Ультразвукове фрагментування ДНК для секвенування нового покоління

Секвенування нового покоління (NGS) вимагає надійного зсуву та фрагментування геномної ДНК для секвенування ланцюгів геномної ДНК та створення геномних бібліотек. Контрольоване фрагментування ДНК на фрагменти ДНК є необхідним етапом підготовки зразків, який виконується перед секвенуванням ДНК. Ультразвукова обробка доведена як ефективна та надійна техніка для фрагментування ДНК певної довжини. Протоколи ультразвукового фрагментування ДНК досягають відтворюваних результатів фрагментування. Ультразвукові гомогенізатори Hielscher здатні виробляти широкий спектр розподілів розмірів фрагментів геномної ДНК, які точно контролюються через параметри експлуатації. Оскільки системи ультразвукового зсуву ДНК Hielscher доступні для одиночних та множинних флаконів, а також для мікропланшетів, підготовка зразків стає надзвичайно ефективною.

Секвенування нового покоління: ультразвукове фрагментування ДНК для підготовки бібліотеки

Для виконання секвенування нового покоління необхідно провести три основні етапи: (1) підготовка бібліотеки, (2) секвенування та (3) аналіз даних. Під час підготовки бібліотеки ДНК фрагментується, потім кінці фрагментів ремонтуються (поліруються) шляхом додавання одиночної основи аденіну, а цільові фрагменти перетворюються на дволанцюгову ДНК. Нарешті, так звані адаптери приєднуються за допомогою лігування, ПЛР або тагментації, щоб кінцевий продукт ДНК бібліотеки можна було кількісно визначити для секвенування.
Фрагментування ДНК за допомогою ультразвукової обробки: Особливо коли використовуються технології секвенування коротких прочитань, такі як Illumina, які не можуть легко прочитати довші фрагменти ДНК, ланцюги ДНК повинні бути фрагментовані до певного розміру, що можна надійно досягти за допомогою ультразвукової обробки.
Ультразвукову обробку можна надійно використовувати для фрагментування ДНК, РНК та хроматину.

Секвенування нового покоління – Підготовка бібліотеки

Ультразвукове фрагментування ДНК зазвичай застосовується при підготовці бібліотек для секвенування ДНК на платформах секвенування нового покоління (NGS). Ця техніка використовується для розриву молекул ДНК на менші фрагменти бажаного діапазону розмірів, що сприяє наступним етапам підготовки бібліотеки. Ультразвукове фрагментування ДНК зазвичай необхідне під час етапу підготовки бібліотеки в робочих процесах NGS для фрагментування геномної ДНК на менші шматки, придатні для подальшої обробки та секвенування. Воно відіграє вирішальну роль у забезпеченні успіху експерименту з секвенуванням, генеруючи фрагменти ДНК відповідного діапазону розмірів для конкретної використовуваної платформи секвенування.

Секвенування нового покоління – Етапи процесу:

• Ультразвукове фрагментування ДНК: Перед конструюванням бібліотеки геномна ДНК фрагментується на менші, більш керовані шматки. Ультразвукове фрагментування полягає у використанні високочастотних звукових хвиль для зсуву молекул ДНК на фрагменти бажаного діапазону розмірів. Цей етап є вирішальним, оскільки він допомагає забезпечити, що прочитання секвенування, згенеровані пізніше, матимуть відповідну довжину для використовуваної платформи секвенування. Діапазон розмірів фрагментів можна налаштувати на основі конкретних вимог експерименту з секвенуванням.
• Клональне ампліфікування за допомогою ПЛР: Після ультразвукового фрагментування фрагменти ДНК зазнають репарації кінців, лігування адаптерів та ампліфікації ПЛР для отримання кінцевих бібліотек для секвенування ДНК. Ці етапи готують фрагментовані молекули ДНК до процесу секвенування, додаючи послідовності адаптерів, необхідні для зв’язування з платформою секвенування, та забезпечуючи сайти праймінгу для ампліфікації ПЛР.
• Секвенування ДНК методом синтезу: Після підготовки бібліотек для секвенування починається процес секвенування ДНК методом синтезу (SBS). Під час SBS послідовність ДНК визначається шляхом послідовного додавання нуклеотидів до комплементарного ланцюга. Цей етап включає циклічні реакції вбудовування нуклеотидів, візуалізації та розщеплення, що дозволяє визначити послідовність ДНК на основі флуоресцентних сигналів, які випромінюються вбудованими нуклеотидами.
• Масово-паралельне секвенування: На останньому етапі просторово розділені, ампліфіковані матриці ДНК секвенуються одночасно у масово-паралельному режимі. Цей підхід до секвенування з високою пропускною здатністю дозволяє генерувати мільйони або навіть мільярди прочитань секвенування за один цикл секвенування, забезпечуючи ефективне та швидке визначення послідовностей ДНК.

Як працює ультразвукове фрагментування ДНК?

Ультразвукова обробка, також відома як акустична обробка зразків, є широко використовуваним методом фрагментування ДНК. Для ультразвукового зсуву ДНК зразки піддаються дії ультразвукових хвиль за контрольованих умов. Принцип дії ультразвукового фрагментування ДНК базується на вібраціях та кавітації, що генеруються ультразвуковими хвилями. Зсувні сили, що виникають внаслідок ультразвукової (акустичної) кавітації, руйнують молекули ДНК з високою молекулярною масою. Параметри ультразвукової обробки, такі як інтенсивність (амплітуда, тривалість), режим імпульсної дії та температура, дозволяють здійснювати точне фрагментування ДНК до певної бажаної довжини фрагментів. Хоча за допомогою ультразвукової обробки ДНК часто зменшується до розміру 100–600 п.н., довші фрагменти ДНК до 1300 п.н. можна отримати при застосуванні м’якших умов ультразвукової обробки.

Контроль температури для запобігання деградації ДНК

Подвійна спіральна молекулярна форма ДНК дуже чутлива до підвищених температур, тому точний контроль температури під час етапів підготовки зразків є критичним фактором для отримання надійних результатів аналізу.
Незалежно від того, чи використовуєте ви зондові ультразвукові гомогенізатори Hielscher, VialTweeter чи UIP400MTP – безперервний моніторинг та контроль температури забезпечуються завдяки з’єднуваному температурному датчику та програмному забезпеченню розумного пристрою. Для підтримання температури в межах певного діапазону можна встановити верхню та нижню температурні межі. Отже, ультразвуковий гомогенізатор зупиниться щойно буде перевищено цю температурну межу, і автоматично відновить ультразвукову обробку, коли температура знизиться на встановлене значення ∆T.
Складне програмне забезпечення ультразвукових гомогенізаторів Hielscher забезпечує надійне підтримання ідеальних умов обробки зразків.

Масове фрагментування ДНК зразків за допомогою багатолункового ультразвукового гомогенізатора UIP400MTP

Кількість зразків у науках про життя значно зросла протягом останнього десятиліття. Це означає, що дуже велика кількість зразків (наприклад, 384, 1536 або 3456 лунок на мікропланшеті) повинна оброблятися під час підготовки зразків та аналізу в постійно рівних умовах, щоб отримати порівнянні та достовірні результати. З моделлю UIP400MTP компанія Hielscher Ultrasonics йде за трендом масової обробки зразків. UIP400MTP – це ультразвуковий обробник для підготовки зразків із використанням мікропланшетів. UIP400MTP може обробляти планшети з 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 або 3456 лунками. Залежно від типу мікропланшета, кожна лунка зазвичай може вміщувати об’єми зразків від десятків нанолітрів до кількох мілілітрів. Широко використовується в дослідженнях у науках про життя, UIP400MTP дуже часто застосовується для підготовки зразків перед аналізами, такими як ELISA (імуноферментний аналіз) або ПЛР, перед аналізом білків, а також для підготовки хроматину перед CHiP та CHiP-seq, ідентифікацією модифікацій гістонів та іншими аналітичними обробками (наприклад, гель-електрофорез, мас-спектрометрія).
Дізнайтеся більше про високоефективну обробку планшетів для ПЛР!

VialTweeter для підготовки зразків до 10 флаконів

VialTweeter – це широко використовуваний лабораторний ультразвуковий обробник VialTweeter, який дозволяє ефективно та зручно проводити ультразвукову обробку до 10 флаконів одночасно. Оскільки флакони та пробірки (наприклад, флакони Eppendorf, кріофлакони, центрифужні пробірки) піддаються ультразвуковій обробці опосередковано, будь-яке перехресне забруднення уникається. Оскільки однакова інтенсивність ультразвуку подається на кожен зразок, усі результати ультразвукової обробки є однорідними та відтворюваними. VialTweeter пропонує всі розумні функції, як і наші інші цифрові пристрої (наприклад, розумне меню, програмовані налаштування, контроль температури, дистанційне керування тощо), тому забезпечується найвищий комфорт для користувача.

Багатопальцеві зонди для мікропланшетів

Доступні для ультразвукових зондів-гомогенізаторів UP200Ht та UP200St, багатопальцеві зонди з 4 або 8 пальцями є зручним варіантом для ультразвукової обробки кількох зразків одночасно в однакових умовах. Наприклад, сонотрод MTP-24-8-96 – це восьмипальцевий зонд, який ідеально підходить для інтеграції в автоматизовані системи або ефективної ручної підготовки зразків у лунках багатолуночних планшетів. Багатопальцевий сонотрод ідеально підходить для автоматизованих лабораторій, де переважно обробляються хімічні стакани та пробірки за допомогою стандартного ультразвукового сонотрода. Багатопальцеві та стандартні зонди можна швидко замінити протягом кількох хвилин, перетворюючи однозондовий ультразвуковий обробник на багатозондовий ультразвуковий руйнівник.

Ультразвукові обробники Hielscher для фрагментації ДНК

Компанія Hielscher Ultrasonics пропонує різні платформи на основі ультразвуку для фрагментації ДНК, РНК та хроматину. Ці різні платформи включають ультразвукові зонди (сонотроди), рішення для опосередкованої ультразвукової обробки для одночасної підготовки кількох пробірок або багатолуночних планшетів (наприклад, 96-луночні планшети, мікротитраційні планшети), сонореактори та ультразвукові чашоподібні концентратори. Усі платформи для подрібнення ДНК працюють на основі високоефективних ультразвукових процесорів із налаштованою частотою, які точно контролюються та забезпечують відтворювані результати.

Ультразвукові процесори для будь-якої кількості та розміру зразків

Завдяки багатозразковим ультразвуковим обробникам Hielscher VialTweeter (для до 10 пробірок) та UIP400MTP (для мікропланшетів/багатолуночних планшетів) стає легко можливим скоротити час обробки зразків завдяки інтенсивній та точно контрольованій ультразвуковій обробці, одночасно отримуючи бажаний розподіл розмірів фрагментів ДНК та вихід. Ультразвукова фрагментація ДНК робить підготовку зразків ефективною, надійною та масштабованою. Протоколи можна лінійно масштабувати від одного до численних зразків, застосовуючи постійно контрольований ультразвук.
Зондові ультразвукові обробники з одним-п’ятьма пальцями ідеально підходять для підготовки меншої кількості зразків. Лабораторні ультразвукові обробники Hielscher доступні в різних розмірах, тому ми можемо порекомендувати вам ідеальний пристрій для вашого застосування та вимог.

Точне управління процесом

Точно контрольовані параметри ультразвукової обробки є критично важливими, оскільки надмірна ультразвукова обробка може пошкодити ДНК, РНК та хроматин, а недостатнє ультразвукове зсувне руйнування призводить до утворення занадто довгих фрагментів ДНК та хроматину. Цифрові ультразвукові гомогенізатори Hielscher можна легко налаштувати на точні параметри ультразвукової обробки. Конкретні налаштування ультразвукової обробки також можна зберегти як програмовані параметри для швидкого повторення тієї ж процедури.
Усі сеанси ультразвукової обробки автоматично протоколюються та зберігаються у форматі CSV-файлу на вбудованій SD-картці. Це дозволяє вести точну документацію виконаних випробувань та легко переглядати сеанси ультразвукової обробки.
За допомогою дистанційного керування через браузер усі цифрові ультразвукові гомогенізатори можна експлуатувати та контролювати через будь-який стандартний браузер. Встановлення додаткового програмного забезпечення не потрібне, оскільки LAN-з’єднання дозволяє виконати дуже просту конфігурацію plug-n-play.


Найвища зручність використання при підготовці зразків за допомогою ультразвуку

Усі ультразвукові гомогенізатори Hielscher розроблені для забезпечення високопродуктивного ультразвуку, водночас залишаючись дуже зручними та простими в експлуатації. Усі налаштування чітко структуровані в зрозумілому меню, до якого можна легко отримати доступ через кольоровий сенсорний дисплей або дистанційне керування через браузер. Розумне програмне забезпечення з програмованими налаштуваннями та автоматичним записом даних забезпечує оптимальні параметри ультразвукової обробки для надійних та відтворюваних результатів. Чистий та простий у використанні інтерфейс меню перетворює ультразвукові гомогенізатори Hielscher на зручні та ефективні пристрої.
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність обробки наших лабораторних ультразвукових гомогенізаторів, які ідеально підходять для таких завдань підготовки зразків, як фрагментація ДНК та РНК, руйнування клітин, а також екстракція білків: