Підготовка ультразвукових зразків для аналізу ІФА

Аналізи, такі як ІФА, широко використовуються для діагностики in vitro, виявлення білків, пов'язаних із захворюваннями, та контролю якості (наприклад, моніторингу харчових алергенів). Підготовка ультразвукових зразків – це швидка, надійна та відтворювана методика для лізу клітин та виділення внутрішньоклітинних білків, ДНК, РНК та органел. Hielscher Ultrasonics пропонує різні ультразвукові рішення для зручної підготовки одиничних зразків, кількох флаконів, а також для планшетів з мікротитром і планшетів з 96 лунками.

ІФА – Імуноферментний аналіз

ELISA розшифровується як імуноферментний аналіз і є широко використовуваним методом біохімічного аналізу категорії аналізів, що зв'язують ліганди. При ІФА рідкий зразок додається на нерухому тверду фазу зі спеціальними властивостями зв'язування. Як правило, нерухома тверда фаза наноситься як покриття на плиту свердловини або ІФА плиту. Потім послідовно додають, інкубують і промивають різні рідкі реагенти, так що в кінцевій рідині в лунці нарешті відбувається оптична зміна (наприклад, розвиток кольору продуктом ферментативної реакції). Оптична зміна дозволяє вимірювати кількість аналіту за допомогою так званого кількісного “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “пов'язані з ферментами” immunosorbent assay.
Оскільки аналіз ELISA проводиться в мікротитрових пластинах? 96-лункових планшетах, він відомий як метод аналізу на основі пластин і використовується, наприклад, у клінічній діагностиці in vitro, дослідженнях, розробці ліків тощо для виявлення та кількісного визначення антитіл, пептидів, білків та гормонів.
Метод ELISA часто використовується як діагностичний інструмент у медицині, біотехнологіях, патології рослин, а також є важливим вимірюванням контролю якості в багатьох галузях промисловості.

Підготовка ультразвукових зразків перед ІФА

Перш ніж можна буде провести аналіз ELISA, зразки вимагають етапів підготовки, таких як лізис клітин та екстракція внутрішньоклітинних білків, ДНК, РНК тощо. Перевагою ультразвукового лізису клітин і виділення білка є його висока ефективність, надійність і відтворюваність. Всі ці фактори важливі для того, щоб отримати якісну діагностику та результати досліджень

Протокол для лізису ультразвукових клітин до ELISA

• Для культур клітин: Перед ультразвуковим лізисом клітини центрифугують клітини протягом 5 хв при 270 х г у мікроцентрифузі. Видаліть супернатант шляхом аспірації та ресуспендуйте клітини в 30–100 мкл буфера RIPA. Потім інкубують гранулу клітини на льоду протягом 30 хв.
• Тепер зразок клітини готовий до ультразвукового лізису:
  Використовуйте ультразвуковий датчик зондового типу (наприклад, UP200Ht з зондом S26d2) або ультразвуковим пристроєм для кількох зразків (наприклад, VialTweeter для одночасного ультразвукового дослідження до 10 флаконів або UIP400MPT для мікротитрних пластин? 96-лункових планшетів) залежно від кількості зразків, які вам потрібно підготувати.
  Для ультразвукового дослідження одного зразка за допомогою зонда помістіть клітини в мікроцентрифужні пробірки об'ємом 1,5 мл.
• Попередньо встановіть тривалість ультразвуку, загальну споживану енергію, режим циклу та/або межі температури в цифровому меню ультразвукового апарату. Це забезпечує високу надійність і повторюваність звуку.
• Вставте сонотрод і увімкніть ультразвуковий пристрій. Обережно проведіть мікрокінчиком ультразвукового зонда по зразку, щоб рівномірно провести ультразвукове дослідження.
  Для більшості клітин ультразвуковий лізис завершиться після 2 -4 циклів по 10 сек ультразвуку.
• Після ультразвукового дослідження видаліть сонотрод зі зразка. Зразки слід інкубувати на льоду протягом 5 хв. Потім центрифугуйте при 10 000 x g протягом 20 хвилин, щоб видалити сміття. Перенесіть супернатанти в нову мікроцентрифужну пробірку. Позначте аналіти та зберігайте при температурі -20°C.
• Ультразвуковий сонотрод можна очистити, належним чином протерши його спиртом, або провести ультразвук у мензурці, наповненій спиртом, наприклад, 70% етанолом. Всі ультразвукові зонди, виготовлені з титану, піддаються автоклавуванню.

• Промийте тканину крижаним PBS (0,01M, pH = 7,4), щоб ретельно видалити надлишок крові при гемолізі.
• Зважте тканини (нирки, серце, легені, селезінка тощо) і мацеруйте їх на невеликі шматочки, які гомогенізуються в PBS. Необхідний обсяг ПБС пов'язаний з вагою тканини. Як правило, на 1 г тканини потрібно приблизно 9 мл PBS. Рекомендується додати до ПБС трохи інгібітора протеази. (В якості альтернативи можна використовувати RIPA або гіпотонічний буфер лізису, що містить коктейль з протеазою та інгібітором фосфатази.)
• Залежно від розміру тканини, коротке вихрове лікування (приблизно 1-2 хв. за 15 сек. імпульсів) може бути корисним для попередньої обробки тканини.
• Встановіть мікронаконечник, наприклад, S26d2, на ультразвуковий пристрій. Помістіть пробірку для зразка з серветкою в крижану ванну.
• Проведіть звуковий звук за допомогою ультразвукового апарату, наприклад UP200St (амплітуда 80%) протягом 1 хв в імпульсному режимі (15 секунд увімкнено, 15 секунд пауза). Зберігайте зразок у ванні з льодом.
• Потім гомогенати центрифугують для отримання специфічних пулів (цитозольних, ядерних, мітохондріальних або лізосомних) з метою збагачення білка для аналізу. Центрифугуючи зразок протягом 5 хвилин при температурі 5000×г, витягують супернатант.

Надійний контроль температури під час ультразвуку

Температура є важливим фактором, що впливає на процес, який особливо важливий для обробки біологічних зразків, наприклад, для запобігання термічній деградації білків. Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова діагностика створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні апаратів Hielscher Ultrasonics. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх попередньої аналітичної підготовки за допомогою ультразвукового апарату зондового типу або VialTweeter.

1. Моніторинг температури зразка: Всі цифрові ультразвукові процесори Hielscher оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням і вставним датчиком температури. Підключіть датчик температури до ультразвукового пристрою (наприклад, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP) і вставте наконечник датчика температури в одну з пробірок для зразка. За допомогою цифрового кольорового сенсорного дисплея Ви можете встановити в меню ультразвукового процесора конкретний температурний діапазон для Вашого зразка ультразвуку. Ультразвуковий пристрій автоматично зупиниться, коли буде досягнуто максимальної температури, і зупиниться, поки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленої температури ∆. Потім ультразвукове дослідження знову починається автоматично. Ця розумна функція запобігає деградації через нагрівання.
2. Що стосується ультразвукового мультизразкового блоку VialTweeter, то титановий блок, в якому утримуються пробірки для зразків, може бути попередньо охолоджений. Покладіть блок VialTweeter (тільки сонотроде без датчика!) в холодильник або морозильну камеру, щоб попереднє охолодження титанового блоку допомогло відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо є можливість, то і сам зразок можна попередньо охолодити.
3. Використовуйте крижану ванну або сухий лід для охолодження під час ультразвуку. Помістіть пробірку (трубки) для зразка під час ультразвуку в крижану ванну. Для VialTweeter використовуйте неглибокий лоток, наповнений сухим льодом, і покладіть VialTweeter на сухий лід, щоб тепло могло швидко розсіюватися.

Клієнти в усьому світі використовують ультразвукові апарати зондового типу Hielscher, а також багатовибіркові ультразвукові установки VialTweeter і UIP400MTP для щоденної роботи з підготовки зразків у біологічних, біохімічних, медичних та клінічних лабораторіях. Інтелектуальне програмне забезпечення та контроль температури процесорів Hielscher забезпечують надійний контроль температури та дозволяють уникнути деградації зразка, спричиненої нагріванням. Ультразвукова підготовка зразків за допомогою ультразвукових рішень Hielscher забезпечує високу надійність і відтворюваність результатів!
Дізнайтеся більше про високопродуктивне ультразвукове дослідження з використанням багатолункового пластинчастого УЗД UIP400MTP для аналізів!