HPLC-Analysen durch zuverlässige Probenvorbereitung verbessern
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist nach wie vor eines der wichtigsten Analyseverfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Verbindungen in komplexen Matrizes. Von der pharmazeutischen Qualitätskontrolle über die Umweltüberwachung bis hin zur Lebensmittelanalytik werden HPLC-Verfahren wegen ihrer Empfindlichkeit, Selektivität und Reproduzierbarkeit geschätzt. Die Zuverlässigkeit chromatographischer Daten hängt jedoch maßgeblich von einem entscheidenden Schritt ab: der HPLC-Probenvorbereitung.
Forschung und routinemäßige Probenvorbereitung zeigen, dass ultraschallgestützte Extraktion und Probenvorbereitung die Effizienz, Genauigkeit und Geschwindigkeit von HPLC-Analysen erheblich verbessern. Durch den Einsatz von Ultraschallenergie zum Aufschluss von Matrizes und zur Verbesserung des Analyttransfers in Lösungsmittel können Labore höhere Wiederfindungsraten, kürzere Extraktionszeiten und besser reproduzierbare Analyseergebnisse erzielen.
Warum die Probenvorbereitung bei der HPLC wichtig ist
In vielen analytischen Arbeitsabläufen enthält die Probenmatrix – beispielsweise Pflanzenmaterial, biologisches Gewebe, Boden oder Wasser – komplexe Gemische von Verbindungen, die die chromatographische Trennung beeinträchtigen können. Eine effiziente Probenvorbereitung ist daher erforderlich, um Analyten zu isolieren, störende Substanzen zu entfernen und die Zielverbindungen vor der Injektion in das HPLC-System anzureichern.
Herkömmliche Extraktionsverfahren umfassen häufig langwierige Abläufe, große Mengen organischer Lösungsmittel und mehrere Reinigungsschritte. Diese Verfahren können Schwankungen verursachen, die Betriebskosten erhöhen und die gesamte Analysedauer verlängern.
Die Ultraschall-Probenvorbereitung bietet eine wirksame Alternative. Bei der Beschallung wird hochfrequente akustische Energie in ein flüssiges Medium eingetragen, wodurch mikroskopisch kleine Kavitationsblasen entstehen. Wenn diese Blasen kollabieren, erzeugen sie lokale Scherkräfte und Durchmischungseffekte auf mikroskopischer Ebene, die feste Matrizes aufschließen und den Stofftransport beschleunigen. Dieser Prozess steigert die Extraktionseffizienz erheblich.
UIP400MTP Ultraschallgerät für hohen Probendurchsatz mit Röhrchengestell für Autosampler-Vials
Wissenschaftliche Belege: Beschallung verbessert die analytische Leistungsfähigkeit
Mehrere begutachtete Studien haben die Vorteile der Ultraschallextraktion in HPLC-Arbeitsabläufen nachgewiesen.
Beispielsweise wurde in einem Verfahren zur Überwachung von Pestizidrückständen in Wasserproben die Beschallung mit einer LC–MS/MS-Analyse kombiniert, um die Konzentrationen des Pestizids Carbaryl zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wurden Wasserproben vor der chromatographischen Analyse unter Ultraschallbehandlung mit Acetonitril extrahiert. Das Verfahren erreichte eine hohe analytische Leistungsfähigkeit, einschließlich Wiederfindungsraten zwischen 89,53% und 101,72%, und bestätigte damit die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ultraschall-Probenvorbereitung.
Der Ultraschallextraktionsschritt ermöglichte einen effizienten Transfer der Analyten aus der wässrigen Matrix in das organische Lösungsmittel, wodurch der Lösungsmittelverbrauch gesenkt wurde und auf umfangreiche Reinigungsschritte verzichtet werden konnte. Das validierte Analyseverfahren zeigte hervorragende Ergebnisse hinsichtlich Linearität, Präzision und Bestimmungsgrenzen und verdeutlichte damit die Wirksamkeit der Beschallung in modernen chromatographischen Arbeitsabläufen. (vgl. Roudani et al., 2018)
Eine weitere Studie stellte die ultraschallgestützte Matrix-Festphasendispersion (UA-MSPD) zur Bestimmung von Oleuropein in Olivenblättern mittels HPLC-Analyse vor. Bei diesem Verfahren wurden Pflanzenpulver und Sorbensmaterial gemischt und anschließend während des Elutionsschritts Ultraschallwellen ausgesetzt. Der Ultraschall verstärkte die Desorption der Analyten von der Sorbensoberfläche und verbesserte gleichzeitig die Extraktion aus der Probenmatrix. (vgl. Rashidipour und Heydari, 2018)
Das optimierte Ultraschallverfahren führte zu erheblichen analytischen Verbesserungen, darunter:
- Lineare Kalibrierkurven mit R² = 0,9979
- Nachweisgrenzen von nur 0,03 µg mL⁻¹
- Wiederfindungsraten zwischen 90,2% und 96,7%
Diese Ergebnisse bestätigen, dass die ultraschallgestützte Extraktion nicht nur die Probenvorbereitung beschleunigt, sondern auch die Extraktionsausbeute gegenüber klassischen Verfahren der Matrix-Festphasendispersion erhöht.
Sonotroden-Ultraschallgerät UP200St für die HPLC-Probenvorbereitung
Wesentliche Vorteile der Ultraschall-Probenvorbereitung für die HPLC
Der zunehmende Einsatz der Ultraschallextraktion in analytischen Laboren beruht auf mehreren messbaren Vorteilen.
- Höhere Extraktionseffizienz
Akustische Kavitation schließt feste Matrizes auf und verbessert das Eindringen des Lösungsmittels. Dies fördert die Freisetzung der Analyten und erhöht die Wiederfindungsraten, insbesondere bei Verbindungen im Spurenbereich in komplexen Proben. - Kürzere Probenvorbereitungszeit
Mit der Ultraschallextraktion lässt sich die Probenvorbereitung häufig innerhalb von Sekunden oder Minuten abschließen. Beispielsweise wurde mit optimierten Ultraschallextraktionsparametern bei der UA-MSPD nach etwa 30 Sekunden Beschallung eine effiziente Analytwiederfindung erreicht. Dies zeigt, wie stark sich analytische Arbeitsabläufe beschleunigen lassen. - Geringerer Lösungsmittelverbrauch
Da Ultraschall den Stofftransport verbessert, sind in der Regel kleinere Lösungsmittelvolumina erforderlich. Ein geringerer Lösungsmittelverbrauch verbessert die Nachhaltigkeit im Labor und senkt die Betriebskosten. - Verbesserte Reproduzierbarkeit
Eine gleichmäßige Verteilung der Ultraschallenergie gewährleistet einen einheitlichen Probenaufschluss und eine einheitliche Extraktion bei Wiederholungsproben, was zu einer höheren Präzision analytischer Messungen führt. - Kompatibilität mit modernen chromatographischen Verfahren
Die Ultraschallextraktion lässt sich problemlos mit HPLC-, UHPLC- und LC-MS-Systemen kombinieren und eignet sich daher für analytische Anwendungen mit hohem Probendurchsatz.
HPLC-Chromatogramm phenolischer Verbindungen aus einem mittels Ultraschallgerät UP400S durch Ultraschallextraktion gewonnenen Extrakt aus Blättern von Annona muricata.
(Studie und Grafik: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktische Ultraschalllösungen für die HPLC-Probenvorbereitung
Für Labore, die Ultraschallextraktion einsetzen, bieten Hielscher Ultraschallgeräte eine präzise Kontrolle von Parametern wie Amplitude, Dauer und Pulsmodus. Daher eignen sich Hielscher Labor-Ultraschallgeräte besonders für analytische Labore.
Wählen Sie das am besten geeignete Labor-Ultraschallgerät für Ihre HPLC-Proben
| Ultraschallgerätemodell | Vorteile für die HPLC | Optimale Einsatzbereiche in der HPLC-Probenvorbereitung |
| VialTweeter Ultraschallgerät für mehrere Probenröhrchen |
• Gleichzeitige Beschallung von bis zu 10 verschlossenen Vials mit identischer Ultraschallenergie • Steril: Keine Kreuzkontamination, da die Proben verschlossen bleiben • Hochgradig reproduzierbare Extraktionsbedingungen über verschiedene Chargen hinweg • Effiziente Kavitation für analytische Proben mit kleinem Volumen |
• Vorbereitung von Umwelt-, Lebensmittel- oder pharmazeutischen Proben mit hohem Probendurchsatz • Extraktion von Spurenanalyten vor der HPLC-, UHPLC- oder LC-MS-Analyse • Standardisierte Arbeitsabläufe, die eine identische Behandlung mehrerer Proben erfordern |
| Mikroplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP |
• Kontaktlose Beschallung vollständiger Mikroplatten mit 96 oder 384 Wells • Gleichmäßige Verteilung der Ultraschallenergie über alle Wells • Ermöglicht die Automatisierung und die Integration von Robotik in analytische Arbeitsabläufe • Hoher Probendurchsatz mit präziser Kontrolle von Amplitude und Beschallungsdauer |
• UHPLC-Screening-Arbeitsabläufe mit hohem Probendurchsatz • Pharmazeutische Substanzbibliotheken und Probenvorbereitung für die Metabolomik • Plattenbasierte Extraktion für LC-MS- oder UHPLC-Analyseabläufe |
| Labor-Ultraschallgeräte mit Mikrospitze (direkte Beschallung) |
• Maximale Ultraschallintensität für einen effizienten Matrixaufschluss • Sehr schnelle Extraktion von Analyten aus festen, viskosen oder heterogenen Proben • Einstellbare Amplituden- und Pulsparameter für optimierte Extraktionsbedingungen • Hohe Kavitationsenergie verbessert die Analytwiederfindung und die Extraktionsausbeute |
• Extraktion aus schwierigen Matrizes wie Pflanzengewebe, Lebensmittelproben oder Polymeren • Homogenisierung vor SPE, Filtration oder Flüssig–Flüssig-Extraktion • Methodenentwicklung für die Ultraschall-Probenvorbereitung für HPLC |
| CupHorn („Intensivbad“ für Bechergläser und Röhrchen) |
• Indirekte Beschallung verhindert Kontamination im Zusammenhang mit der Sonotrode • Gleichmäßiges Ultraschallfeld für mehrere Röhrchen gleichzeitig • Ideal für sterile, gefährliche oder flüchtige Proben, die verschlossen bleiben müssen • Vereinfacht die Handhabung bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung hoher Kavitationsenergie |
• Parallele Extraktion mehrerer HPLC-Proben in verschlossenen Zentrifugenröhrchen • Vorbereitung biologischer, pharmazeutischer oder Umweltproben • Arbeitsabläufe, bei denen eine kontaminationsfreie indirekte Beschallung erforderlich ist |
Wissenschaftliche Bedeutung für die analytische Chemie
Mit der Entwicklung schnellerer und nachhaltigerer Laborverfahren in der analytischen Chemie hat sich die Ultraschall-Probenvorbereitung zu einer leistungsfähigen Technologie entwickelt, die diese Fortschritte ermöglicht. Die Beschallung unterstützt die Entwicklung schneller Analyseverfahren mit geringerem Lösungsmittelverbrauch, verbesserter Extraktionseffizienz und robusten Validierungsparametern.
Die wachsende Zahl wissenschaftlicher Veröffentlichungen zur Ultraschallextraktion zeigt, dass die ultraschallgestützte HPLC-Probenvorbereitung nicht nur eine praktische Erleichterung ist – sie ist ein wissenschaftlich validierter Ansatz, der die analytische Leistungsfähigkeit verbessert. Durch die Kombination der Ultraschallextraktion mit modernen chromatographischen Verfahren können Labore Spurenanalyten in zunehmend komplexen Probenmatrizes zuverlässig nachweisen.
Durch Beschallung verbesserte HPLC-Arbeitsabläufe
Mit den kontinuierlichen Fortschritten bei analytischen Instrumenten und Technologien zur Probenvorbereitung wird die Ultraschallextraktion voraussichtlich eine noch größere Rolle in chromatographischen Laboren spielen. Ihre Fähigkeit, Arbeitsabläufe zu optimieren, die Datenqualität zu verbessern und die Umweltbelastung zu verringern, entspricht den sich wandelnden Anforderungen der modernen analytischen Wissenschaft.
Für analytische Chemiker und Industrielabore, die ihre HPLC-Probenvorbereitung optimieren möchten, bietet die Ultraschallextraktion eine bewährte, skalierbare und wissenschaftlich fundierte Lösung. Durch die Integration der Beschallung in routinemäßige Probenvorbereitungsprotokolle können Labore sowohl die Effizienz als auch die Zuverlässigkeit chromatographischer Analysen erheblich verbessern.
Entwicklung, Fertigung und Beratung – Qualität Made in Germany
Hielscher Ultraschallgeräte sind für höchste Qualitäts- und Konstruktionsstandards bekannt. Robustheit und einfache Bedienung ermöglichen die reibungslose Integration unserer Ultraschallgeräte in Industrieanlagen. Raue Bedingungen und anspruchsvolle Umgebungen bewältigen Hielscher Ultraschallgeräte problemlos.
Hielscher Ultrasonics ist ein ISO-zertifiziertes Unternehmen und legt besonderen Wert auf leistungsstarke Ultraschallgeräte mit modernster Technologie und hoher Benutzerfreundlichkeit. Selbstverständlich sind Hielscher Ultraschallgeräte CE-konform und erfüllen die Anforderungen von UL, CSA und RoHs.
Literatur / Referenzen
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Häufig gestellte Fragen
Was ist HPLC?
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist ein analytisches Trennverfahren zur Identifizierung, Quantifizierung und Reinigung von Bestandteilen eines Gemisches. Bei der HPLC transportiert eine flüssige mobile Phase gelöste Analyten unter hohem Druck durch eine mit einer stationären Phase gepackte Säule. Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen den Analyten, der stationären Phase und der mobilen Phase führen dazu, dass sich die Verbindungen beim Durchlaufen der Säule trennen. Detektoren auf Basis von UV-Vis, Fluoreszenz oder Massenspektrometrie messen die getrennten Verbindungen und ermöglichen eine präzise qualitative und quantitative Analyse.
Welche Arten der Flüssigkeitschromatographie gibt es?
Die Flüssigkeitschromatographie lässt sich nach dem Trennmechanismus einteilen, der auf den Wechselwirkungen zwischen Analyt, stationärer Phase und mobiler Phase beruht. Zu den häufigsten Arten gehören die Umkehrphasenchromatographie, bei der eine unpolare stationäre Phase Verbindungen anhand hydrophober Wechselwirkungen trennt; die Normalphasenchromatographie, die eine polare stationäre Phase verwendet und Verbindungen nach ihrer Polarität trennt; die Ionenaustauschchromatographie, bei der geladene stationäre Phasen Analyten anhand ionischer Wechselwirkungen trennen; und die Größenausschlusschromatographie, die Moleküle nach ihrer hydrodynamischen Größe und ihrem Molekulargewicht trennt. Weitere spezialisierte Verfahren sind die Affinitätschromatographie und die Chromatographie mit hydrophilen Wechselwirkungen (HILIC), die auf spezifische molekulare Wechselwirkungen beziehungsweise polare Verbindungen ausgerichtet sind.
Welche Vials werden für die HPLC verwendet?
Für HPLC-Analysen werden üblicherweise kleine Glas- oder Polymer-Vials verwendet, die vorbereitete Proben vor der Injektion in das chromatographische System aufnehmen. Das gängigste Format ist das 2-mL-Autosampler-Vial, das mit den meisten HPLC-Autosamplern kompatibel ist. Diese Vials bestehen meist aus Borosilikatglas, um chemische Beständigkeit und minimale Wechselwirkungen mit Lösungsmitteln und Analyten zu gewährleisten. Je nach Probentyp können die Vials Einsätze für Proben mit geringem Volumen, Schraub- oder Bördelverschlüsse und Septen aus Materialien wie PTFE/Silikon besitzen, um die Probenintegrität zu erhalten.
Was sind Autosampler-Vials?
Autosampler-Vials sind spezielle Probengefäße für automatisierte Injektionssysteme in HPLC- und UHPLC-Geräten. Sie enthalten die vorbereitete Probenlösung und werden im Probentablett des Autosamplers platziert, wo das System automatisch ein definiertes Volumen zur Injektion in die chromatographische Säule entnimmt. Autosampler-Vials werden mit präzisen Abmessungen gefertigt, um die Kompatibilität mit robotisch gesteuerten Probenahmenadeln zu gewährleisten und Probenverdunstung, Kontamination oder Adsorption zu minimieren. Ihre Konstruktion ermöglicht reproduzierbare Analysen mit hohem Probendurchsatz in modernen chromatographischen Laboren.
Welche Schritte umfasst die HPLC?
Der typische Arbeitsablauf der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) besteht aus mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die eine zuverlässige Trennung und Detektion der Analyten gewährleisten.
- Zunächst erfolgt die Probenvorbereitung, um den Analyten zu lösen, Partikel zu entfernen und häufig Zielverbindungen aus der Probenmatrix zu extrahieren oder anzureichern. Dieser Schritt kann Filtration, Verdünnung oder Extraktionsverfahren wie Ultraschallextraktion, Festphasenextraktion oder Flüssig–Flüssig-Extraktion umfassen.
- Anschließend wird die vorbereitete Probe in ein HPLC-Vial gefüllt und in den Autosampler eingesetzt. Der Autosampler injiziert ein präzises Probenvolumen in die strömende mobile Phase.
- Bei der anschließenden Förderung der mobilen Phase wird die injizierte Probe mithilfe einer Hochdruckpumpe durch das System transportiert. Die mobile Phase führt die Analyten mit einer kontrollierten Durchflussrate durch die chromatographische Säule.
- Die Trennung erfolgt innerhalb der chromatographischen Säule. Die Säule enthält eine stationäre Phase, typischerweise eine Packung aus Partikeln mit definierten chemischen Eigenschaften. Beim Durchlaufen der Säule wechselwirken die Analyten unterschiedlich mit der stationären und der mobilen Phase, wodurch sie zu unterschiedlichen Zeiten eluieren.
- Nach der Trennung passieren die Verbindungen einen Detektor, beispielsweise einen UV-Vis-, Fluoreszenz- oder Massenspektrometrie-Detektor. Der Detektor misst das Vorhandensein und die Konzentration der eluierenden Verbindungen und wandelt das Signal in elektronische Daten um.
- Abschließend erfolgen die Datenerfassung und -auswertung mithilfe einer Chromatographiesoftware. Das System erzeugt ein Chromatogramm, in dem die Peaks einzelnen Verbindungen entsprechen. Die Retentionszeiten der Peaks helfen bei der Identifizierung der Analyten, während Peakflächen oder Peakhöhen die quantitative Bestimmung ihrer Konzentration ermöglichen.
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