Alpha-Synuclein-Fragmentierung mit dem VialTweeter-Ultraschallgerät

α-Synuclein-Fibrillen und -Bänder werden in der wissenschaftlichen Forschung fragmentiert, um kleinere Fibrillenfragmente oder sogar einzelne Proteinmoleküle zu erzeugen, die sich mit verschiedenen experimentellen Techniken leichter analysieren lassen. Das VialTweeter-Ultraschallgerät gehört zu den am häufigsten verwendeten Ultraschallgeräten für die effiziente und zuverlässige Fragmentierung von Alpha-Synuclein.

α-Synuclein in der Forschung

Alpha-Synuclein-Fibrillen sind Proteinaggregate, die eng mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit und bestimmten Demenzformen, einschließlich der Demenz mit Lewy-Körperchen, in Verbindung stehen. Die Forschung zu Alpha-Synuclein-Fibrillen zielt darauf ab, ihre Rolle beim Fortschreiten der Erkrankungen zu verstehen und mögliche therapeutische Interventionen zu entwickeln. Durch die Zerlegung von Alpha-Synuclein-Fibrillen in kleinere Fragmente können Forschende deren spezifische strukturelle Merkmale untersuchen. Beispielsweise ermöglicht die Fragmentierung von Alpha-Synuclein-Fibrillen die Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit anderen Molekülen wie Proteinen, Lipiden oder kleinen Molekülen. Durch die Erzeugung kleinerer Fragmente lassen sich die Bindungsstellen und die Affinität zu diesen Interaktionspartnern effektiver untersuchen. Kleinere α-Syn-Fibrillen und -Bänder können auch eine veränderte Toxizität und veränderte biochemische Wirkungen aufweisen. Daher ist eine zuverlässige und effiziente Fragmentierungstechnik entscheidend, die bei einer schnellen und einfachen Probenbehandlung reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Alpha-Syn-Fragmentierung mittels Ultraschall: Das VialTweeter-Ultraschallgerät ist das etablierte Ultraschallsystem zur Probenvorbereitung, das bis zu 10 Probengefäße gleichzeitig unter exakt gleichen Bedingungen beschallt. Programmierbare Einstellungen ermöglichen die einfache und schnelle Wiederholung derselben Experimente, wodurch äußerst zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse bei der Fragmentierung von Alpha-Synuclein-Fibrillen erzielt werden.

α-Synuclein-Probenvorbereitung mit einem Ultraschallgerät

Ein Ansatz zur Untersuchung von Alpha-Synuclein-Fibrillen umfasst deren Extraktion und Fragmentierung mit Techniken wie der Ultraschallbehandlung. Die Ultraschallbehandlung ist ein Verfahren, bei dem niederfrequente Ultraschallwellen hoher Intensität eingesetzt werden, um Proteinaggregate aufzubrechen und zu zerlegen, wodurch kleinere Fibrillen oder einzelne Proteinmoleküle freigesetzt werden. Das Ultraschallgerät VialTweeter wird zu diesem Zweck häufig in Forschungsstudien zu α-Synuclein eingesetzt.

Zahlreiche Forschungsstudien beschreiben präzise Protokolle zur Probenvorbereitung durch Beschallung von Alpha-Synuclein-Fibrillen, bei denen der Hielscher VialTweeter zur effizienten und zuverlässigen Fragmentierung von α-Synuclein-Fibrillen eingesetzt wird. Durch die Fragmentierung der Fibrillen mittels Ultraschall können Forschende die entstehenden Produkte analysieren und deren Struktur, Toxizität und Wechselwirkungen mit anderen Molekülen untersuchen. Diese Forschung liefert wichtige Einblicke in die Mechanismen, die der Neurodegeneration zugrunde liegen, und kann potenziell neue therapeutische Zielstrukturen identifizieren. Die gut etablierten Protokolle zur Beschallung von α-Synuclein mit dem VialTweeter-Ultraschallgerät ermöglichen zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse.

Obere Bilder: unfragmentierte Alpha-Synuclein-Fibrillen
Untere Bilder: mit dem VialTweeter-Ultraschallgerät fragmentierte Alpha-Synuclein-Fibrillen
(Studie und Bilder: ©Dieriks et al., 2022)

Fragmentierung von α-Synuclein-Fibrillen mittels Ultraschall – Protokolle

Da zahlreiche Forschende das VialTweeter-Ultraschallgerät als bevorzugte Fragmentierungstechnik zur Herstellung einheitlicher α-Synuclein-Fibrillenfragmente einsetzen, sind etablierte Protokolle ohne Weiteres verfügbar. Nachfolgend finden Sie einige beispielhafte Fragmentierungsprotokolle.
 

 
Herstellung von ClearTau-Keimen: Die ClearTau-Fibrillen wurden in dH2O auf 10 μM verdünnt und mit dem Ultraschallgerät UP200St mit VialTweeter direkt im Röhrchen bei 70 % Amplitude für 50 s mit einem Zyklus von 1 s EIN und 1 s AUS beschallt. Die Keime wurden mittels Elektronenmikroskopie charakterisiert.
ThS-Fluoreszenzmessung: Die ClearTau-Fibrillen wurden in dH2O auf 2,5 μM verdünnt und mit UP200St mit VialTweeter direkt im Röhrchen bei 70 % Amplitude für 50 s mit einem Zyklus von 1 s EIN und 1 s AUS beschallt. Als Kontrolle wurde 2,5 μM monomeres Tau 4R2N in voller Länge verwendet. Zum Reaktionsansatz von 100 μl wurden 100 μl ThS (10 μM) hinzugefügt, wodurch sich endgültige Proteinkonzentrationen von 1,25 μM ergaben. Die ThS-Fluoreszenz wurde zu einem einzelnen Zeitpunkt unter Verwendung von 96-Well-Platten mit transparentem Boden im FLUOstar Omega-Mikroplattenlesegerät gemessen; die Anregung erfolgte bei 445 nm und die Emission wurde bei 485 nm aufgezeichnet.
(vgl. Limorenko et al., 2023)
 
Einheitliche α-Synuclein-Länge durch Ultraschallbehandlung: Die Längenheterogenität von α-syn-Fibrillen und -Bändern wurde durch Beschallung für 20 min auf Eis in 2-ml-Eppendorf-Röhrchen in einem VialTweeter bei 75% Amplitude mit 0,5 s langen Pulsen reduziert.
(vgl. Bousset et al., 2013)
 
Es wurde eine Qualitätskontrolle von humanem rekombinantem monomerem WT- oder S129A-a-Syn und den daraus entstehenden fibrillären Polymorphen sowie von a-Syn 1–110 durchgeführt. Anschließend wurden die fibrillären Polymorphe durch Beschallung für 20 min in 2-mL-Eppendorf-Röhrchen im VialTweeter-Ultraschallgerät fragmentiert, um fibrilläre Partikel mit einer durchschnittlichen Größe von 42–52 nm zu erzeugen, die für die Endozytose geeignet sind.
(vgl. Shrivastava et al., 2020)
 

Charakterisierung von fünf fibrillären α-Syn-Polymorphen. (A) Gezeigt werden transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der negativ kontrastierten fibrillären α-Syn-Polymorphe fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 und fibrils-110 vor (obere Reihe) und nach der Fragmentierung mit dem VialTweeter (untere Reihe). (B) Gezeigt wird die Längenverteilung der fragmentierten fibrillären Polymorphe. Die Anzahl (n) der fibrillären Aggregate, aus denen die Histogramme abgeleitet wurden, ist angegeben.
(Studie und Bilder: Shrivastava et al., 2020)

 
Die α-Syn-Fibrillen wurden durch Beschallung für 20 min in 2 ml-Eppendorf-Röhrchen in einem VialTweeter fragmentiert, um fibrilläre Partikel mit einer mittels TEM-Analyse bestimmten durchschnittlichen Größe von 42–52 nm zu erzeugen.
(vgl. Negrini et al., 2022)
 
Die resuspendierten fibrils91 (in PBS) wurden vor der Zugabe zu Zellkulturen durch Beschallung für 20 min in 2 mL-Eppendorf-Röhrchen mit dem Vial Tweeter-Ultraschallgerät fragmentiert, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80 ̊C gelagert.
(vgl. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeter und Labor-Ultraschallgeräte für die α-Syn-Fragmentierung

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Die folgende Tabelle gibt Ihnen einen Anhaltspunkt für die ungefähre Verarbeitungskapazität unserer Labor-Ultraschallgeräte: