Bildung von Amyloidfibrillen mit dem Mikroplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP

Amyloidfibrillen entstehen ähnlich wie Kristalle durch Keimbildung und anschließendes Wachstum. Aufgrund der hohen Barriere der freien Energie bei der Keimbildung erfolgt die spontane Bildung von Amyloidfibrillen jedoch erst nach einer längeren Latenzphase. Die Ultraschallbehandlung hat sich als leistungsfähiges Werkzeug zur Induktion der Amyloid-Keimbildung etabliert und beschleunigt dadurch die Fibrillenbildung erheblich. In Kombination mit einem Mikroplattenlesegerät, das die Fluoreszenz von Thioflavin T (ThT) nutzt, ermöglicht die Ultraschallbehandlung den gleichzeitigen Nachweis von Amyloidfibrillen in mehreren Proben mit hohem Probendurchsatz.

Ultraschallinduzierte Bildung von Amyloidfibrillen mit dem Mikroplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP

Mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten lassen sich Amyloidfibrillen gleichbleibender Qualität schnell in großen Mengen für Forschungszwecke synthetisieren. Dieser effiziente Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Amyloidogenität von Proteinen. Die Technik ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Amyloidfibrillenbildung, wie anhand von β2-Mikroglobulin (β2-m) gezeigt wurde, einem amyloidogenen Protein, das mit dialyseassoziierter Amyloidose in Verbindung steht.

Einfacher experimenteller Ansatz: ultraschallinduzierte Amyloidfibrillenbildung

Zur Induktion der Fibrillenbildung wurde eine 96-Well-Mikroplatte in der Mitte des Ultraschallgeräts UIP400MTP für Multiwell-Platten platziert, das eine gleichmäßige Ultraschalleinwirkung in allen Wells gewährleistet. Die Versuchsbedingungen waren wie folgt:

1. Jedes Well enthielt 0,2 ml einer β2-Mikroglobulin-Lösung (0,3 mg/ml, pH 2,5), der 5 μM ThT zugesetzt waren.
2. Die Platte wurde Ultraschallzyklen unterzogen, beispielsweise einer Ultraschallbehandlung von 1 Minute mit anschließender Pause von 9 Minuten.
3. Nach der Ultraschallbehandlung wurde die ThT-Fluoreszenz mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen.

(vgl. So et al., 2011)

Vergleich mit konventionellem Schütteln

Im Vergleich zu herkömmlichen Schüttelverfahren verkürzte die Ultraschallbehandlung die Latenzphase der Fibrillenbildung drastisch. Unter konventionellen Bedingungen beim Schütteln von Mikroplatten zeigte nach 20 Stunden nur 1 von 10 Wells eine erhöhte ThT-Fluoreszenz. Bei zyklischer Ultraschallbehandlung (15 Minuten Beschallung mit anschließender Ruhephase von 5 Minuten) wurde dagegen unmittelbar nach der ersten Ultraschallbehandlung ein signifikanter Anstieg der ThT-Fluoreszenz nachgewiesen.

Rasche Beschleunigung der Fibrillenbildungskinetik

Die Ergebnisse von So et al. (2011) zeigten, dass sich die spontane Fibrillenbildung von β2-Mikroglobulin bei pH 2,5 durch Ultraschallbehandlung von mehreren Stunden auf lediglich 10–15 Minuten beschleunigen lässt.
Aufnahmen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestätigten, dass Fibrillen, die durch eine Ultraschallbehandlung von 10 Minuten alle 15 Minuten erzeugt wurden, morphologisch nicht von denen zu unterscheiden waren, die durch eine Ultraschallbehandlung von 1 Minute alle 10 Minuten entstanden. Dies unterstreicht die Reproduzierbarkeit und Robustheit der ultraschallinduzierten Amyloidfibrillenbildung.

AFM-Aufnahmen von Amyloidfibrillen, die durch eine Ultraschallbehandlung von 1 min alle 10 min (i), durch eine Beschallung von 10 min alle 15 min (ii) und durch die Reaktion mit Fibrillenkeimen ohne Ultraschallbehandlung (iii) erzeugt wurden. Der weiße Maßstabsbalken (scale bar) entspricht 1 μm.
Studie und Abbildungen: ©So et al., 2011

Fibrillenbildung unter neutralen pH-Bedingungen

Selbst unter neutralen pH-Bedingungen wurde nach einer Latenzzeit von 1,5 Stunden eine Fibrillenbildung erreicht. Dies zeigt, dass die Ultraschallbehandlung die energetische Barriere für Keimbildung und Wachstum erheblich senkt. Dies stützt weiter die Hypothese, dass die Amyloidfibrillenbildung vorwiegend eine physikalische Reaktion ist, die weitgehend durch die Energiebarriere der Keimbildung begrenzt wird, welche durch die Ultraschallbehandlung wirksam reduziert wird.

Bedeutung für die Erforschung amyloidassoziierter Erkrankungen

Die einfache und zuverlässige Bildung von Amyloidfibrillen mit dem Mikroplatten-Ultraschallgerät UIP400MTP ist von großer Bedeutung für die Forschung zur Alzheimer-Krankheit (AD) und zu anderen amyloidassoziierten Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit, Typ-II-Diabetes und systemischen Amyloidosen. Bei AD ist die Aggregation von Amyloid-β (Aβ) ein zentrales pathologisches Merkmal. Die Untersuchung seiner Fibrillenbildungskinetik bleibt jedoch aufgrund langer Latenzphasen und der Variabilität konventioneller Methoden eine Herausforderung. Die ultraschallinduzierte Fibrillenbildung beschleunigt die Keimbildung und gewährleistet eine hohe Reproduzierbarkeit sowie eine geringere Variabilität, was für das Screening potenzieller Inhibitoren und das Verständnis amyloidogener Mechanismen entscheidend ist. Darüber hinaus ermöglicht der hohe Probendurchsatz des UIP400MTP Untersuchungen der Proteinfehlfaltung und -aggregation in großem Umfang. Dies erleichtert die Entdeckung therapeutischer Wirkstoffe, die die Fibrillenbildung modulieren und möglicherweise das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen abschwächen können.

Diese Studie etabliert die Ultraschallbehandlung mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten als hocheffiziente Methode zur Beschleunigung der Bildung von Amyloidfibrillen. Zu den wichtigsten Vorteilen dieses Ansatzes gehören:

• Drastische Verkürzung der Latenzzeit der Fibrillenbildung.
• Gleichmäßige Ultraschalleinwirkung in allen Wells, die eine reproduzierbare Fibrillenbildung ermöglicht.
• Möglichkeit des Hochdurchsatz-Screenings, wodurch sich der Ansatz für genomweite Untersuchungen der Amyloidogenität von Proteinen eignet.

Durch die Kombination von Ultraschallbehandlung und ThT-Fluoreszenznachweis bietet diese Methode eine schnelle, skalierbare und zuverlässige Plattform zur Untersuchung der Amyloidfibrillenbildung. Angesichts seiner Effizienz und seines Potenzials für einen hohen Probendurchsatz könnte dieser Ansatz die einfache Synthese von Amyloidfibrillen für die biophysikalische und pharmazeutische Forschung erleichtern und ein vielversprechendes Werkzeug für amyloidbezogene Studien und das Wirkstoffscreening bieten.