Bildung von Amyloidfibrillen mit dem Mikroplatten-Sonicator UIP400MTP

Amyloidfibrillen bilden sich, ähnlich wie Kristalle, durch einen Prozess der Keimbildung und des anschließenden Wachstums. Aufgrund der hohen Frei-Energie-Barriere der Keimbildung erfolgt die spontane Bildung von Amyloidfibrillen jedoch erst nach einer längeren Verzögerungsphase. Die Ultraschallbehandlung hat sich als leistungsfähiges Instrument zur Auslösung der Amyloid-Kernbildung erwiesen, wodurch die Fibrillenbildung erheblich beschleunigt wird. In Verbindung mit einem Mikroplatten-Lesegerät, das Thioflavin T (ThT) Fluoreszenz verwendet, ermöglicht die Ultraschallbehandlung den gleichzeitigen Nachweis von Amyloidfibrillen in mehreren Proben im Hochdurchsatz.

Ultraschall-induzierte Bildung von Amyloidfibrillen mit dem Mikroplatten-Sonicator UIP400MTP

Mit dem UIP400MTP Multi-Well-Platten-Sonicator können Amyloidfibrillen in gleicher Qualität und in großen Mengen für Forschungszwecke schnell synthetisiert werden. Dieser effiziente Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Amyloidogenität von Proteinen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Amyloidfibrillierung, wie mit β2-Mikroglobulin (β2-m), einem amyloidogenen Protein, das mit dialysebedingter Amyloidose in Verbindung gebracht wird, gezeigt wurde.

Einfacher experimenteller Ansatz: Ultraschall-induzierte Amyloid-Fibrillation

Um die Fibrillenbildung zu induzieren, wurde eine 96-Well-Mikroplatte in der Mitte des UIP400MTP-Multi-Well-Platten-Sonicators platziert, was eine gleichmäßige Ultraschalleinwirkung auf alle Vertiefungen gewährleistet. Die Versuchsbedingungen waren wie folgt:

1. Jede Vertiefung enthielt 0,2 ml β2-Mikroglobulin-Lösung (0,3 mg/ml, pH 2,5), ergänzt mit 5 μM ThT.
2. Die Platte wurde Ultraschallzyklen unterzogen, z. B. 1 Minute Ultraschall, gefolgt von einer 9-minütigen Pause.
3. Nach der Sondierung wurde die ThT-Fluoreszenz mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

(vgl. So et al., 2011)

Vergleich mit konventioneller Agitation

Im Vergleich zu herkömmlichen Schüttelmethoden wurde die Verzögerungsphase der Fibrillenbildung durch die Ultraschallbehandlung drastisch verkürzt. Unter herkömmlichen Schüttelbedingungen wies nur eine von 10 Vertiefungen nach 20 Stunden eine erhöhte ThT-Fluoreszenz auf. Im Gegensatz dazu wurde bei zyklischer Ultraschallbehandlung (15 Minuten Beschallung, gefolgt von 5 Minuten Ruhe) unmittelbar nach der ersten Beschallung ein signifikanter Anstieg der ThT-Fluoreszenz festgestellt.

Schnelle Beschleunigung der Fibrillationskinetik

Die Ergebnisse von So et al. (2011) zeigten, dass die spontane Fibrillenbildung von β2-Mikroglobulin bei pH 2,5 durch Ultraschallbehandlung von mehreren Stunden auf nur 10-15 Minuten beschleunigt werden kann.
Bilder der Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestätigten, dass die durch 10-minütige Ultraschallbehandlung alle 15 Minuten erzeugten Fibrillen morphologisch nicht von denen zu unterscheiden waren, die durch 1-minütige Ultraschallbehandlung alle 10 Minuten gebildet wurden. Dies unterstreicht die Reproduzierbarkeit und Robustheit der ultraschallinduzierten Amyloidfibrillation.

AFM-Bilder von Amyloidfibrillen, die durch 1-minütige Beschallung alle 10 Minuten (i), durch 10-minütige Beschallung alle 15 Minuten (ii) und durch die Seeding-Reaktion ohne Beschallung (iii) erzeugt wurden. Der weiße Skalenbalken entspricht 1 μm.
Studie und Bilder: ©So et al., 2011

Fibrillation unter neutralen pH-Bedingungen

Selbst unter neutralen pH-Bedingungen wurde die Fibrillenbildung nach einer Verzögerungszeit von 1,5 Stunden erreicht, was zeigt, dass die Ultraschallbehandlung die energetische Barriere für Keimbildung und Wachstum erheblich senkt. Dies untermauert die Hypothese, dass die Amyloidfibrillierung in erster Linie eine physikalische Reaktion ist, die weitgehend durch die Energiebarriere für die Keimbildung eingeschränkt wird, die durch die Ultraschallbehandlung wirksam verringert wird.

Auswirkungen auf die Erforschung amyloidbedingter Krankheiten

Die einfache und zuverlässige Bildung von Amyloidfibrillen mit dem Mikroplatten-Sonicator UIP400MTP ist von großer Bedeutung für die Erforschung der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderer mit Amyloid zusammenhängender Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit, Typ-II-Diabetes und systemischen Amyloidosen. Bei der Alzheimer-Krankheit ist die Amyloid-β (Aβ)-Aggregation ein pathologisches Schlüsselmerkmal, doch die Untersuchung der Fibrillationskinetik bleibt aufgrund der langen Verzögerungsphasen und der Variabilität herkömmlicher Methoden eine Herausforderung. Die ultraschallgesteuerte Fibrillenbildung beschleunigt die Keimbildung und gewährleistet eine hohe Reproduzierbarkeit und geringere Variabilität, was für das Screening potenzieller Inhibitoren und das Verständnis der amyloidogenen Mechanismen entscheidend ist. Darüber hinaus ermöglicht die Hochdurchsatzfähigkeit des UIP400MTP groß angelegte Untersuchungen zur Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen und erleichtert so die Entdeckung von therapeutischen Wirkstoffen, die die Fibrillenbildung modulieren und das Fortschreiten der neurodegenerativen Erkrankung möglicherweise abschwächen können.

In dieser Studie wird die Ultraschallbehandlung mit dem UIP400MTP-Multi-Well-Platten-Sonicator als hocheffiziente Methode zur Beschleunigung der Bildung von Amyloidfibrillen nachgewiesen. Zu den wichtigsten Vorteilen dieses Ansatzes gehören:

• Drastische Verkürzung der Verzögerungszeit für Fibrillation.
• Gleichmäßige Ultraschallexposition in allen Vertiefungen, was eine reproduzierbare Fibrillenbildung ermöglicht.
• Hochdurchsatz-Screening-Fähigkeit, die es für genomweite Untersuchungen der Protein-Amyloidogenität geeignet macht.

Durch die Integration von Ultraschall mit ThT-Fluoreszenzdetektion bietet diese Methode eine schnelle, skalierbare und zuverlässige Plattform zur Untersuchung der Amyloidfibrillation. Angesichts seiner Effizienz und seines Hochdurchsatzpotenzials könnte dieser Ansatz die einfache Synthese von Amyloidfibrillen für die biophysikalische und pharmazeutische Forschung erleichtern und ein vielversprechendes Instrument für Studien im Zusammenhang mit Amyloid und das Screening von Medikamenten darstellen.