Екстракція білка з пухлинної тканини за допомогою ультразвуку – протокол

Цей протокол описує метод екстракції білків з пухлинної тканини за допомогою ультразвуку, який вдосконалює стандартний робочий процес лізису сечовини CPTAC, додаючи етап контрольованої зондової ультразвукової обробки під час руйнування тканини. Спираючись на розроблену стратегію підготовки глибокомасштабного протеому та фосфопротеому CPTAC, ця модифікація покращує руйнування клітинної та субклітинної структури, зменшує в'язкість зразка та сприяє вивільненню білків, які зазвичай важко відновити лише за допомогою лізису сечовини, особливо мембранозв'язаних, ДНК-зв'язуючих або ядро-асоційованих білків. У базовому дослідженні робочий процес за допомогою ультразвукової обробки підвищив виявлення як білків, так і фосфопептидів, зберігаючи при цьому сумісність з подальшим розщепленням у стилі CPTAC, маркуванням TMT, фракціонуванням, збагаченням фосфопептидів і конвеєром для аналізу методом ЖХ-МС/МС.

Екстракція білків за допомогою ультразвуку з пухлинної тканини для глибокого протеомного та фосфопротеомного аналізу

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Сфера застосування Протоколу

Використовуйте цю процедуру для:

• свіжозаморожена, кріопульверизована пухлинна тканина
• клітинні гранули або інші біологічні зразки, де вже налагоджено екстракцію на основі сечовини
• глобальні робочі процеси протеоміки та фосфопротеоміки з використанням триптичного розщеплення та додаткового мічення TMT

У дослідженні Li et al. (2025) зазначається, що робочий процес також можна застосувати до інших типів зразків, таких як клітинні лінії, кров і сеча, однак, залежно від типу зразка, може знадобитися оптимізація.

Оптимізовано робочий процес пробопідготовки зразків з додаванням етапу обробки ультразвуком. Оптимізований робочий процес та експериментальний дизайн базуються на протоколі підготовки зразків CPTAC для глобального протеомного та фосфопротеомного аналізу.
Дослідження та схема: ©Li et al., 2025

Принцип роботи

Оригінальне дослідження додало ультразвукову обробку до стандартного робочого процесу лізису сечовини CPTAC і виявило покращене виявлення білків, пов'язаних з мембранами та ядрами. Автори стверджують, що параметри ультразвукової обробки повинні бути точно налаштовані щодо розміру зразка / концентрації – шляхом вибору розміру сонотрода, вхідної енергії та тривалості імпульсу.

Наприклад, для Hielscher UP200Ht і UP200St це означає:

• використовувати амплітуду та імпульсний режим як основні змінні керування
• тримати зразки холодними протягом усього часу (тобто на льоду)
• почніть з консервативних налаштувань
• оптимізувати за показниками прозорості зразка, температури, виходу білка та якості пептиду на виході

 
Обидва ультразвукові гомогенізатори Hielscher потужністю 200 Вт UP200Ht і UP200St призначені для малих і середніх об'ємів зразків, з регульованою амплітудою і налаштуваннями імпульсів; обидва ультразвукових гомогенізатора мають цифрове сенсорне управління для точного налаштування параметрів, автоматичний запис даних, підключається датчик температури, пульт дистанційного керування, підсвічування зразка.
 

Реагенти для екстракції білків за допомогою ультразвуку

Буфер для лізису сечовини

Готуйте свіжий безпосередньо перед вживанням:

• 8 М карбамід
• 75 мМ NaCl
• 50 мМ трис, рН 8,0
• 1 мМ ЕДТА
• 2 мкг/мл апротиніну
• 10 мкг/мл лейпептину
• 1 мМ PMSF
• 10 мМ NaF
• 20 мкМ PUGNAc
• Коктейль інгібіторів фосфатази 2, 1:100 (v/v)
• Коктейль інгібіторів фосфатази 3, 1:100 (v/v)

Перед додаванням добавок сечовина повинна бути повністю розчинена; інгібітори слід додавати безпосередньо перед використанням; буфер слід тримати на льоду; після додавання добавок рекомендується перемішування, а не інтенсивне вихрове перемішування.
 

Додаткові реагенти:

• Реагенти для аналізу білків BCA
• 50 мМ трис-HCl, рН 8,0
• DTT
• Йодоацетамід
• LysC
• трипсин
• Мурашина кислота
• Реагенти ТМТ, якщо використовується мультиплексна кількісна протеоміка
• Реагенти IMAC, якщо виконується збагачення фосфопептидів

Обладнання для екстракції білків за допомогою ультразвуку

Потрібно

Рекомендований вибір датчика

Для зразків об'ємом 200-1000 мкл використовуйте сонотрод малого діаметру, який підходить для прямої високоінтенсивної обробки малих об'ємів. Hielscher пропонує сонотроди різних діаметрів, а менші діаметри наконечників забезпечують більш високу інтенсивність на кінчику.

Практичне зауваження: Використовуйте найменший зонд, який забезпечує ефективне перемішування без надмірного піноутворення і контакту зі стінками посудини.

Якщо ви працюєте з кількома зразками одночасно, ви можете розглянути такі варіанти Багатотрубний сокатор VialTweeter або Мікропланшетний ультразвуковий пристрій UIP400MTP!

Покрокова інструкція: Процедура екстракції білка за допомогою ультразвукової обробки

A. Попереднє охолодження та підготовка

1. Охолодити центрифугу до 4°C.
2. Приготуйте свіжий буфер для лізису сечовини і тримайте його на льоду.
3. Встановіть UP200Ht або UP200St на стійку всередині звукового корпусу.
4. Підготуйте льодяну баню, достатньо велику, щоб пробірки зі зразками можна було тримати вертикально і стабільно.

Приготування свіжого буферу та обробка холодом мають вирішальне значення.

B. Початкова екстракція карбаміду

1. Тримайте кріопульверизовану тканину на льоду.
2. Додайте 200 мкл охолодженого буфера для лізису сечовини на 50 мг вологої серветки.
3. Вихор 5-10 с на високій швидкості.
4. Інкубувати 15 хвилин при 4°C.
5. Повторіть крок "вихор-плюс-інкубація" ще раз.
6. Центрифугують при 20 000 g протягом 10 хвилин при 4°C.
7. Перенесіть лізат/надосадову рідину в чисту пробірку з низьким рівнем зв'язування.

C. Ультразвукова обробка з використанням UP200Ht або UP200St

Початкові умови для ультразвукової обробки

• Амплітуда: починайте з 20-30%.
• Тривалість імпульсу: 5 с увімкнено
• Охолодження: 2 хв на льоду між імпульсами
• Кількість циклів: 4 цикли
• Загальний час активної ультразвукової обробки: 20 с
• Загальний час процесу, включаючи охолодження: близько 8-10 хв

Етапи ультразвукової обробки

1. Перенесіть лізат у пробірку, придатну для обробки ультразвуком. Використовуйте вузьку, тонкостінну пробірку, яка забезпечує хороший теплообмін і безпечне занурення зонда.
2. Помістіть пробірку в крижану ванну. У статті визначено, що охолодження під час ультразвукової обробки є критично важливим для запобігання тепловому пошкодженню.
3. Занурте кінчик зонда в зразок. Тримайте наконечник зануреним достатньо для стабільної кавітації, але не дозволяйте йому торкатися стінки або дна пробірки.
4. Запустіть один 5 с імпульс зі стартовою амплітудою.
5. Негайно поверніть зразок повністю в лід на 2 хвилини.
6. Повторюйте до завершення 4 циклів.
7. Перевірте лізат після циклу.
8. Продовжуйте тільки за необхідності, використовуючи по одному додатковому імпульсу тривалістю 5 с, завжди після повного охолодження.
9. Зупиніться, коли лізат стане більш однорідним і менш в'язким/в'язким.
   Кінцева точка - більш прозорий лізат, який утворює краплі, а не безперервний в'язкий потік.
10. Центрифугують при 16 000 g протягом 15 хвилин при 4°C.
11. Перенесіть прояснену надосадову рідину у свіжу пробірку і виміряйте концентрацію білка.

Порівняння глобальної протеоміки та фосфопротеоміки між обробленими та необробленими зразками.
a. Кількість ідентифікованих білків (глобальна протеоміка) у всіх пухлинних тканинах PDX з або без обробки ультразвуком. b. Кількість ідентифікованих фосфопептидів (збагачення IMAC) у всіх пухлинних тканинах PDX з або без обробки ультразвуком. Підраховували лише білки та фосфопептиди з коефіцієнтом поширеності, що перевищував або дорівнював 25-му процентилю. Співвідношення поширеності розраховували між однотипними зразками.
Дослідження та графіки: ©Li та ін., 2025

Подальше перетравлення та аналіз

Після обробки ультразвуком і очищення, дійте, як описано в оригінальному робочому процесі в стилі CPTAC:

1. Розведіть лізат 1:3 (v/v) 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, щоб зменшити вміст сечовини до <2 M.
2. Додайте LysC у концентрації 1 мМО на 50 мкг білка та інкубуйте 2 години при 25°C.
3. Додайте трипсин у співвідношенні 1:49 фермент:субстрат (w/w) і ферментуйте протягом ночі при 25°C.
4. Гасіть мурашиною кислотою до 1% кінцевої концентрації.
5. Продовжуйте знесолення, мічення ТМТ, фракціонування, збагачення фосфопептидами та ЖХ-МС/МС за потреби.

Диференціальна експресія фосфопептидів з мічених ТМТ МС.
a. Базальний підтип, виділяючи деякі фосфопептиди людини (початок і кінець білкової послідовності), що регулюються в оброблених ультразвуком зразках порівняно з неозвученими зразками. b. Люмінальний підтип, виділяючи деякі фосфопептиди людини (початок і кінець білкової послідовності), що регулюються в оброблених ультразвуком зразках порівняно з неозвученими зразками. c. Збагачені KEGG-шляхи на основі білків регульованих фосфопептидів в оброблених ультразвуком базальних підтипах пухлин. d. Збагачені KEGG-шляхи на основі білків регульованих фосфопептидів в оброблених ультразвуком люмінальних підтипах пухлин.
Дослідження та графіки: ©Li та ін., 2025

Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.

Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.

Література / Список літератури