Ultralydsanvendelser ved abekoppevirus

Sonikering er en vigtig behandlingsmetode til isolering af abekoppevirus (MPXV) fra analytiske prøver, til fragmentering af virus-DNA samt til fremstilling af vacciner mod abekopper. Ved prøveforberedelse før diagnostik og analyse (PCR, ELISA osv.) bruges sonikering til at lysere celler for at frigive abekoppevirus fra cellernes indre og / eller til at fragmentere DNA. Ved vaccineproduktion spænder anvendelserne fra forberedelse af viruspartikler / DNA og indkapsling i lægemiddelbærere til formulering af inokula.
Nedenfor finder du detaljerede oplysninger om ultralydsbaseret forberedelse af prøver med abekoppevirus samt ultralydsassisteret produktion af MPXV-vacciner.

Det finder du på denne side:

• Ultralydslyse til ekstraktion af abekoppevirus
• Ultralydsfragmentering af abekoppevirus-DNA
• Ultralydsanvendelser i produktionen af MPXV-vacciner

Ultralydslyse og DNA-fragmentering før polymerasekædereaktion (PCR)

En infektion med abekoppevirus påvises ved nukleinsyreamplifikationstest (NAAT) ved hjælp af realtids- eller konventionel polymerasekædereaktion (PCR) til påvisning af unikke sekvenser af viralt DNA. Prøven (f.eks. fra en nasofaryngeal podning eller hudbiopsier) indeholder virusset i celler.
Til analysen skal virusset frigives fra cellerne, og det virale DNA skal fragmenteres til PCR.

Ultralydslyse:

Ultralydsbaseret celleopbrydning / lyse er en pålidelig og effektiv metode til at isolere virus fra celleprøver og dermed en teknik, der er at foretrække frem for kemiske stoffer såsom lysozym, proteinase K og forskellige detergenter, som alternativt bruges til at opnå cellelyse og frigivelse af DNA.
Brugen af sådanne kemiske reagenser kræver dog tidskrævende prøveforberedelse i flere trin før PCR-analysen for at forhindre hæmning af PCR-reaktionen. Da PCR-hæmmere påvirker amplifikationens effektivitet, kan små variationer i mængden af hæmmere, som ikke fjernes, føre til store variationer i amplifikationen af PCR-produktet (Diaco, 1995).
Fordelen ved sonikering til lyse er, at fuldstændig opbrydning af cellestrukturer og frigivelse af DNA uden behov for lysereagenser og tidskrævende prøveforberedelse er ønskværdige. (jf. Fykse et al., 2003)

Ultralydsfragmentering af DNA:

Ultralydsfragmentering af DNA er enkel og pålidelig, da den producerer DNA-fragmenter med en længde, der kan justeres (basepar, bp). Ved hjælp af ultralyd kan DNA effektivt fragmenteres til den ønskede DNA-længde. Præcis kontrol over ultralydsparametre og avancerede kølemuligheder forhindrer nedbrydning af DNA.
Læs mere om ultralydsfragmentering af DNA!

Ultralydsanvendelser i vacciner mod abekoppevirus

Vacciner, der bruges mod abekoppevirus, er i øjeblikket levende virusvacciner. Nyudviklede vacciner kan muligvis bruge andre platforme såsom DNA-baserede … Indeholder i øjeblikket et modificeret Vaccinia Ankara-virus, et svækket, ikke-replikerende orthopoxvirus. Det indeholder også Tris (tris-aminomethan) og natriumchlorid. Vaccinen kan også indeholde små mængder DNA og protein fra kyllingeembryofibroblastcellerne, som bruges til at dyrke vaccinevirusset, benzonase og antibiotiske forbindelser såsom gentamicin og ciprofloxacin.

Ultralydshomogenisering bruges til produktion af levende svækkede virusvacciner, DNA-vacciner, multivalente DNA-cocktails, mRNA-vacciner, rekombinante proteinvacciner, vacciner med viruslignende partikler osv.

Her finder du mere dybdegående oplysninger om ultralydsanvendelser til forbedret vaccinefremstilling!

Protokol for ultralydsbaseret isolering af abekoppevirus

Stittelaars forskerteam (2005) brugte ultralydslyse til at frigive abekoppevirus fra den værtscellekultur, som virusset blev dyrket i, samt fra celler indsamlet ved svælgpodninger fra inficerede primater.

Fremstilling af vaccine mod abekopper:

Monkeypox-virusser blev dyrket på specifik-patogenfri kyllingembryo-fibroblastceller. Efter inkubation i 1 til 2 dage blev virus-cellesuspensionen høstet ved én fryse-tø-cyklus og derefter koncentreret ved centrifugering. Pelleten blev resuspenderet og underkastet flere runder af ultralydshomogenisering.

Isolering af abekoppevirus fra vaccinerede makakker:

Prøver blev frosset og optøet tre gange og sonikeret i et ultralyds-CupHorn. To fortyndinger (1:10 og 1:100) i transportmedium suppleret med 1% føtalt bovint serum blev anvendt til at inokulere Vero-cellemonolag i plader med seks brønde. Efter 1 h inkubation ved 37°C blev inokula fjernet og erstattet med dyrkningsmedium suppleret med 1% føtalt bovint serum. Monolagene blev dyrket i 5 dage ved 37°C og farvet med en krystalvioletopløsning.
(jf. Stittelaar et al., 2005)

Ultralydsapparater til virusanalyse og vaccineproduktion

Hielscher Ultrasonics’ brede produktportefølje tilbyder det ideelle ultralydsapparat til forsknings- og analyselaboratorier samt til industriel vaccinefremstilling.
Hielscher Ultrasonics er specialiseret i design, fremstilling og distribution af højtydende ultralydsapparater og ultralydsbioreaktorer til brug i forsknings- og analyselaboratorier samt til implementering i industriel vaccineproduktion (f.eks. vacciner, aktive farmaceutiske stoffer).
Sonikering kan anvendes i åbne beholdere, lukkede reaktorer med kontinuerlig omrøring og reaktorer med kontinuerlig gennemstrømning. Alle dele af ultralydssystemerne, som kommer i kontakt med det flydende medium, er fremstillet af rustfrit stål, titanium eller glas. Autoklaverbare dele og sanitære fittings sikrer produktion under forhold af farmaceutisk kvalitet.
Automatisk dataregistrering: Intelligent software registrerer automatisk sonikeringsprocessens parametre på det integrerede SD-hukommelseskort. Den præcise kontrol over alle procesparametre sikrer reproducerbarhed, standardisering af produktionen og gør det lettere at opfylde sikkerhedsstandarderne for farmaceutiske produkter.
Hielscher Ultrasonics’ ultralydsprocessorer er yderst pålidelige og kan styres præcist. Alle industrielle ultralydsapparater kan indstilles til at levere hele spektret fra lavere til meget høje amplituder. Robustheden af Hielscher’s ultralydssystemer muliggør drift 24/7 under høj belastning og i krævende miljøer.

Tabellen nedenfor giver en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet: