PMCA zum Nachweis von Prionen mit hohem Probendurchsatz mithilfe des Ultraschallgeräts UIP400MTP

Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten bietet eine leistungsstarke Lösung für die Probenvorbereitung mit hohem Probendurchsatz bei der zyklischen Amplifikation der Proteinfehlfaltung (PMCA). Durch eine gleichmäßige Energieverteilung über mehrere Wells und die Einhaltung präziser Beschallungsparameter ermöglicht dieses System die gleichzeitige Verarbeitung zahlreicher Proben mit außergewöhnlicher Reproduzierbarkeit. Diese Eigenschaften sind entscheidend für die Optimierung der PMCA zum Nachweis geringer Prionenkonzentrationen in anspruchsvollen biologischen Proben wie Speichel, in denen Assay-Inhibitoren die Ergebnisse verschleiern können.

Prionenerkrankungen wie Chronic Wasting Disease (CWD) bei Hirschartigen und die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch fehlgefaltete Prionproteine (PrP^Sc) verursacht werden. Bei diesen Erkrankungen liegen infektiöse Prionen in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Blut und Urin häufig nur in geringen Mengen vor, was Diagnose und Forschung erschwert. Die horizontale Übertragung von CWD durch Prionen, die in Umweltmatrizes ausgeschieden werden, hat besonders weitreichende Auswirkungen auf das Wildtiermanagement und die Gesundheit von Ökosystemen. Ebenso ist bei Erkrankungen wie der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit die zuverlässige Amplifikation fehlgefalteter Prionproteine aus menschlichen Proben entscheidend, um die Diagnostik weiterzuentwickeln und den Krankheitsverlauf zu verstehen.

Die Anwendung eines modifizierten PMCA-Protokolls ermöglicht es, die Wirkung gängiger Assay-Inhibitoren (z. B. Muzine im Speichel) zu umgehen und eine hohe Sensitivität beim Nachweis von Prionen zu erreichen, die mit Verfahren wie der Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) ansonsten nicht oder nicht eindeutig nachweisbar wären. Diese Fortschritte verbessern den Prionennachweis bei verschiedenen Erkrankungen und machen die PMCA zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Prionenforschung und -diagnostik. Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten erleichtert die PMCA mit hohem Probendurchsatz, indem es zahlreiche Proben in Mikrotiterplatten (z. B. 6-, 24- oder 96-Well-Platten) oder Probengefäßen in einem Röhrchengestell beschallt.

Protokoll für die zyklische Amplifikation der Proteinfehlfaltung (PMCA) mit hohem Probendurchsatz

Das folgende Protokoll ermöglicht die effiziente Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben unter exakt gleichen Bedingungen für robuste Forschungsergebnisse.

Probenvorbereitung

Ausgangsmaterial:
Bereiten Sie die Proben durch folgende Schritte vor:

• Resuspendieren der Pellets aus der Sarkosyl-Extraktion in PMCA-Substrat.
• Direktes Versetzen von Gehirnhomogenaten oder Blutproben mit Prionenkeimen.

Substrat:

• Verwenden Sie ein 10%iges (wt/vol) Gehirnhomogenat aus transgenen Mäusen, die PrP^C überexprimieren (z. B. Tg-Mäuse).
• Homogenisieren Sie das Gehirngewebe in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Lagern Sie das Substrat bis zur Verwendung bei -80ºC.

Probenansatz in Mikrotiterplatten oder Röhrchen:
Röhrchen:

• Geben Sie 90 μL Gehirnhomogenat-Substrat hinzu und versetzen Sie es mit 10 μL Probe (z. B. Blut, Gehirnhomogenat oder Sarkosyl-Pellet).
• Geben Sie 3 Teflonkugeln mit einem Durchmesser von 1,59 mm oder 2,38 mm in jedes Röhrchen mit einem Volumen von 0,2 mL.
• Setzen Sie die Röhrchen in ein mit dem Ultraschallgerät UIP400MTP kompatibles Gestell ein.

6-Well-Mikrotiterplatte:

• Geben Sie pro Well 5 mL Gehirnhomogenat-Substrat hinzu und versetzen Sie es mit 500 μL Probe.
• Geben Sie 3 Teflonkugeln in jedes Well.

PMCA-Verfahren

Positionierung:
Setzen Sie das Röhrchengestell oder die 6-Well-Mikrotiterplatte gemäß den Herstelleranweisungen in das Ultraschallgerät UIP400MTP ein.

Zyklenprogramm:
Führen Sie 144 PMCA-Zyklen wie folgt durch:

• Inkubation: 29 Minuten und 30 Sekunden bei 37°C.
• Beschallung: 30 Sekunden bei 60% Amplitude.
• Temperaturüberwachung: Verwenden Sie den anschließbaren Temperatursensor zur Überwachung der Probentemperatur und programmieren Sie das UIP400MTP auf eine maximale Temperatur von 48–50°C.

Nachfolgende Runden:
Überführen Sie nach Abschluss der ersten Runde mit 144 Zyklen ein Aliquot des amplifizierten Materials:

• Verdünnen Sie es 10-fach in frischem Gehirnhomogenat-Substrat aus transgenen Mäusen.
• Führen Sie in den nachfolgenden Runden 96 PMCA-Zyklen durch und behalten Sie dabei dieselben Beschallungsparameter bei.
• Fahren Sie fort, bis die gewünschte Anzahl an Runden erreicht ist (typischerweise bis zu 5).

Nachweis von PrP^Sc

1. Proteinase-K-Verdau:
   – Behandeln Sie die Proben bei 37°C für 1 Stunde mit Proteinase K (50 μg/mL).
   – Beenden Sie den Verdau durch Zugabe von SDS-Probenpuffer und Kochen für 10 Minuten.
2. Western-Blot-Analyse:
   – Analysieren Sie die verdauten Proben mithilfe von:
   – Anti-PrP-Antikörpern 6H4 oder PRC1.
   – Führen Sie eine SDS-PAGE durch und übertragen Sie die Proteine zum Nachweis auf PVDF-Membranen.

 

Das Hielscher UIP400MTP ist das flexibelste Ultraschallgerät für Ihre Multiwellplatten, PCR-Platten oder Probenröhrchen. Mit 400 Watt kontinuierlicher Ultraschallleistung ist es für Anwendungen wie Zelllyse, Emulgieren, Proteinextraktion, DNA- / RNA-Fragmentierung, Deagglomeration, FFPE-Extraktion, Ablösen von Zellen und Biofilmen oder Emulgieren ausgelegt. Das UIP400MTP ist kein Ultraschallbad. Es ist eine hochintensive Bechersonotrode für die fokussierte Beschallung. Dieses leistungsstarke, berührungslos arbeitende Ultraschallgerät gewährleistet eine gleichmäßige Beschallung aller Vertiefungen Ihrer Standard-Multiwellplatte. Amplitude, Leistung und Pulsbetrieb lassen sich präzise steuern. Ein integrierter Timer und ein Temperaturfühler gewährleisten gleichbleibende Ergebnisse. Das Platten-Ultraschallgerät UIP400MTP kühlt die Proben im Wasserbad (externer Umlaufkühler optional).

 

Verarbeiten Sie mehr Proben für robustere Ergebnisse

Das Ultraschallgerät UIP400MTP für Multiwell-Platten steigert die Effizienz und Skalierbarkeit der zyklischen Amplifikation der Proteinfehlfaltung (PMCA) erheblich und begegnet damit dem traditionell hohen Zeitaufwand dieses Verfahrens. Indem es die gleichzeitige Verarbeitung von bis zu 96 Proben in einer 96-Well-Platte ermöglicht, vereinfacht das System die PMCA-Arbeitsabläufe und hält zugleich präzise und gleichmäßige Beschallungsbedingungen in allen Wells aufrecht. Dieser hohe Probendurchsatz minimiert die manuelle Handhabung, reduziert arbeitsintensive Schritte und gewährleistet Reproduzierbarkeit, wodurch das Gerät zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Prionenforschung wird. Ob bei der Untersuchung von Chronic Wasting Disease oder der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit: Das UIP400MTP erleichtert groß angelegte Studien mit höherer Effizienz und ermöglicht es Forschenden, die Anforderungen moderner diagnostischer und wissenschaftlicher Anwendungen zu erfüllen.

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Literatur / Referenzen

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