PMCA für den Hochdurchsatz-Nachweis von Prionen mit dem Sonicator UIP400MTP

Der UIP400MTP Multi-Well-Platten-Sonicator bietet eine leistungsstarke Lösung für die Probenvorbereitung mit hohem Durchsatz bei der zyklischen Amplifikation von Proteinfehlfaltungen (PMCA). Durch die gleichmäßige Energieverteilung über mehrere Vertiefungen und die Einhaltung präziser Beschallungsparameter ermöglicht dieses System die gleichzeitige Verarbeitung zahlreicher Proben mit außergewöhnlicher Reproduzierbarkeit. Diese Fähigkeiten sind von entscheidender Bedeutung für die Optimierung der PMCA zum Nachweis von Prionen in niedrigen Konzentrationen in schwierigen biologischen Proben, wie z. B. Speichel, bei denen Assay-Inhibitoren die Ergebnisse verschleiern können.

Prionenkrankheiten, wie die Chronic Wasting Disease (CWD) bei Hirschartigen und die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch fehlgefaltete Prionproteine (PrP^Sc). Bei diesen Krankheiten sind oft geringe Mengen infektiöser Prionen in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Blut und Urin vorhanden, was die Diagnose und Forschung erschwert. Die horizontale Übertragung von CWD durch Prionen, die in der Umweltmatrix ausgeschieden werden, hat besonders große Auswirkungen auf das Wildtiermanagement und die ökologische Gesundheit. Auch bei Krankheiten wie der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ist die zuverlässige Amplifikation fehlgefalteter Prionproteine aus menschlichen Proben von entscheidender Bedeutung für eine verbesserte Diagnostik und das Verständnis des Krankheitsverlaufs.

Die Anwendung eines modifizierten PMCA-Protokolls ermöglicht es, gängige Assay-Inhibitoren (z. B. Muzine im Speichel) zu umgehen und eine hohe Sensitivität beim Nachweis von Prionen zu erreichen, die andernfalls mit Techniken wie der quakenden Echtzeit-Konversion (RT-QuIC) nicht nachweisbar oder unklar wären. Diese Fortschritte verbessern den Prionennachweis für verschiedene Krankheiten und machen PMCA zu einem unverzichtbaren Instrument für die Prionenforschung und -diagnostik. Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP ermöglicht die PMCA-Beschallung zahlreicher Proben in Mikroplatten (z. B. 6-, 24- oder 96-Well-Platten) oder Fläschchen in einem Röhrchen-Rack im Hochdurchsatzverfahren.

Protokoll für die zyklische Amplifikation der Proteinfehlfaltung (PMCA) im Hochdurchsatzverfahren

Das folgende Protokoll ermöglicht die effiziente Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben unter genau denselben Bedingungen, um zuverlässige Forschungsergebnisse zu erzielen.

Probenvorbereitung

Ausgangsmaterial:
Proben vorbereiten durch:

• Resuspendieren der Sarkosyl-Extraktionspellets in PMCA-Substrat.
• Direktes Versetzen von Gehirnhomogenaten oder Blutproben mit Prionensamen.

Substrat:

• Verwenden Sie ein 10%iges (wt/vol) Gehirnhomogenat von transgenen Mäusen, die PrP überexprimieren^C (z. B. Tg-Mäuse).
• Homogenisieren Sie das Hirngewebe in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Lagern Sie das Substrat bis zur Verwendung bei -80ºC.

Probenaufbau in Mikroplatte oder Röhrchen:
Röhren:

• 90 μl Gehirnhomogenat-Substrat zugeben und mit 10 μl Probe (z. B. Blut, Gehirnhomogenat oder Sarkosylpellet) ansetzen.
• Geben Sie 3 Teflonkügelchen (1,59 mm oder 2,38 mm Durchmesser) in jedes 0,2-mL-Röhrchen.
• Montieren Sie die Röhren in einem mit dem UIP400MTP-Sonicator kompatiblen Gestell.

6-Well-Mikroplatte:

• 5 mL Gehirnhomogenat-Substrat hinzufügen und mit 500 μL Probe pro Vertiefung aussäen.
• In jede Vertiefung 3 Teflonkügelchen geben.

PMCA-Verfahren

Platzierung:
Setzen Sie das Röhrchengestell oder die 6-Well-Mikroplatte gemäß den Anweisungen des Herstellers in den UIP400MTP-Sonicator.

Radsport-Programm:
Führen Sie 144 PMCA-Zyklen wie folgt durch:

• Inkubation: 29 Minuten und 30 Sekunden bei 37°C.
• Beschallung: 30 Sekunden bei 60 % Amplitude.
• Überwachen Sie die Temperatur: Verwenden Sie den steckbaren Temperatursensor zur Überwachung der Probentemperatur und programmieren Sie das UIP400MTP auf eine maximale Temperatur von 48-50°C.

Nachfolgende Runden:
Nach Abschluss der ersten Runde von 144 Zyklen übertragen Sie ein Aliquot des amplifizierten Materials:

• 10-fache Verdünnung in frischem transgenem Maushirn-Homogenat-Substrat.
• Führen Sie für die folgenden Runden 96 PMCA-Zyklen durch, wobei Sie die gleichen Beschallungsparameter beibehalten.
• Fahren Sie mit der gewünschten Anzahl von Runden fort (normalerweise bis zu 5).

Nachweis von PrP^Sc

1. Proteinase K Verdauung:
   – Die Proben 1 Stunde lang mit Proteinase K (50 μg/mL) bei 37 °C behandeln.
   – Beenden Sie den Verdau durch Zugabe von SDS-Probenpuffer und 10 Minuten langes Sieden.
2. Western-Blot-Analyse:
   – Analysieren Sie die verdauten Proben mit:
   – 6H4 oder PRC1 Anti-PrP-Antikörper.
   – SDS-PAGE durchführen und zum Nachweis auf PVDF-Membranen übertragen.

 

 

Verarbeiten Sie mehr Proben für zuverlässigere Ergebnisse

Der Multi-Well-Platten-Sonicator UIP400MTP verbessert die Effizienz und Skalierbarkeit der zyklischen Amplifikation von Proteinfehlfaltung (PMCA) erheblich und behebt die traditionell zeitaufwändige Natur des Verfahrens. Das System ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung von bis zu 96 Proben in einer 96-Well-Platte und rationalisiert so die PMCA-Workflows bei gleichzeitiger Einhaltung präziser und einheitlicher Beschallungsbedingungen in allen Wells. Diese Hochdurchsatzfähigkeit minimiert die manuelle Handhabung, reduziert arbeitsintensive Schritte und gewährleistet die Reproduzierbarkeit, was es zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Prionenforschung macht. Ob bei der Untersuchung der Chronic Wasting Disease oder der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, das UIP400MTP erleichtert groß angelegte Studien mit größerer Effizienz und ermöglicht es den Forschern, die Anforderungen moderner diagnostischer und wissenschaftlicher Anwendungen zu erfüllen.

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Literatur / Literaturhinweise

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