Протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 з про sonication

Hielscher VialTweeter - це унікальний ультразвуковий багатопробивний блок підготовки, який використовується для інактивації коронавірусу SARS-COV-2. VialTweeter дозволяє підготувати до 10 зразків флаконів одночасно і тим самим є ідеальним блоком для обробки маси зразків.

Інактивація коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою vialTweeter

Після видалення фіксатора моношари тричі милися фосфатно-буферизованим сольовим розчином (PBS) перед зішкрібати клітини на 1мл МЕМ/5% FBS і ультразвуковим (3 × 10 секунд на, 10 секунд на 100% потужності та амплітуді) за допомогою ультразвукового процесора Hielscher UP200St з Віалтвч Вкладення. Супернатанти були уточнені центрифугою в 3000 × г протягом 10 хв. 

Читайте повний протокол тут для інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 від Welch et al. (2020) нижче:

Клітини і віруси

Клітини Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) були прокультурні в модифікованому мінімально необхідному середовищі Eagle (MEM), доповненому 10% (v/v) сироватка для телят плода (ФМС). Вірусом, який використовувався, був штам SARS-CoV-2 HCOV-19/England/2/2020, виділений PHE з першого кластера пацієнтів у Великобританії 29/01/2020. Цей вірус був отриманий при проході 1 і використовувався для інактиваційних досліджень при проході 2 або 3.
Для реагентів і хімічних речовин, що використовуються для інактивації SARS-CoV-2, а також видалення цитотоксичності реагенту, будь ласка, дивіться науковий звіт Welch et al. (2020).

Інактивація вірусу миючими засобами – Протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 від Welch et al. 2020

Інактивація SARS-CoV-2

Для комерційних продуктів, препарати для вірусу (рідина для культури тканин, титри від 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ ПФУ/мл) лікувалися в триплікаті реагентами при концентраціях і в контактний час, рекомендований в інструкції виробників до використання, де це доступно, або для концентрацій і часу, спеціально запитуваних випробувальними лабораторіями. Там, де виробник дав ряд концентрацій, було протестовано найнижче співвідношення продукту до зразка (тобто найнижча рекомендована концентрація тестового продукту). Зразки транспортних реагентів трубки були протестовані за допомогою співвідношення одного об'єму рідини для культури тканин до десяти томів реагенту, якщо виробник не вказав об'ємне співвідношення проби рідини до реагенту. Миючі засоби, фіксатори та розчинники перевірялися за вказаними концентраціями протягом зазначеного часу. Всі інактиваційні кроки були виконані при температурі навколишнього середовища (18 - 25 ° C). Для тестування альтернативних типів зразків вірус шипнув у вказану матрицю зразка у співвідношенні 1:9, потім обробив тестовими реагентами, як зазначено вище. Всі експерименти включали триплікатні контрольні макетні зразки з еквівалентним об'ємом PBS замість тестового реагенту. Відразу після необхідного часу контакту, 1мл обробленого зразка було оброблено за допомогою відповідно відібраної матриці фільтрації. Видалення реагенту для інактиваційного тестування було проведено у більшому форматі лічильника за допомогою Pierce 4mL Миючий засіб Видалення лічильника Колони (Термо Фішер), або шляхом заповнення порожніх Пірс 10mL ємність центрифуг стовпців (Термо Фішер) з SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR або Sephadex LH-20, щоб дати 4mL упаковані бісер / смоли. Для очищення за допомогою фільтрів Amicon було очищено 2 × зразків 500 мкл за допомогою двох відцентрних фільтрів методом, раніше описаним, а потім об'єднавшись. Для формальдегіду і формальдегіду з видаленням глютаральдегіду був використаний один фільтр з об'ємом зразка 1× 500 мкл, повторно використаний після обробки в 500 мкл PBS, і доданий до 400ul MEM / 5% FBS. Для інактивації інфікованих моношари, 12,5 см² колба клітин Vero E6 (2,5 × 10⁶ клітини/колби в 2,5 мл МЕМ/5% ФБС) були інфіковані на МОІ 0,001 і інкубовані при 37°C/5% CO₂ протягом 24 годин. Супернатик був видалений, а клітини фіксуються за допомогою 5мл формальдегіду, або формальдегіду і глутаральдегіду при кімнатній температурі протягом 15 або 60 хв. Фіксатор був видалений, і моношари тричі милися з PBS, перш ніж зішкребти клітини в 1mL MEM / 5% FBS і ультразвукові (3 × 10 секунд на, 10 секунд на 100% потужності та амплітуди) за допомогою UP200St з насадками VialTweeter (Технологія ультразвуку Hielscher). Супернатанти були уточнені центрифугою в 3000 × г протягом 10 хв.

Деталі реагенту, який використовується для інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 з ультразвуковим VialTweeter згідно протоколу Welch et al. 2020

Повний протокол, включаючи використання Hielscher VialTweeter можна знайти тут:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Складні ультразвукові дисмембративи та руйнівники клітин

Мультипробивний ультразвуковий апарат VialTweeter є лише одним з багатьох ультразвукових рішень для підготовки зразків у біологічній, біохімічній та клінічній лабораторіях. Hielscher Ultrasonics пропонує ідеальний ультразвуковий дисмембратор для вашого застосування, наприклад, лізис клітин, видалення клітин, гомогенізація тканин, солюбілізація лізату, розчинення, дегазація зразків тощо.
Дайте нам знати, скільки зразків ви повинні обробляти на годину і день, якщо ви віддаєте перевагу пряму або непряму ультразвукову ультразвукову обробку зразків. Ми порекомендували вам найбільш підходящий ультразвуковий блок для вашого повсякденного робочого дня!
Цифрові ультразвукові процесори Hielscher Ultrasonics оснащені розумним програмним забезпеченням, автоматичним записом даних, простими параметрами попереднього налаштування контролю температури, тривалістю ультразвукової обробки, режимом циклу / пульсу, а також підсвічуванням зразків та пультом дистанційного керування браузера. Ми прагнемо зробити наші ультразвукові пристрої максимально розумними, щоб ваші дослідження і робоча рутина ставав максимально зручними і успішними.
Натисніть тут, щоб знайти більше додатків, включаючи протоколи ультразвукової підготовки зразків з VialTweeter!