Glucan-Extraktion
- Mahlen oder zerquetschen Sie die Pilze (z. B. Chaga oder Igelstachelbart) zu groben Partikeln von etwa 1 bis 3 Millimetern Größe. Verwenden Sie beispielsweise 100g getrocknete Pilzpartikel.
- Geben Sie die Pilzpartikel anschließend in ein Becherglas oder einen Glaskolben.
- Geben Sie als Nächstes 500mL destilliertes Wasser in das Becherglas mit den zu extrahierenden Pilzpartikeln. Das Verhältnis von Wasser zu Pilzen kann je nach Pilzart und Partikelgröße variieren.
- Nachdem Sie die Suspension umgerührt haben, beschallen Sie das Gemisch mit einem Ultraschallhomogenisator für das Labor (z. B. UP400St mit einer 22mm-Sonotrode bei 100% Amplitude oder UP200Ht mit einer 14mm-Sonotrode bei 100% Amplitude) und halten Sie die Temperatur unter 90°C. Niedrigere Temperaturen helfen, wärmeempfindliche Verbindungen wie Beta-Glucane während der Extraktion zu erhalten. Beschallen Sie bei Verwendung des UP400St etwa 5 bis 10 Minuten und bei Verwendung des UP200Ht entsprechend 10 bis … Minuten. Bitte beachten Sie, dass Temperatur und Extraktionszeit je nach eingesetzter Ultraschallleistung variieren können. Größere Volumina erfordern selbstverständlich längere Beschallungszeiten.
- Filtrieren Sie das beschallte Gemisch durch Filterpapier oder verwenden Sie eine Vakuumfiltrationsapparatur, um die Flüssigkeit (mit den extrahierten Beta-Glucanen) vom festen Pilzrückstand zu trennen.
- Fällen Sie anschließend die Beta-Glucane aus der Flüssigkeit durch Zugabe von Alkohol (z. B. Ethanol). Üblicherweise können Sie zur Fällung 2–3 Volumina Alkohol verwenden.
- Lagern Sie das Gemisch danach mehrere Stunden im Kühlschrank, damit die Beta-Glucane ausfallen können.
- Nach der Fällung können Sie die Flüssigkeit vorsichtig dekantieren und den Beta-Glucan-Niederschlag auffangen.
- Trocknen Sie die Beta-Glucane abschließend in einem Trockenschrank bei niedriger Temperatur (z. B. 40–50°C), bis der gesamte Alkohol entfernt ist und Sie ein trockenes Pulver erhalten.
Pilze unterscheiden sich in ihren Eigenschaften. Daher kann der Beta-Glucan-Extraktionsprozess je nach Pilzart, Zustand der Pilze (getrocknet oder frisch), Partikelgröße und Extraktionstemperatur unterschiedlich sein. Um Ihr Extraktionsverfahren zu optimieren, sollten Sie mit verschiedenen Parametern experimentieren: Variieren Sie die Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnisse, passen Sie die Temperaturen an, untersuchen Sie verschiedene Lösungsmittel und testen Sie unterschiedliche Beschallungszeiten und Amplitudeneinstellungen.
Ultraschallunterstützte enzymatische Extraktion von Beta-Glucan
Die ultraschallunterstützte enzymatische Extraktion ist ein Verfahren zur Gewinnung von Beta-Glucanen aus Pilzen durch eine Kombination aus Enzymen und Ultraschallwellen. Dieses Verfahren erhöht die Effizienz der Extraktion, indem es die Zellwände der Pilze aufschließt und die Freisetzung der Beta-Glucane erleichtert.
Maßstabsvergrößerung der Beta-Glucan-Extraktion aus Pilzen
Sobald Sie ein Beta-Glucan-Extraktionsprotokoll etabliert haben, das Ihren Anforderungen entspricht, kann sich die Maßstabsvergrößerung des Extraktionsprozesses unkompliziert gestalten.
Maßstabsvergrößerung der Chargenextraktion
Wenn Sie eine Maßstabsvergrößerung mittels Chargenextraktion planen, empfehlen wir, das Chargenvolumen zu erhöhen und dabei die Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnisse sowie alle anderen Parameter konstant zu halten. Wenn Sie weiterhin denselben Ultraschallhomogenisator verwenden, achten Sie darauf, die Beschallungszeit proportional zu verlängern. Bei Chargen von mehr als 1 Liter sollten Sie den Einsatz eines langsam laufenden Rührers erwägen, um die Partikel in Suspension zu halten und die Gleichmäßigkeit der Extraktion zu verbessern. Die folgende Abbildung zeigt eine Extraktionsapparatur für eine 8-Liter-Charge mit einem Ultraschallhomogenisator UP400St in Kombination mit einem Laborrührer.
Apparatur zur chargenweisen Pilzextraktion mit 8L und dem Ultraschallgerät UP400St
Vakuumfiltration von Beta-Glucan-Extrakt nach der Beschallung
Pilzextraktion im Durchfluss
Für alle, die größere Mengen an Beta-Glucanen kontinuierlich aus Pilzen extrahieren möchten, bietet Hielscher Ultrasonics Durchflusszellenreaktoren an, die für die Extraktion pflanzlichen Materials ausgelegt sind. Wenn dies auf Sie zutrifft, wenden Sie sich für weitere Informationen gerne direkt an uns. Unser technisches Team unterstützt Sie gerne dabei, die für Ihre spezifischen Anforderungen am besten geeignete Anlage zu bestimmen. Die Durchführung des zuvor beschriebenen Versuchs im Labormaßstab mit Ihrer jeweiligen Pilzart kann jedoch äußerst wertvoll sein, um die genauen Prozessanforderungen zu verstehen. Die folgende Abbildung zeigt einen großen Durchflusszellenreaktor mit einem Ultraschallhomogenisator UIP4000hdT zur Extraktion von Beta-Glucanen bei der Verarbeitung von etwa 50 bis 200 Litern Pilz-Lösungsmittel-Suspension pro Stunde.
Empirisch ermittelte Beta-Glucan-Konzentrationen verschiedener Pilzarten
Nachfolgend finden Sie eine Liste empirisch ermittelter Konzentrationen von Beta-Glucanen, die aus verschiedenen Pilzarten extrahiert wurden.
| Pilzarten | 1,3-1,6-β-D-glucan insgesamt (g/100g Trockenmasse) |
|---|---|
| Boletus pinophilus | 9,8% |
| Suillus granulatus | 13,3% |
| Craterellus cornucopioides | 4,5% |
| Suillus variegatus | 13,7% |
| Hydnum repandum | 4,1% |
| Gyroporus cyanescens | 14,3% |
| Tricholomopsis rutilans | 10,2% |
| Agaricus bisporus (portobello) | 4% |
| Agaricus bisporus (cremini) | 4% |
| Auricularia auricular-judae | 16,8% |
Gehalt an 1,3-1,6-β-D-glucan in den untersuchten wildwachsenden und kultivierten Pilzen, Quelle: Mirończuk-Chodakowska et al. (2017): Quantitative Evaluation of 1,3-1,6-Β-D-Glucan Contents in Wild–Growing Species of Edible Polish Mushrooms. Rocz Panstw Zakl Hig 2017;68(3):281-290.
SonoStation: Mobiles schlüsselfertiges System zur Ultraschallverarbeitung – bestehend aus Ultraschalldispergierern, Pumpe, Rührer und Tank
Ultraschallhomogenisator UIP4000hdT zur Verarbeitung von etwa 50 bis 200 Litern Pilz-Lösungsmittel-Suspension pro Stunde
Quantifizierung der Beta-Glucan-Konzentration in Pilzextrakten
Die Beta-Glucan-Konzentration nach der Extraktion kann mit verschiedenen Methoden quantifiziert werden, abhängig von der Art des Beta-Glucans und den spezifischen Anforderungen der Analyse. Gängige Methoden zur Quantifizierung der Beta-Glucan-Konzentration sind nachfolgend aufgeführt. Die Wahl der Methode hängt selbstverständlich von Faktoren wie der erforderlichen Genauigkeit und den verfügbaren Geräten ab.
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Gravimetrische Methode
- Prinzip: Diese Methode beruht auf der Fällung von Beta-Glucanen mit Ethanol und dem anschließenden Trocknen und Wiegen des Niederschlags.
- Durchführung: Die Probe wird in Wasser gelöst und mit Ethanol behandelt, um die Beta-Glucane auszufällen. Anschließend wird der Niederschlag aufgefangen, getrocknet und gewogen.
- Vorteile: Einfach und weit verbreitet.
- Einschränkungen: Weniger präzise als andere Methoden.
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Kolorimetrische Methoden
- Prinzip: Diese Methoden beruhen auf Farbreaktionen mit spezifischen Reagenzien, die eine zur Beta-Glucan-Konzentration proportionale Farbänderung hervorrufen.
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Beispiele:
- Phenol-Schwefelsäure-Methode: Bei dieser Methode wird die Probe mit konzentrierter Schwefelsäure und Phenol behandelt, wodurch sich die Lösung orange färbt. Die Farbintensität ist proportional zur Beta-Glucan-Konzentration.
- Anthron-Methode: Das Anthron-Reagenz reagiert mit Beta-Glucanen und erzeugt eine blaugrüne Färbung, deren Intensität gemessen wird.
- Vorteile: Empfindlich und für Analysen mit hohem Probendurchsatz geeignet.
- Einschränkungen: Interferenzen durch andere Verbindungen und die Notwendigkeit spezifischer Reagenzien.
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Enzymatische Assays
- Prinzip: Enzymatische Assays verwenden Enzyme wie β-Glucanase, um Beta-Glucane in einfachere Zucker abzubauen. Die freigesetzten Zucker werden quantifiziert.
- Vorteile: Hohe Spezifität und Genauigkeit.
- Einschränkungen: Erfordert spezielle Geräte und Reagenzien.
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Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
- Prinzip: Die HPLC trennt und quantifiziert Verbindungen anhand ihrer Wechselwirkungen mit einer chromatographischen Säule.
- Durchführung: Beta-Glucane werden zu Monosacchariden hydrolysiert. Die entstehenden Zucker werden mittels HPLC getrennt und quantifiziert.
- Vorteile: Sehr genau und für komplexe Proben geeignet.
- Einschränkungen: Erfordert spezielle Geräte und Fachkenntnisse.
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Spezifische Immunoassays
- Prinzip: Immunoassays verwenden für Beta-Glucane spezifische Antikörper, um deren Konzentration zu quantifizieren.
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Beispiele:
- ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Bei dieser Methode erzeugt ein enzymgekoppelter Antikörper eine Farbänderung, wenn er an Beta-Glucane bindet.
- Lateral-Flow-Assays: Dies sind Schnelltests, die ein sichtbares Ergebnis auf einem Teststreifen liefern.
- Vorteile: Hohe Spezifität und Empfindlichkeit.
- Einschränkungen: Erfordert spezifische Antikörper und kann höhere Kosten verursachen.