Ультразвукова екстракція білків з пухлинної тканини – Протокол

Цей протокол описує метод ультразвукової екстракції білків з пухлинної тканини, який удосконалює стандартний робочий процес лізису сечовиною CPTAC, додаючи контрольований етап зондової ультразвукової обробки під час руйнування тканини. Спираючись на встановлену стратегію підготовки протеому та фосфопротеому CPTAC у глибокому масштабі, ця модифікація покращує руйнування клітинних і субклітинних структур, знижує в’язкість зразків і підвищує вихід білків, які зазвичай важче виділити лише за допомогою лізису сечовиною, особливо мембранних, ДНК-зв’язувальних або ядерних білків. У базовому дослідженні робочий процес з ультразвуковою обробкою збільшив виявлення як білків, так і фосфопептидів, зберігаючи сумісність із наступним перетравленням у стилі CPTAC, міченям TMT, фракціонуванням, збагаченням фосфопептидів та аналізом LC-MS/MS.

Ультразвукова екстракція білків з пухлинної тканини для глибокого протеомного та фосфопротеомного аналізу

Наступний протокол оптимізовано для екстракції білків з кріопорошкової пухлинної тканини в буфері для лізису з 8 M сечовиною: доданий етап зондової ультразвукової обробки покращує вихід складних класів білків, особливо мембранних і ДНК-/ядерних білків, перед перетравленням і наступним аналізом LC-MS/MS. У базовому дослідженні Li et al. (2025) додавання ультразвукової обробки збільшило виявлення мембранних і ядерних білків та забезпечило глибоке покриття >12 000 білків і >25 000 фосфопептидів у їхньому робочому процесі.

Сфера застосування протоколу

Використовуйте цю процедуру для:

• свіжозамороженої, кріопорошкової пухлинної тканини
• осадів клітин або інших біологічних зразків, де екстракція на основі сечовини вже є усталеною
• загальних робочих процесів протеоміки та фосфопротеоміки з використанням триптичного перетравлення та опціонального мічення TMT

У дослідженні Li et al. (2025) зазначено, що робочий процес також застосовний до інших типів зразків, таких як клітинні лінії, кров і сеча, проте може знадобитися оптимізація залежно від типу зразка.

Оптимізований робочий процес підготовки зразків із впровадженим етапом ультразвукової обробки. Оптимізований робочий процес і експериментальний дизайн засновані на протоколі підготовки зразків CPTAC для загального протеомного та фосфопротеомного аналізу.
Дослідження та схема: ©Li et al., 2025

Принцип роботи

У початковому дослідженні до стандартного робочого процесу лізису сечовиною CPTAC було додано ультразвукову обробку, що призвело до покращеного виявлення білків, пов’язаних з мембранами та ядрами. Автори зазначають, що параметри ультразвукової обробки необхідно точно налаштувати щодо розміру/концентрації зразка – шляхом вибору розміру сонотрода, енерговкладу та імпульсного режиму.

Наприклад, для Hielscher UP200Ht і UP200St це означає:

• використовувати амплітуду та імпульсний режим як основні змінні керування
• підтримувати зразки холодними протягом усього процесу (тобто на льоду)
• починати з консервативних налаштувань
• оптимізувати щодо прозорості зразка, температури, виходу білка та якості пептидів на наступних етапах

 
Обидві моделі ультразвукових гомогенізаторів Hielscher потужністю 200 ватів, UP200Ht і UP200St, призначені для малих і середніх об’ємів зразків і мають регульовані налаштування амплітуди та імпульсів; обидва ультразвукові гомогенізатори забезпечують цифрове керування через сенсорний екран для точного налаштування параметрів, автоматичне записування даних, під’єднуваний датчик температури, дистанційне керування та освітлення зразка.
 

Реактиви для ультразвукової екстракції білків

Буфер для лізису сечовиною

Готуйте свіжий безпосередньо перед використанням:

• 8 M сечовина
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL апроінін
• 10 µg/mL лейпептин
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Коктейль інгібіторів фосфатаз 2, 1:100 (v/v)
• Коктейль інгібіторів фосфатаз 3, 1:100 (v/v)

Сечовина повинна бути повністю розчинена перед додаванням добавок; інгібітори слід додавати безпосередньо перед використанням; буфер слід тримати на льоду; після додавання добавок рекомендується перемішування замість інтенсивного вихорування.

Додаткові реактиви:

• Реактиви для аналізу білка BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Йодоацетамід
• LysC
• Трипсин
• Мурашина кислота
• Реагенти TMT, якщо використовується мультиплексна кількісна протеоміка
• Реагенти IMAC, якщо виконується збагачення фосфопептидами

Обладнання для екстракції білків за допомогою ультразвукової обробки

Обов’язково

Рекомендований вибір зонда

Для зразків об’ємом приблизно 200–1000 µL використовуйте сонотрод малого діаметра, відповідний для прямої високоефективної обробки малих об’ємів. Hielscher пропонує сонотроди різних діаметрів, і менші діаметри насадок забезпечують вищу інтенсивність на кінчику.

Практична примітка: Використовуйте найменший зонд, який забезпечує ефективне змішування без надмірного утворення піни або контакту зі стінкою посудини.

Якщо ви працюєте з кількома зразками одночасно, ви можете розглянути багатотрубний ультразвуковий обробник VialTweeter або ультразвуковий обробник для мікропланшетів UIP400MTP!

Покрокові інструкції: Процедура екстракції білків за допомогою ультразвукової обробки

A. Попереднє охолодження та підготовка

1. Охолодіть центрифугу до 4°C.
2. Приготуйте свіжий лізисний буфер на основі сечовини та тримайте його на льоду.
3. Встановіть UP200Ht або UP200St на штатив всередині звукоізоляційної камери.
4. Підготуйте крижану ванну достатнього розміру, щоб утримувати пробірки зі зразками вертикально та стабільно.

Приготування свіжого буфера та холодне поводження є критично важливими.

B. Початкова екстракція сечовиною

1. Тримайте кріопорошкоподібну тканину на льоду.
2. Додайте 200 µL охолодженого лізисного буфера на основі сечовини на 50 mg вологої тканини.
3. Віксуйте 5–10 s на високій швидкості.
4. Інкубуйте 15 min при 4°C.
5. Повторіть етап віксування та інкубації ще раз.
6. Центрифугуйте при 20 000g протягом 10 min при 4°C.
7. Перенесіть лізат/надосадову рідину в чисту пробірку з низькою адсорбцією.

C. Ультразвукова обробка з використанням UP200Ht або UP200St

Початкові умови для ультразвукової обробки

• Амплітуда: почніть з 20–30%
• Тривалість імпульсу: 5 s ВКЛ
• Охолодження: 2 min на льоду між імпульсами
• Кількість циклів: 4 цикли
• Загальний час активної ультразвукової обробки: 20 s
• Загальний час процесу, включаючи охолодження: приблизно 8–10 min

Етапи ультразвукової обробки

1. Перенесіть лізат у пробірку, придатну для ультразвукової обробки. Використовуйте вузьку тонкостінну пробірку, яка забезпечує хороший теплообмін та безпечне занурення зонда.
2. Помістіть пробірку в крижану ванну. У статті зазначено, що охолодження під час ультразвукової обробки є критичним для запобігання тепловому пошкодженню.
3. Занурте кінчик зонда в зразок. Тримайте кінчик достатньо зануреним для стабільної кавітації, але не дозволяйте йому торкатися стінки або дна пробірки.
4. Виконайте один імпульс тривалістю 5 s при початковій амплітуді.
5. Негайно поверніть зразок повністю в лід на 2 min.
6. Повторюйте, доки не буде завершено 4 цикли.
7. Перевірте лізат після циклу.
8. Продовжуйте лише за потреби, використовуючи один додатковий імпульс тривалістю 5 s за раз, завжди з повним охолодженням після нього.
9. Зупиніться, коли лізат стане більш однорідним і менш тягучим/в’язким.
   Кінцевим результатом є більш прозорий лізат, який утворює краплі, а не безперервний в’язкий потік.
10. Центрифугуйте приблизно при 16 000g протягом 15 min при 4°C.
11. Перенесіть прозору надосадову рідину в свіжу пробірку та виміряйте концентрацію білка.

Порівняння глобальної протеоміки та фосфопротеоміки між зразками, обробленими ультразвуком, та необробленими зразками.
a. Кількість ідентифікованих білків (глобальна протеоміка) у всіх тканинах пухлин PDX з ультразвуковою обробкою або без неї. b. Кількість ідентифікованих фосфопептидів (збагачення IMAC) у всіх тканинах пухлин PDX з ультразвуковою обробкою або без неї. Враховувалися лише білки та фосфопептиди з коефіцієнтом абундансу, більшим або рівним 25-му перцентилю. Коефіцієнт абундансу розраховувався між однаковими типами зразків.
Дослідження та графіки: ©Li et al., 2025

Подальше травлення та аналіз

Після ультразвукової обробки та прояснення дійте згідно з описаним у оригіналі робочим процесом у стилі CPTAC:

1. Розведіть лізат 1:3 (v/v) з 50 mM Tris-HCl pH 8,0, щоб зменшити концентрацію сечовини до <2 M.
2. Додайте LysC у кількості 1 mAU на 50 µg білка та інкубуйте 2 h при 25°C.
3. Додайте трипсин у співвідношенні фермент:субстрат 1:49 (w/w) та травіть протягом ночі при 25°C.
4. Зупиніть реакцію мурашиною кислотою до кінцевої концентрації 1%.
5. Продовжте десалінування, ТМТ-міткування, фракціонування, збагачення фосфопептидами та LC-MS/MS за потреби.

Диференційна експресія фосфопептидів за даними MS із TMT-міченням.
a. Базальний підтип, що виділяє деякі людські фосфопептиди (початок і кінець послідовності білка), які є регульованими вгору в зразках, оброблених ультразвуком, порівняно зі зразками без ультразвукової обробки. b. Люмінальний підтип, що виділяє деякі людські фосфопептиди (початок і кінець послідовності білка), які є регульованими вгору в зразках, оброблених ультразвуком, порівняно зі зразками без ультразвукової обробки. c. Збагачені шляхи KEGG на основі білків фосфопептидів, регульованих вгору в базальному підтипі пухлин, оброблених ультразвуком. d. Збагачені шляхи KEGG на основі білків фосфопептидів, регульованих вгору в люмінальному підтипі пухлин, оброблених ультразвуком.
Дослідження та графіки: ©Li et al., 2025

Розробка, виробництво та консалтинг – Якість, зроблена в Німеччині

Ультразвукові гомогенізатори Hielscher відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації забезпечують плавну інтеграцію наших ультразвукових гомогенізаторів у промислові об’єкти. Грубі умови та складні середовища легко витримуються ультразвуковими гомогенізаторами Hielscher.

Hielscher Ultrasonics – це компанія, сертифікована за ISO, яка приділяє особливу увагу високоефективним ультразвуковим гомогенізаторам, що мають передові технології та зручний інтерфейс користувача. Звісно, ультразвукові гомогенізатори Hielscher відповідають вимогам CE та вимогам UL, CSA і RoHs.

Література / Посилання

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.