Лізіс клітин BL21 за допомогою ультразвуку

Клітини BL21 є штамом E. coli, який широко використовується в дослідницьких лабораторіях, біотехнології та промисловому виробництві завдяки їхній здатності ефективно експресувати білки. Ультразвукове руйнування клітин, лізіс та екстракція білків є загальноприйнятим методом ізоляції та збору цільових білків з внутрішнього середовища клітин BL21. Ультразвукова обробка повністю руйнує клітину та вивільняє всі захоплені білки, роблячи 100% білка доступним.

Клітини BL21 для експресії білків

Клітина BL21 – це хімічно компетентний бактеріальний штам E. coli, придатний для трансформації та експресії білків на високому рівні з використанням системи індукції T7 РНК-полімераза-IPTG. Клітини BL21 дозволяють здійснювати експресію білків з високою ефективністю будь-якого гена, який контролюється промотором T7. Штам E. coli BL21(DE3) є штамом для виробництва білків на основі T7 РНК-полімерази, поєднаним з експресійними векторами на основі промотора T7, і широко застосовується в лабораторіях та промисловості для виробництва рекомбінантних білків. У BL21(DE3) експресія гена, що кодує рекомбінантний білок, транскрибується хромосомно закодованою T7 РНК-полімеразою (T7 RNAP), яка транскрибується в вісім разів швидше, ніж звичайна E. coli RNAP. Це робить штам BL21(DE3) надзвичайно ефективним і перетворює його на одну з найбільш бажаних клітинних систем для експресії білків.

Протокол ультразвукового лізісу та екстракції білків з клітин BL21

Лізіс клітин BL21 переважно здійснюється за допомогою ультразвуку в поєднанні з лауроїлсаркозинатом натрію (також відомим як саркозил) як буфером для лізісу. Переваги ультразвукового руйнування клітин та екстракції білків полягають у надійності, відтворюваності, а також простоті, безпеці та швидкості роботи ультразвукових апаратів. Наведений нижче протокол дає покрокові вказівки щодо ультразвукового лізісу клітин BL21:

• Щоб видалити шаперонні білки, бактеріальні пелети BL21 ресуспендували в 50 ml холодної буферної суміші Sodium Tris-EDTA (STE) (що складається з 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, доповненої 100 mM PMSF).
• Потім додають 500 мкл лізоциму (10 мг/мл), і клітини інкубують на льоду протягом 15 хв.
• Після цього додають 500 ul DTT та 7 ml саркозилу (10% (w/v), приготованого в буфері STE).
• Вкрай важливо підтримувати всі буфери для очищення на льоду та тримати зразки на льоду весь час. Усі етапи очищення слід проводити в холодильній камері, якщо це можливо.



• Для ультразвукового лізісу та екстракції білків зразки піддають ультразвуковій обробці в VialTweeter MultiSample Ultrasonicator протягом 4 x 30 с при 100% амплітуді з інтервалом 2 хв між кожною ультразвуковою обробкою. Альтернативно можна використовувати ультразвуковий гомогенізатор зондового типу з мікронасадкою, наприклад, UP200Ht з S26d2 (3 x 30 с, пауза 2 хв між ультразвуковими циклами, 80% амплітуди).
• Для подальших етапів очищення зразки необхідно тримати на льоду або, альтернативно, зберігати при -80°C до подальшої обробки.

Ультразвуковий лізіс під точним контролем температури

Точний та надійний контроль температури є критично важливим при роботі з біологічними зразками. Високі температури ініціюють термічно-індуковану деградацію білків у зразках.
Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова обробка створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні VialTweeter. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх підготовки за допомогою VialTweeter та VialPress для аналізу.

1. Моніторинг температури зразка: Ультразвуковий процесор UP200St, який приводить в дію VialTweeter, оснащений інтелектуальним програмним забезпеченням та знімним температурним датчиком. Підключіть температурний датчик до UP200St і вставте наконечник датчика в одну з пробірок для зразків. За допомогою цифрового кольорового сенсорного дисплея ви можете в меню UP200St встановити конкретний температурний діапазон для ультразвукової обробки вашого зразка. Ультразвуковий обробник автоматично зупиниться, коли буде досягнута максимальна температура, і зробить паузу, доки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленого діапазону ∆. Потім ультразвукова обробка автоматично відновиться. Ця розумна функція запобігає термічній деградації.
2. Блок VialTweeter можна попередньо охолодити. Помістіть блок VialTweeter (лише сонотрод без перетворювача!) у холодильник або морозильну камеру, щоб попередньо охолодити титановий блок; це допомагає відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо можливо, сам зразок також можна попередньо охолодити.
3. Використовуйте сухий лід для охолодження під час ультразвукової обробки. Використовуйте неглибокий піддон, заповнений сухим льодом, і розмістіть VialTweeter на льоду, щоб тепло могло швидко розсіюватися.

Клієнти у всьому світі використовують VialTweeter та VialPress для щоденної підготовки зразків у біологічних, біохімічних, медичних та клінічних лабораторіях. Завдяки інтелектуальному програмному забезпеченню та контролю температури процесора UP200St температура надійно контролюється, а термічна деградація зразків запобігається. Підготовка зразків за допомогою ультразвуку з VialTweeter та VialPress забезпечує високонезалежні та відтворювані результати!

Знайдіть оптимальний ультразвуковий руйнівник для вашого застосування лізису

Hielscher Ultrasonics є досвідченим виробником високоефективних ультразвукових руйнівників клітин та гомогенізаторів для лабораторій, настільних та промислових систем. Розмір вашої бактеріальної клітинної культури, ваші дослідницькі або виробничі цілі та обсяг клітин, які потрібно обробити за годину або день, є важливими факторами для вибору правильного ультразвукового руйнівника клітин для вашого застосування.
Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні рішення для одночасної ультразвукової обробки мультизразків (до 10 пробірок за допомогою VialTweeter) та масових зразків (наприклад, мікротитр-планшетів / планшетів ELISA за допомогою UIP400MTP), а також класичних лабораторних ультразвукових обробників зондового типу з різною потужністю від 50 до 400 ват до повністю промислових ультразвукових процесорів з потужністю до 16 000 ват на одиницю для комерційного руйнування клітин та екстракції білків у великому виробництві. Всі ультразвукові обробники Hielscher розроблені для роботи 24/7/365 під повним навантаженням. Надійність та стабільність є ключовими характеристиками наших ультразвукових пристроїв.
Всі цифрові ультразвукові гомогенізатори оснащені розумним програмним забезпеченням, кольоровим сенсорним дисплеєм та автоматичним протоколюванням даних, що перетворює ультразвуковий пристрій на зручний робочий інструмент у лабораторних та виробничих умовах.
Повідомте нам, які саме клітини, який обсяг, з якою частотою та з якою метою вам потрібно обробляти ваші біологічні зразки. Ми порекомендуємо вам найбільш підходящий ультразвуковий руйнівник клітин для ваших технологічних вимог.

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність обробки наших ультразвукових систем від компактних ручних гомогенізаторів та мультизразкових ультразвукових обробників до промислових ультразвукових процесорів для комерційних застосувань:

Література / Посилання

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.