Die Ultraschallbehandlung ist eine hocheffiziente Methode zur Freisetzung von Chitin und Chitosan aus Pilzquellen wie Pilzen. Chitin und Chitosan müssen in der nachgelagerten Verarbeitung deacetyliert werden, um ein hochwertiges Biopolymer zu erhalten. Die ultraschallunterstützte Deacetylierung ist eine hochwirksame, einfache und schnelle Technik, die zu hochwertigen Chitosanen mit hohem Molekulargewicht und hervorragender Bioverfügbarkeit führt.

Chitin und Chitosan aus Pilzen

Essbare und medizinische Pilze wie Lentinus edodes (Shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi oder Reishi), Inonotus obliquus (Chaga), Agaricus bisporus (Knollenblätterpilz), Hericium erinaceus (Löwenmähne), Cordyceps sinensis (Raupenpilz), Grifola frondosa (Knollenblätterpilz), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, Truthahnschwanz) und viele andere Pilzarten werden in großem Umfang als Lebensmittel und zur Gewinnung bioaktiver Stoffe verwendet. Diese Pilze sowie Verarbeitungsrückstände (Pilzabfälle) können zur Herstellung von Chitosan verwendet werden. Die Ultraschallbehandlung fördert nicht nur die Freisetzung von Chitin aus der Pilzzellwandstruktur, sondern treibt auch die Umwandlung von Chition in wertvolles Chitosan durch Depolymerisation mit Ultraschall voran.

Die Deacetylierung von Chitin zu Chitosan wird durch Sondierung gefördert.

ChitinChitin, ein N-Acetylglucosamin-Polymer (Poly-(β-(1-4)-N-acetyl-D-glucosamin), ist ein natürlich vorkommendes Polysaccharid, das im Exoskelett wirbelloser Tiere wie Krebstiere und Insekten, im Innenskelett von Tintenfischen und Tintenfischen sowie in den Zellwänden von Pilzen weit verbreitet ist. Eingebettet in die Struktur von Pilzzellwänden ist Chitin für die Form und Steifigkeit der Pilzzellwand verantwortlich. Für viele Anwendungen wird Chitin durch ein Depolymerisationsverfahren in sein deacetyliertes Derivat, das Chitosan, umgewandelt.
Chitosan ist das häufigste und wertvollste Derivat von Chitin. Es handelt sich um ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht, das durch b-1,4-Glykosid verbunden ist und aus N-Acetyl-Glucosamin und Glucosamin besteht.
Chitosan kann durch chemische oder enzymatische Verfahren gewonnen werden. n-Deacetylierung. Bei der chemisch gesteuerten Deacetylierung wird die Acetylgruppe (R-NHCOCH₃) wird durch starkes Alkali bei hohen Temperaturen abgespalten. Alternativ kann Chitosan auch durch enzymatische Deacetylierung synthetisiert werden. Im industriellen Produktionsmaßstab wird jedoch die chemische Deacetylierung bevorzugt, da die enzymatische Deacetylierung aufgrund der hohen Kosten der Deacetylase-Enzyme und der geringen Chitosanausbeute deutlich weniger effizient ist. Die Ultraschallbehandlung wird eingesetzt, um den chemischen Abbau der (1→4)-/β-Verknüpfung (Depolymerisation) zu verstärken und die Deacetylierung des Chitins zu bewirken, um hochwertiges Chitosan zu erhalten. Wird die enzymatische Deacetylierung mit Ultraschall vorbehandelt, verbessert sich auch die Ausbeute und Qualität des Chitosans.

Industrielle Chitosanproduktion aus Pilzen mit Ultraschall

Die kommerzielle Chitin- und Chitosanproduktion basiert hauptsächlich auf Abfällen der Meeresindustrie (d.h. Fischfang, Muschelernte usw.). Unterschiedliche Rohstoffquellen führen zu unterschiedlichen Chitin- und Chitosanqualitäten, die aufgrund saisonaler Fischereischwankungen zu Produktions- und Qualitätsschwankungen führen. Darüber hinaus bietet Chitosan aus Pilzquellen Berichten zufolge im Vergleich zu Chitosan aus marinen Quellen bessere Eigenschaften wie eine homogene Polymerlänge und eine bessere Löslichkeit. (vgl. Ghormade et al., 2017) Um einheitliches Chitosan zu liefern, ist die Extraktion von Chitin aus Pilzarten zu einer stabilen Produktionsalternative geworden. Die Produktion von Chitin und Citiosan aus Pilzen lässt sich einfach und zuverlässig durch Ultraschallextraktion und Deacetylierungstechnik erreichen. Durch intensive Beschallung werden die Zellstrukturen aufgebrochen, um Chitin freizusetzen, und der Stoffaustausch in wässrigen Lösungsmitteln wird gefördert, was zu einer höheren Chitinausbeute und einer effizienteren Extraktion führt. Die anschließende Deacetylierung mit Ultraschall wandelt das Chitin in das wertvolle Chitosan um. Sowohl die Ultraschallextraktion von Chitin als auch die Deacetylierung zu Chitosan lassen sich linear auf jedes kommerzielle Produktionsniveau skalieren.

Die Sonikation intensiviert die Herstellung von Chitosan aus Pilzen und macht die Produktion effizienter und wirtschaftlicher.
(Bild und Studie: © Zhu et al., 2019)

Hocheffiziente Chitosan-Synthese durch Sonikation

Um die Nachteile (d.h. geringe Effizienz, hohe Energiekosten, lange Verarbeitungszeit, giftige Lösungsmittel) der herkömmlichen chemischen und enzymatischen Chitin-Deketlyse zu überwinden, wurde hochintensiver Ultraschall in die Chitin- und Chitosanverarbeitung integriert. Die Beschallung mit hoher Intensität und die daraus resultierenden Effekte der akustischen Kavitation führen zu einer schnellen Spaltung der Polymerketten und einer Verringerung der Polydispersität, wodurch die Synthese von Chitosan gefördert wird. Darüber hinaus verstärken die Scherkräfte des Ultraschalls den Stoffaustausch in der Lösung, so dass chemische, hydrolytische oder enzymatische Reaktionen gefördert werden.

Chemische Deacetylierung und Depolymerisation mit Hilfe von Ultraschall

Da Chitin ein nicht reaktives und unlösliches Biopolymer ist, muss es den Prozessschritten Demineralisierung, Deproteinisierung und Depolymerisierung/Deacetylierung unterzogen werden, um lösliches und bioakzeptables Chitosan zu erhalten. Diese Prozessschritte umfassen Behandlungen mit starken Säuren wie HCl und starken Basen wie NaOH und KOH. Da diese konventionellen Prozessschritte ineffizient, langsam und energieaufwendig sind, wird die Chitosanproduktion durch die Intensivierung des Prozesses mittels Beschallung erheblich verbessert. Die Anwendung von Power-Ultraschall erhöht die Chitosanausbeute und -qualität, verkürzt den Prozess von Tagen auf wenige Stunden, ermöglicht den Einsatz milderer Lösungsmittel und macht den gesamten Prozess energieeffizienter.

Verbesserte Deproteinisierung von Chitin durch Ultraschall

Vallejo-Dominguez et al. (2021) stellten in ihrer Untersuchung der Chitin-Deproteinisierung fest, dass die "Anwendung von Ultraschall zur Herstellung von Biopolymeren den Proteingehalt sowie die Partikelgröße von Chitin reduziert. Chitosan mit hohem Deacetylierungsgrad und mittlerem Molekulargewicht wurde mit Hilfe von Ultraschall hergestellt.

Ultraschall-Hydrolyse zur Chitin-Depolymerisation

Bei der chemischen Hydrolyse werden entweder Säuren oder Alkalien zur Deacetylierung von Chitin verwendet, wobei die Alkalideacetylierung (z. B. Natriumhydroxid NaOH) am häufigsten eingesetzt wird. Die Säurehydrolyse ist eine alternative Methode zur herkömmlichen chemischen Deacetylierung, bei der organische Säurelösungen verwendet werden, um Chitin und Chitosan zu depolymerisieren. Die Säurehydrolyse wird vor allem dann eingesetzt, wenn das Molekulargewicht von Chitin und Chitosan homogen sein muss. Dieses herkömmliche Hydrolyseverfahren ist als langsam, energie- und kostenintensiv bekannt. Der Bedarf an starken Säuren, hohen Temperaturen und Drücken sind Faktoren, die das hydrolytische Chitosanverfahren zu einem sehr teuren und zeitaufwändigen Verfahren machen. Die verwendeten Säuren erfordern nachgeschaltete Prozesse wie Neutralisation und Entsalzung.
Durch die Integration von Hochleistungsultraschall in den Hydrolyseprozess können die Temperatur- und Druckanforderungen für die hydrolytische Spaltung von Chitin und Chitosan erheblich gesenkt werden. Außerdem ermöglicht die Beschallung niedrigere Säurekonzentrationen oder die Verwendung milderer Säuren. Dies macht das Verfahren nachhaltiger, effizienter, kostengünstiger und umweltfreundlicher.

Chemische Deacetylierung mit Hilfe von Ultraschall

Der chemische Aufschluss und die Deacteylierung von Chitin und Chitosan erfolgt hauptsächlich durch Behandlung von Chitin oder Chitosan mit Mineralsäuren (z. B. Salzsäure HCl), Natriumnitrit (NaNO₂), oder Wasserstoffperoxid (H₂O₂). Ultraschall verbessert die Deacetylierungsrate und verkürzt damit die Reaktionszeit, die erforderlich ist, um den gewünschten Deacetylierungsgrad zu erreichen. Dies bedeutet, dass die Beschallung die erforderliche Verarbeitungszeit von 12-24 Stunden auf wenige Stunden reduziert. Darüber hinaus ermöglicht die Beschallung deutlich niedrigere chemische Konzentrationen, z. B. 40 % (w/w) Natriumhydroxid mit Beschallung, während ohne Ultraschall 65 % (w/w) erforderlich sind.

Ultraschall-enzymatische Deacetylierung

Die enzymatische Deacetylierung ist zwar eine milde, umweltverträgliche Verarbeitungsform, aber ihre Effizienz und Kosten sind unwirtschaftlich. Aufgrund der komplexen, arbeitsintensiven und teuren nachgeschalteten Isolierung und Reinigung der Enzyme aus dem Endprodukt wird die enzymatische Chitin-Desacetylierung nicht in der kommerziellen Produktion, sondern nur in wissenschaftlichen Forschungslabors eingesetzt.
Durch die Ultraschall-Vorbehandlung vor der enzymatischen Deacetylierung werden die Chitinmoleküle fragmentiert, wodurch sich die Oberfläche vergrößert und mehr Oberfläche für die Enzyme zur Verfügung steht. Die Hochleistungsbeschallung trägt zur Verbesserung der enzymatischen Deacetylierung bei und macht den Prozess wirtschaftlicher.

Forschungsergebnisse zur Deacetylierung von Chitin und Chitosan mit Ultraschall

Zhu et al. (2018) kommen in ihrer Studie zu dem Schluss, dass sich die Ultraschall-Deacetylierung als entscheidender Durchbruch erwiesen hat, indem sie β-Chitin mit 83-94 % Deacetylierung bei reduzierten Reaktionstemperaturen in Chitosan umwandelt. Das Bild links zeigt ein SEM-Bild von ultraschalldeacetyliertem Chitosan (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (Bild und Studie: © Zhu et al., 2018)
In ihrem Protokoll wurde eine NaOH-Lösung (20 Gew./Vol.-%) durch Auflösen von NaOH-Flocken in DI-Wasser hergestellt. Die Alkalilösung wurde dann dem GLSP-Sediment (0,5 g) in einem Fest-Flüssig-Verhältnis von 1:20 (g: mL) in einem Zentrifugenröhrchen zugesetzt. Chitosan wurde zu NaCl (40 mL, 0,2 M) und Essigsäure (0,1 M) in einem Volumenverhältnis von 1:1 hinzugefügt. Die Suspension wurde dann 60 Minuten lang bei einer milden Temperatur von 25 °C mit einem Sonden-Ultraschallgerät (250W, 20kHz) beschallt. (vgl. Zhu et al., 2018)
Pandit et al. (2021) stellten fest, dass die Abbaugeschwindigkeit von Chitosanlösungen nur selten von den zur Lösung des Polymers verwendeten Säurekonzentrationen beeinflusst wird und weitgehend von der Temperatur, der Intensität der Ultraschallwellen und der Ionenstärke des zur Auflösung des Polymers verwendeten Mediums abhängt. (vgl. Pandit et al., 2021)

In einer anderen Studie verwendeten Zhu et al. (2019) Sporenpulver von Ganoderma lucidum als Pilzrohstoff und untersuchten die ultraschallunterstützte Deacetylierung und die Auswirkungen von Verarbeitungsparametern wie Beschallungszeit, Fest-Flüssig-Verhältnis, NaOH-Konzentration und Bestrahlungsleistung auf den Deacetylierungsgrad (DD) von Chitosan. Der höchste DD-Wert wurde bei den folgenden Ultraschallparametern erreicht: 20 Minuten Beschallung bei 80 W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Die Oberflächenmorphologie, die chemischen Gruppen, die thermische Stabilität und die Kristallinität des mit Ultraschall gewonnenen Chitosans wurden mit Hilfe von SEM, FTIR, TG und XRD untersucht. Das Forschungsteam berichtet über eine deutliche Verbesserung des Deacetylierungsgrades (DD), der dynamischen Viskosität ([η]) und des Molekulargewichts (Mv¯) des mit Ultraschall hergestellten Chitosans. Die Ergebnisse unterstreichen, dass die Ultraschalldeacetylierung von Pilzen eine hochwirksame Produktionsmethode für Chitosan ist, die sich für biomedizinische Anwendungen eignet. (vgl. Zhu et al., 2019)

REM-Aufnahmen von Chitinen und Chitosanen aus zwei Pilzarten: a) Chitin aus L. vellereus; b) Chitin aus P. ribis; c) Chitosan aus L. vellereus; d) Chitosan aus P. ribis.
Bild und Studie: © Erdoğan et al., 2017

Hervorragende Chitosanqualität durch Ultraschall-Deacetylierung

Ultraschallgesteuerte Prozesse der Chitin-/Chitosanextraktion und -depolymerisation sind präzise steuerbar, und die Ultraschallprozessparameter können an die Rohstoffe und die angestrebte Endproduktqualität (z. B. Molekulargewicht, Deacetylierungsgrad) angepasst werden. Auf diese Weise kann der Ultraschallprozess an externe Faktoren angepasst und optimale Parameter für hervorragende Ergebnisse und Effizienz eingestellt werden.
Mit Ultraschall deacetyliertes Chitosan weist eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit und Biokompatibilität auf. Vergleicht man die biomedizinischen Eigenschaften von mit Ultraschall hergestellten Chitosan-Biopolymeren mit denen von thermisch gewonnenem Chitosan, so zeigt das mit Ultraschall hergestellte Chitosan eine deutlich verbesserte Lebensfähigkeit von Fibroblasten (L929-Zellen) und eine erhöhte antibakterielle Aktivität sowohl gegenüber Escherichia coli (E. coli) als auch Staphylococcus aureus (S. aureus).
(vgl. Zhu et al., 2018)

Wie funktioniert die Ultraschallextraktion und Deacetylierung von Chitin?

Wenn Hochleistungs-Ultraschallwellen in eine Flüssigkeit oder Aufschlämmung (z. B. eine Suspension aus Chitin in einem Lösungsmittel) eingekoppelt werden, wandern die Ultraschallwellen durch die Flüssigkeit und verursachen abwechselnde Hoch- und Niederdruckzyklen. Während der Niederdruckzyklen entstehen winzige Vakuumblasen (so genannte Kavitationsblasen), die über mehrere Druckzyklen wachsen. Ab einer bestimmten Größe, wenn die Blasen keine Energie mehr aufnehmen können, implodieren sie während eines Hochdruckzyklus gewaltsam. Die Implosion der Blasen ist durch starke Kavitationskräfte (oder sonomechanische Kräfte) gekennzeichnet. Diese sonomechanischen Bedingungen treten lokal im Kavitations-Hotspot auf und sind durch sehr hohe Temperaturen und Drücke von bis zu 4000K bzw. 1000atm sowie entsprechend hohe Temperatur- und Druckunterschiede gekennzeichnet. Darüber hinaus werden Mikroturbulenzen und Flüssigkeitsströme mit Geschwindigkeiten von bis zu 100m/s erzeugt. Die Ultraschallextraktion von Chitin und Chitosan aus Pilzen und Krustentieren sowie die Depolymerisation und Deacetylierung von Chitin werden hauptsächlich durch sonomechanische Effekte hervorgerufen: die Agitation und Turbulenzen zerstören Zellen und fördern den Stofftransport und können in Kombination mit sauren oder alkalischen Lösungsmitteln auch Polymerketten zerschneiden.
Funktionsprinzip der Chitinextraktion mittels Ultraschall: Bei der Ultraschallextraktion wird die Zellstruktur der Pilze effizient aufgebrochen und die intrazellulären Verbindungen aus der Zellwand und dem Zellinneren (d. h. Polysaccharide wie Chitin und Chitosan und andere bioaktive Phytochemikalien) in das Lösungsmittel freigesetzt. Die Ultraschallextraktion basiert auf dem Prinzip der akustischen Kavitation. Die Auswirkungen der Ultraschall- bzw. akustischen Kavitation sind hohe Scherkräfte, Turbulenzen und starke Druckunterschiede. Diese sonomechanischen Kräfte brechen zelluläre Strukturen wie die chitinösen Pilzzellwände auf, fördern den Stoffaustausch zwischen Pilzbiomaterial und Lösungsmittel und führen zu sehr hohen Extraktausbeuten in einem schnellen Prozess. Darüber hinaus fördert die Beschallung die Sterilisierung der Extrakte durch Abtötung von Bakterien und Mikroben. Die mikrobielle Inaktivierung durch Beschallung ist das Ergebnis der zerstörerischen Kavitationskräfte auf die Zellmembran, der Erzeugung freier Radikale und der lokalen Erwärmung.
Funktionsprinzip der Depolymerisation und Deacetylierung durch Ultraschall: Die Polymerketten geraten in das Scherfeld um eine Blase, und die Kettensegmente der Polymersäule in der Nähe eines kollabierenden Hohlraums bewegen sich mit höherer Geschwindigkeit als die weiter entfernten. Aufgrund der relativen Bewegung der Polymersegmente und der Lösungsmittel entstehen dann Spannungen in der Polymerkette, die ausreichen, um eine Spaltung zu bewirken. Der Prozess ähnelt somit anderen Schereffekten in Polymerlösungen ~2° und führt zu sehr ähnlichen Ergebnissen. (vgl. Price et al., 1994)

Hochleistungs-Ultraschallgeräte für die Verarbeitung von Chitin und Chitosan aus Pilzen

Rasterelektronenmikroskopische (REM)-Bilder in einer Vergrößerung von 100× von a) Gladius, b) ultraschallbehandeltem Gladius, c) β-Chitin, d) ultraschallbehandeltem β-Chitin und e) Chitosan (Quelle: Preto et al. 2017)

Die Fragmentierung von Chitin und die Deketylierung von Chitin zu Chitosan erfordert leistungsstarke und zuverlässige Ultraschallgeräte, die hohe Amplituden liefern können, eine präzise Kontrollierbarkeit der Prozessparameter bieten und rund um die Uhr unter hoher Belastung und in anspruchsvollen Umgebungen betrieben werden können. Die Produktpalette von Hielscher Ultrasonics erfüllt diese Anforderungen zuverlässig. Neben der hervorragenden Ultraschallleistung zeichnen sich die Hielscher Ultraschallgeräte durch eine hohe Energieeffizienz aus, was einen wesentlichen wirtschaftlichen Vorteil darstellt – insbesondere wenn sie in der kommerziellen Großproduktion eingesetzt werden.
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In der folgenden Tabelle finden Sie die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Ultraschallhomogenisatoren: