Лізис клітин BL21 методом ультразвуку
Клітини BL21 – це штам кишкової палички, який широко використовується в науково-дослідних лабораторіях, біотехнології та промисловому виробництві завдяки своїй здатності високоефективно експресувати білки. Ультразвукове руйнування клітин, лізис та екстракція білків є поширеним методом виділення та збору цільових білків із клітинної внутрішньої частини клітин BL21. Ультразвук повністю порушує роботу клітини і вивільняє всі захоплені білки, роблячи 100% білка доступним.
Клітини BL21 для експресії білка
Клітина BL21 – це хімічно компетентний штам бактерій E. coli, придатний для трансформації та експресії білка високого рівня за допомогою системи індукції РНК-IPTG РНК Т7. Клітини BL21 дозволяють високоефективно експресувати білок будь-якого гена, який знаходиться під контролем промотора Т7. Штам E. coli BL21(DE3) – це штам виробництва білків на основі полімерази РНК Т7 у поєднанні з векторами експресії на основі промотора Т7 і широко застосовується в лабораторіях і промисловості для виробництва рекомбінантних білків. У BL21(DE3) експресія гена, що кодує рекомбінантний білок, транскрибується хромосомно закодованою РНК-полімеразою Т7 (T7 RNAP), яка транскрибує у вісім разів швидше, ніж звичайна РНКП E. coli. Це робить штам BL21(DE3) високоефективним і перетворює його на одну з найбільш бажаних клітинних систем експресії білків.
Протокол ультразвукового лізису та екстракції білка з клітин BL21
Лізис клітин BL21 в основному виконується за допомогою ультразвуку в комбінації з лауроілсаркозинатом натрію (також відомим як саркозил) в якості лізисного буфера. Переваги ультразвукового руйнування клітин і екстракції білка полягають в надійності, відтворюваності, а також простому, безпечному і швидкому використанні ультразвукових апаратів. Наведений нижче протокол дає покрокову інструкцію для ультразвукового лізису клітин BL21:
- Для видалення білків шаперону бактеріальні гранули BL21 були ресуспендовані в 50 мл крижаного буфера Sodium Tris-EDTA (STE) (що складається з 10 мМ Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl з додаванням 100 мМ PMSF).
- При цьому додають 500 мл лізоциму (10 мг? мл) і інкубують клітини на льоду протягом 15 хв.
- Після цього додається 500 мл DTT і 7 мл саркосилу (10% (w/v) у складі STE-буфера).
- Важливо тримати всі очисні буфери в крижаному стані та постійно підтримувати зразки на льоду. Всі етапи очищення повинні проводитися по можливості в холодному приміщенні.
- Для ультразвукового лізису та екстракції білка зразки піддають ультразвуку в Ультразвуковий апарат VialTweeter MultiSample протягом 4 х 30 сек з 100% амплітудою з інтервалом 2 хв між кожною звуковою допомогою. Крім того, ультразвуковий гомогенізатор зондового типу з мікронаконечником, наприклад, UP200Ht з S26d2 (3 х 30 сек, 2 хв. пауза між ультразвуковими циклами, амплітуда 80%).
- Для подальших етапів очищення зразки необхідно тримати на льоду або зберігати при -80°C до подальшої обробки.
Ультразвуковий руйнівник клітин UP200St з мікронаконечником S26d2 для лізису та екстракції білка
Ультразвуковий лізис під контролем температури Prescise
Точний і надійний контроль температури має вирішальне значення при обробці біологічних зразків. Високі температури ініціюють термічно індуковану деградацію білка в зразках.
Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова діагностика створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні VialTweeter. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх приготування за допомогою VialTweeter та VialPress для аналізу.
- Моніторинг температури зразка: Ультразвуковий процесор UP200St, який керує VialTweeter, оснащений інтелектуальним програмним забезпеченням і датчиком температури, що підключається. Підключіть датчик температури до UP200St і вставте наконечник датчика температури в одну з пробірок для зразка. За допомогою цифрового кольорового сенсорного дисплея Ви можете встановити в меню UP200St конкретний температурний діапазон для Вашого зразка ультразвукового випромінювання. Ультразвуковий датчик автоматично зупиниться, коли буде досягнута максимальна температура, і зупиниться, поки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленої температури ∆. Потім УЗД знову починається автоматично. Ця інтелектуальна функція запобігає деградації через нагрівання.
- Блок VialTweeter можна попередньо охолодити. Покладіть блок VialTweeter (тільки сонотроде без датчика!) в холодильник або морозильну камеру, щоб попереднє охолодження титанового блоку допомогло відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо є можливість, то і сам зразок можна попередньо охолодити.
- Використовуйте сухий лід для охолодження під час ультразвуку. Використовуйте неглибокий лоток, наповнений сухим льодом, і покладіть VialTweeter на лід, щоб тепло могло швидко розсіюватися.
Клієнти по всьому світу використовують VialTweeter і VialPress для щоденної роботи з підготовки зразків в біологічних, біохімічних, медичних і клінічних лабораторіях. Інтелектуальне програмне забезпечення та контроль температури процесора UP200St забезпечують надійний контроль температури та дозволяють уникнути деградації зразка, спричиненої нагріванням. Ультразвукова підготовка зразків за допомогою VialTweeter і VialPress забезпечує високу надійність і відтворюваність результатів!
Знайдіть оптимальний ультразвуковий руйнівник для вашого застосування Lysis
Hielscher Ultrasonics є багаторічним досвідченим виробником високоефективних руйнівників ультразвукових клітин і гомогенізаторів для лабораторій, настільних і промислових масштабних систем. Розмір культури бактеріальних клітин, ваша мета дослідження або виробництва, а також обсяг клітин для обробки за годину або день є важливими факторами для пошуку правильного ультразвукового руйнівника клітин для вашого застосування.
Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для одночасного ультразвукового дослідження декількох зразків (до 10 флаконів з VialTweeter) і масових зразків (тобто мікротитрові пластини? ELISA пластини з UIP400MTP), а також класичний лабораторний ультразвуковий апарат зондового типу з різними рівнями потужності від 50 до 400 Вт до повністю промислових ультразвукових процесорів потужністю до 16 000 Вт на одиницю для комерційного руйнування клітин і екстракції білка на великому виробництві. Всі ультразвукові апарати Hielscher розраховані на роботу 24/7/365 при повному навантаженні. Міцність і надійність є основними характеристиками наших ультразвукових пристроїв.
Всі цифрові ультразвукові гомогенізатори оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням, кольоровим сенсорним дисплеєм і автоматичним протоколізацією даних, що перетворює ультразвуковий апарат в зручний робочий інструмент в лабораторіях і виробничих приміщеннях.
Повідомте нам, що це за клітини, який обсяг, з якою частотою і з якою метою ви повинні обробляти свої біологічні зразки. Ми порекомендуємо вам найбільш підходящий руйнівник ультразвукових елементів для ваших вимог процесу.
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових систем від компактних ручних гомогенізаторів і ультразвукових пристроїв MultiSample до промислових ультразвукових процесорів для комерційного застосування:
| Об'єм партії | Витрата | Рекомендовані пристрої |
|---|---|---|
| 96-лункові? мікротитрові пластини | Н.А. | UIP400MTP |
| 10 флаконів по 0,5 до 1,5 мл | Н.А. | VialTweeter на UP200St |
| 0від .01 до 250 мл | Від 5 до 100 мл/хв | UP50H |
| 0від .01 до 500 мл | Від 10 до 200 мл/хв | UP100H |
| Від 10 до 2000 мл | Від 20 до 400 мл/хв | UP200Ht, UP400St |
| 0від 1 до 20 л | 0від .2 до 4 л/хв | UIP2000HDT |
| Від 10 до 100 л | Від 2 до 10 л/хв | UIP4000HDT |
| Н.А. | Від 10 до 100 л/хв | UIP16000 |
| Н.А. | Більше | кластер UIP16000 |
Зв'яжіться з нами!? Запитайте нас!
UIP400MTP пластинчастий ультразвуковий апарат для високопродуктивного руйнування комірок у 96-лункових пластинах
Ультразвуковий апарат UP200Ht з мікронаконечником 2 мм S26d2 для ультразвукового дослідження невеликих зразків
Дізнайтеся більше про те, як ви можете використовувати свій ультразвуковий гомогенізатор тканин для ефективного та надійного приготування буферних розчинів!
Факти, які варто знати
Бактерії кишкової палички
Escherichia coli – це тип бактерій, який є неспороутворюючим, грамнегативним і характеризується формою прямої палички. Бактерії E.coli присутні в навколишньому середовищі, продуктах харчування і кишечнику людини і тварин. Кишкова паличка зазвичай рухлива за допомогою перитрихових джгутиків, але існують і нерухливі типи. E.coli є так званими факультативно анаеробними хемоорганотрофними організмами, що означає, що вони здатні як до дихального, так і до ферментативного обміну. Більшість типів E.coli є доброякісними та виконують корисні функції в організмі, наприклад, пригнічують ріст шкідливих видів бактерій, синтезують вітаміни тощо.
Клітини бактерій Escherichia coli так званого типу В є особливою категорією штамів E.coli, які широко використовуються в дослідженнях для вивчення таких механізмів, як чутливість бактеріофагів або системи рестрикції-модифікації. Крім того, бактерії E.coli цінуються як надійна робоча конячка для експресії білка в біотехнологічних лабораторіях і лабораторіях наук про життя. Наприклад, E.coli використовуються для синтезу таких сполук, як білки та олігосахариди в промислових масштабах. У зв'язку зі специфічними особливостями, такими як дефіцит протеази, низька продукція ацетату при високому рівні глюкози та підвищена проникність, клітини E. coli B найчастіше використовуються клітинами-хазяїнами для виробництва генетично модифікованих білків.
Рекомбінантний білок
Рекомбінантні білки (rProt) набувають значного значення в багатьох галузях, включаючи хімічне виробництво, фармацевтичну, косметичну, людську та тваринну медицину, сільське господарство, харчову промисловість, а також промисловість з переробки відходів.
Отримання рекомбінантного білка вимагає використання системи експресії. В якості експресуючих клітинних систем для виробництва рекомбінантної ДНК можуть використовуватися як прокаріотичні, так і еукаріотичні клітини. У той час як бактеріальні клітини найбільш широко використовуються для експресії білка завдяки таким факторам, як низька вартість, легка масштабованість і прості умови середовища, ссавці, дріжджі, водорості, комахи та безклітинні системи є визнаними альтернативами. Тип білка, функціональна активність, а також необхідний вихід експресованого білка впливають на підбір клітинної системи, що використовується для експресії білка.
Для того, щоб експресувати рекомбінантний білок, певна клітина повинна бути перетворена на вектор ДНК, що містить матрицю рекомбінантної ДНК. Потім клітини, трансфіковані за допомогою матриці, культивуються. Як наслідок клітинного механізму, клітини транскрибують і транслюють білок, що цікавить, тим самим виробляючи цільовий білок.
Оскільки експресовані білки потрапляють у клітинний матрикс, клітина повинна бути лізована (порушена та зламана), щоб вивільнити білки. На наступному етапі очищення білок відокремлюється і очищається.
The first recombinant protein used in treatment was recombinant human insulin in 1982. Today, more than 170 types of recombinant protein are produced worldwide for medical treatments. Commonly used recombinant proteins used in medicine are for instance recombinant hormones, interferons, interleukins, growth factors, tumor necrosis factors, blood clotting factors, thrombolytic drugs, and enzymes for treating major diseases such as diabetes, dwarfism, myocardial infarction, congestive heart failure, cerebral apoplexy, multiple sclerosis, neutropenia, thrombocytopenia, anemia, hepatitis, rheumatoid arthritis, asthma, Crohn’s disease, and cancers therapies. (cf. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Література? Список літератури
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Звукорежисер VialTweeter для одночасного ультразвукового дослідження 10 зразків, наприклад, для руйнування клітин BL21
High performance ultrasonics! Hielscher’s product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.