Протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою ультразвукового апарату

Hielscher VialTweeter – це унікальний ультразвуковий блок для підготовки кількох зразків, який використовується для інактивації коронавірусу SARS-COV-2. VialTweeter дозволяє готувати до 10 флаконів для зразків одночасно і тим самим є ідеальною одиницею для масової обробки зразків.

Інактивація коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою VialTweeter

Після видалення фіксатора моношари тричі промивали фосфатно-буферизованим фізіологічним розчином (PBS) перед вишкрібанням клітин у 1 мл MEM/5% FBS та проводили ультразвукове дослідження (3 × 10 секунд, 10 секунд вимкнено при 100% потужності та амплітуді) за допомогою ультразвукового процесора Hielscher UP200St з VialTweeter Вкладення. Супернатанти освітлювали центрифугуванням при 3000 × г протягом 10 хв. 

Повний протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 від Welch et al. (2020) читайте нижче:

Клітини і вірус

Елементи Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) культивували в модифікованому мінімальному ефірному середовищі (MEM) Eagle, доповненому 10% (об/об) сироваткою фетальних телят (FCS). Використовувався вірус штаму SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, виділений PHE з першого кластера пацієнтів у Великій Британії 29.01.2020. Цей вірус був отриманий при пасажі 1 і використовувався для досліджень інактивації при пасажі 2 або 3.
Щодо реагентів та хімічних речовин, які використовуються для інактивації SARS-CoV-2, а також видалення цитотоксичності реагентів, дивіться науковий звіт Welch et al. (2020).

Інактивація вірусу миючими засобами – Протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 від Welch et al. 2020

Інактивація SARS-CoV-2

Для товарних препаратів - препаратів вірусів (рідина для культивування тканин, титри від 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ БУО/мл) обробляли в трьох примірниках реагентами в концентраціях і протягом часу контакту, рекомендованих в інструкціях виробників по застосуванню, де вони є, або для концентрацій і часу, спеціально вимаганих випробувальними лабораторіями. Якщо виробник вказав діапазон концентрацій, було перевірено найнижче співвідношення продукту до зразка (тобто найнижча рекомендована концентрація досліджуваного продукту). Реагенти для транспортування зразків перевірялися з використанням співвідношення одного об'єму рідини для культивування тканин до десяти об'ємів реагенту, якщо відношення об'єму рідини для зразка до реагенту не було визначено виробником. Миючі засоби, фіксатори та розчинники були випробувані в зазначених концентраціях за вказаний час. Всі етапи інактивації проводилися при кімнатній температурі навколишнього середовища (18 – 25 ° C). Для тестування альтернативних типів зразків вірус вводили в зазначену матрицю зразка у співвідношенні 1:9, а потім обробляли тестовими реагентами, як зазначено вище. Всі експерименти включали триплікатні контрольні зразки, оброблені макетами, з еквівалентним об'ємом PBS замість тестового реагенту. Відразу після необхідного часу контакту 1 мл обробленого зразка було оброблено за допомогою відповідним чином підібраної фільтраційної матриці. Видалення реагентів для тестування на інактивацію проводилося у форматі більшої спінової колонки з використанням спін-колонок Pierce 4mL Detergent Removal (Thermo Fisher) або шляхом заповнення порожніх центрифужних колонок Pierce ємністю 10 мл (Thermo Fisher) біокульками SM2, Sephacryl S-400HR або Sephadex LH-20 для отримання 4 мл упакованих кульок/смоли. Для очищення за допомогою фільтрів Amicon 2 × зразки по 500 мкл були очищені за допомогою двох відцентрових фільтрів за раніше описаним методом, а потім об'єднані разом. Для формальдегіду та формальдегіду з видаленням глутарового альдегіду використовувався один фільтр з об'ємом зразка 1× 500 мкл, повторно суспендований після обробки в 500 мкл PBS і доданий до 400ul MEM/5% FBS. Для інактивації інфікованих моношари, 12,5 см² колби осередків Vero E6 (2,5 × 10⁶ клітини/колба в 2,5 мл MEM/5% FBS) були інфіковані при MOI 0,001 та інкубовані при 37 °C/5% CO₂ протягом 24 годин. Супернатант видаляли, а клітини фіксували за допомогою 5 мл формальдегіду, або формальдегіду та глутарового альдегіду при кімнатній температурі протягом 15 або 60 хвилин. Фіксатор був видалений, а моношари тричі промили PBS перед вишкрібанням клітин в 1 мл MEM/5% FBS і провели ультразвукове дослідження (3 × 10 секунд включено, 10 секунд вимкнено при 100% потужності та амплітуді) за допомогою UP200St з насадкою VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Супернатанти освітлювали центрифугуванням при 3000 × г протягом 10 хв.

Деталі реагенту, який використовується для інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою ультразвукового VialTweeter за протоколом Welch et al. 2020

Повний протокол, включаючи використання Hielscher VialTweeter, можна знайти тут:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Складні ультразвукові дисмембреатори та руйнівники клітин

Мультизразковий ультразвуковий апарат VialTweeter – це лише одне з багатьох ультразвукових рішень для підготовки зразків у біологічних, біохімічних та клінічних лабораторіях. Hielscher Ultrasonics пропонує ідеальний ультразвуковий дезмебратор для вашого застосування, наприклад, лізису клітин, екстракції клітин, гомогенізації тканин, розчинення лізату, розчинення, дегазації зразків тощо.
Повідомте нам, скільки зразків вам потрібно обробляти за годину та день, якщо ви віддаєте перевагу прямому чи непрямому ультразвуковому унесенню та яка мета лікування ультразвуковими зразками. Ми порекомендуємо Вам найбільш підходящий ультразвуковий апарат для Вашої щоденної роботи!
Цифрові ультразвукові процесори Hielscher Ultrasonics оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням, автоматичним записом даних, легкими можливостями попереднього налаштування для контролю температури, тривалості ультразвуку, циклічного/імпульсного режиму, а також підсвічуванням зразків і дистанційним керуванням браузером. Ми прагнемо зробити наші ультразвукові прилади максимально розумними, щоб ваші дослідження та робота стали максимально зручними та успішними.
Натисніть тут, щоб знайти більше програм, включаючи протоколи підготовки ультразвукових зразків за допомогою VialTweeter!