Протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою ультразвукової обробки

Hielscher VialTweeter – це унікальний ультразвуковий блок для підготовки кількох проб, який використовується для інактивації коронавірусу SARS-COV-2. VialTweeter дає змогу готувати до 10 пробних флаконів одночасно і тому є ідеальним пристроєм для масової обробки проб.

Інактивація коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою VialTweeter

Після видалення фіксатора моношари тричі промивали фосфатно-солевим буфером (PBS), після чого клітини зіскрібали в 1mL MEM/5% FBS і піддавали ультразвуковій обробці (3 × 10 секунд увімкнення, 10 секунд вимкнення при 100% потужності та амплітуді) з використанням ультразвукового процесора Hielscher UP200St з VialTweeter як насадкою. Супернатанти освітлювали центрифугуванням при 3000 × g протягом 10 хв. Повний протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 за Welch et al. (2020) читайте тут нижче:

Клітини та вірус

Клітини Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) культивували в модифікованому мінімальному живильному середовищі Ігла (MEM) з додаванням 10% (v/v) фетальної телячої сироватки (FCS). Використовували вірус SARS-CoV-2 штаму hCOV-19/England/2/2020, виділений PHE від першого кластера пацієнтів у Великій Британії 29/01/2020. Цей вірус було отримано на пасажі 1 і використано для досліджень інактивації на пасажі 2 або 3.
Щодо реагентів і хімічних речовин, використаних для інактивації SARS-CoV-2, а також щодо видалення цитотоксичності реагентів див. науковий звіт Welch et al. (2020).

Інактивація вірусу детергентами – протокол інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 за Welch et al. 2020

Інактивація SARS-CoV-2


Для комерційних продуктів препарати вірусу (рідина тканинної культури, титри в діапазоні від 1 × 10⁶ до 1 × 10⁸ PFU/ml) обробляли у трьох повторах реагентами в концентраціях і протягом часу контакту, рекомендованих в інструкції виробника із застосування, де такі були доступні, або в концентраціях і протягом часу, спеціально запитаних випробувальними лабораторіями. Якщо виробник зазначав діапазон концентрацій, випробовували найнижче співвідношення продукту до проби (тобто найнижчу рекомендовану концентрацію випробовуваного продукту). Реагенти пробірок для транспортування зразків випробовували у співвідношенні один об’єм рідини тканинної культури до десяти об’ємів реагенту, якщо виробник не зазначав іншого об’ємного співвідношення рідини проби до реагенту. Детергенти, фіксатори та розчинники випробовували у зазначених концентраціях протягом зазначеного часу. Усі етапи інактивації виконували за температури навколишнього приміщення (18 – 25°C). Для випробування альтернативних типів проб вірус вносили в зазначену матрицю проби у співвідношенні 1:9, після чого обробляли випробовуваними реагентами, як описано вище. Усі експерименти включали контрольні проби з імітаційною обробкою у трьох повторах з еквівалентним об’ємом PBS замість випробовуваного реагенту. Безпосередньо після необхідного часу контакту 1mL обробленої проби обробляли з використанням відповідно підібраної фільтраційної матриці. Видалення реагентів для випробувань інактивації виконували у форматі більших спін-колонок з використанням Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) або шляхом заповнення порожніх центрифужних колонок Pierce об’ємом 10mL (Thermo Fisher) гранулами SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR чи Sephadex LH-20 до отримання 4mL упакованих гранул/смоли. Для очищення з використанням фільтрів Amicon 2 × 500μl проби очищали двома центрифужними фільтрами за раніше описаним методом, після чого об’єднували. Для видалення формальдегіду та формальдегіду з глутаральдегідом використовували один фільтр з об’ємом проби 1× 500μl, яку після обробки ресуспендували у 500μl PBS і додавали до 400ul MEM/5% FBS. Для інактивації інфікованих моношарів у колбах площею 12,5 cm² з клітинами Vero E6 (2,5 × 10⁶ клітин/колбу у 2,5mL MEM/5% FBS) їх інфікували при MOI 0,001 та інкубували за 37°C/5% CO₂ протягом 24 годин. Супернатант видаляли, а клітини фіксували 5mL формальдегіду або формальдегіду з глутаральдегідом за кімнатної температури протягом 15 чи 60 хв. Фіксатор видаляли, а моношари тричі промивали PBS, після чого клітини зіскрібали в 1mL MEM/5% FBS і піддавали ультразвуковій обробці (3 × 10 секунд увімкнення, 10 секунд вимкнення при 100% потужності та амплітуді) з використанням UP200St з насадкою VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Супернатанти освітлювали центрифугуванням при 3000 × g протягом 10 хв.


Деталі реагенту, використаного для інактивації коронавірусу SARS-CoV-2 за допомогою ультразвукового VialTweeter згідно з протоколом Welch et al. 2020

Повний протокол, що включає використання Hielscher VialTweeter, можна знайти тут:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Досконалі ультразвукові дисмембратори та дезінтегратори клітин

Багатопробний ультразвуковий апарат VialTweeter – лише одне з багатьох ультразвукових рішень для підготовки проб у біологічних, біохімічних і клінічних лабораторіях. Hielscher Ultrasonics пропонує ідеальний ультразвуковий дисмембратор для вашого застосування, напр. для лізису клітин, екстракції з клітин, гомогенізації тканин, солюбілізації лізату, розчинення, дегазації проб тощо.
Повідомте нам, скільки проб вам потрібно обробляти за годину та за день, чи надаєте ви перевагу прямій або непрямій ультразвуковій обробці та яка мета ультразвукової обробки проб. Ми порекомендуємо вам найбільш підходящий ультразвуковий пристрій для вашої щоденної роботи!
Цифрові ультразвукові процесори Hielscher Ultrasonics оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням, автоматичним записуванням даних, простими опціями попереднього налаштування контролю температури, тривалості ультразвукової обробки, циклічного/імпульсного режиму, а також підсвічуванням проби та дистанційним керуванням через браузер. Ми прагнемо зробити наші ультразвукові пристрої максимально інтелектуальними, щоб ваші дослідження та робоча рутина стали якомога зручнішими й успішнішими.
Натисніть тут, щоб знайти більше застосувань, включно з протоколами ультразвукової підготовки проб за допомогою VialTweeter!