Ультразвукова підготовка зразків для аналізів ELISA

Аналізи, такі як ELISA, широко використовуються для діагностики in vitro, виявлення білків, пов’язаних із захворюваннями, та контролю якості (наприклад, моніторинг харчових алергенів). Ультразвукова підготовка зразків є швидким, надійним і відтворюваним методом для лізису клітин та ізоляції внутрішньоклітинних білків, ДНК, РНК і органел. Hielscher Ultrasonics пропонує різні ультразвукові рішення для зручної підготовки одиночних зразків, кількох флаконів, а також для мікротитр-планшетів і 96-луночних планшетів.

ELISA – Імуноферментний аналіз

ELISA означає імуноферментний аналіз і є широко використовуваною біохімічною аналітичною технікою категорії аналізів зв’язування лігандів. В ELISA рідкий зразок додається на стаціонарну тверду фазу зі спеціальними властивостями зв’язування. Зазвичай стаціонарна тверда фаза наноситься як покриття на планшет із лунками або ELISA-планшет. Потім послідовно додаються, інкубуються та промиваються різні рідкі реагенти, так що нарешті у кінцевій рідині в лунці відбувається оптична зміна (наприклад, розвиток кольору продуктом ферментативної реакції). Оптична зміна дозволяє виміряти кількість аналіту за допомогою так званого «кількісного читання». Для кількісного читання використовується спектрофотометр, флуориметр або люмінометр для виявлення та вимірювання інтенсивності пропущеного світла. Чутливість виявлення залежить від підсилення сигналу під час аналітичних реакцій. Оскільки ферментативні реакції добре досліджені та є надійними процесами підсилення, ферменти використовуються для створення сигналу. Ферменти зв’язані з детектуючими реагентами у фіксованих пропорціях, щоб забезпечити точну кількісну оцінку, що також пояснює назву «імуноферментний» аналіз.
Оскільки аналізи ELISA виконуються в мікротитр-планшетах / 96-луночних планшетах, вони відомі як планшетні аналітичні техніки та використовуються, наприклад, у клінічній діагностиці in vitro, дослідженнях, розробці ліків тощо для виявлення та кількісного визначення антитіл, пептидів, білків і гормонів.
Техніка ELISA часто використовується як діагностичний інструмент у медицині, біотехнології, фітопатології та також є важливим вимірюванням контролю якості в багатьох галузях промисловості.

Ультразвукова підготовка зразків перед ELISA

Перш ніж можна буде виконати аналіз ELISA, зразки потребують етапів підготовки, таких як лізис клітин та екстракція внутрішньоклітинних білків, ДНК, РНК тощо. Перевагою ультразвукового лізису клітин та ізоляції білків є його висока ефективність, надійність і відтворюваність. Усі ці фактори важливі для отримання високоякісних діагностичних та дослідницьких результатів

Протокол ультразвукового лізису клітин перед ELISA

• Для клітинних культур: Перед ультразвуковим лізисом клітин центрифугуйте клітини протягом 5 хв при 270 x g у мікроцентрифузі. Видаліть надосадову рідину аспірацією та ресуспендуйте клітини в 30 – 100 μL буфера RIPA. Потім інкубуйте осад клітин на льоду протягом 30 хв.
• Тепер зразок клітин готовий до ультразвукового лізису:
  Використовуйте ультразвуковий гомогенізатор зондового типу (наприклад, UP200Ht із зондом S26d2) або багато-зразковий ультразвуковий пристрій (наприклад, VialTweeter для одночасної ультразвукової обробки до 10 флаконів або UIP400MPT для мікротитр-планшетів / 96-луночних планшетів) залежно від кількості зразків, які потрібно підготувати.
  Для ультразвукової обробки зондом одиночного зразка помістіть клітини в 1,5 mL мікроцентрифужні пробірки.
• Налаштуйте тривалість ультразвукової обробки, загальну енергію введення, циклічний режим та/або температурні обмеження в цифровому меню ультразвукового гомогенізатора. Це забезпечує високонадійну ультразвукову обробку та повторюваність.
• Вставте сонотрод і увімкніть ультразвуковий прилад. Обережно переміщуйте мікрокончик ультразвукового зонда через зразок для рівномірної ультразвукової обробки зразка.
  Для більшості клітин ультразвукове руйнування буде завершено після 2–4 циклів ультразвукової обробки тривалістю 10 сек.
• Після ультразвукової обробки вийміть сонотрод із зразка. Зразки слід інкубувати на льоду протягом 5 хв. Потім центрифугуйте при 10 000 x g протягом 20 хв для осадження залишків. Перенесіть надосадкові рідини в нову мікроцентрифужну пробірку. Позначте аналіти та зберігайте при -20°C.
• Ультразвуковий сонотрод можна очистити, ретельно протерши його спиртом або піддавши ультразвуковій обробці в склянці, наповненій спиртом, наприклад, 70% етанолом. Усі ультразвукові зонди, виготовлені з титану, можна стерилізувати в автоклаві.

• Промийте тканину крижаним PBS (0,01M, pH=7,4), щоб ретельно видалити надлишок крові з гемолізованих еритроцитів.
• Зважте тканину (нирку, серце, легені, селезінку тощо) і подрібніть її на шматочки, які гомогенізують у PBS. Необхідний об’єм PBS залежить від маси тканини. Як орієнтовне правило, 1 г тканини потребує приблизно 9 mL PBS. Рекомендується додати деякий інгібітор протеази до PBS. (Можна також використовувати RIPA або гіпотонічний лізисний буфер, що містить коктейль інгібіторів протеази та фосфатази.)
• Залежно від розміру тканини, коротка обробка на вортексі (приблизно 1–2 хв. імпульсами по 15 сек.) може бути корисною для попередньої обробки тканини.
• Закріпіть мікрокончик, наприклад S26d2, на вашому ультразвуковому гомогенізаторі. Помістіть пробірку зі зразком тканини в крижану ванну.
• Піддайте зразок ультразвуковій обробці за допомогою вашого ультразвукового гомогенізатора, наприклад UP200St (80% амплітуда) протягом 1 хв. в імпульсному режимі (15 сек. увімкнено, 15 сек. пауза). Тримайте зразок у крижаній ванні.
• Гомогенати потім центрифугують для отримання специфічних фракцій (цитозольної, ядерної, мітохондріальної або лізосомальної) з метою збагачення білка для аналізу. Центрифугуючи зразок протягом 5 хвилин при 5000×g, отримують надосадкову рідину.

Надійний контроль температури під час ультразвукової обробки

Температура є критичним фактором, що впливає на процес, який особливо важливий для обробки біологічних зразків, наприклад, для запобігання термічній деградації білків. Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова обробка створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні пристроїв Hielscher Ultrasonics. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх підготовки за допомогою ультразвукового гомогенізатора зондового типу або VialTweeter для преаналітичної обробки.

1. Моніторинг температури зразка: Усі цифрові ультразвукові процесори Hielscher оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням та знімним температурним сенсором. Підключіть температурний сенсор до ультразвукового приладу (наприклад, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, ультразвукового гомогенізатора для багатолуночних планшетів UIP400MTP) і вставте кінчик температурного сенсора в одну з пробірок зі зразком. За допомогою цифрового кольорового сенсорного дисплея ви можете встановити в меню ультразвукового процесора специфічний температурний діапазон для ультразвукової обробки вашого зразка. Ультразвуковий гомогенізатор автоматично зупиниться, коли буде досягнута максимальна температура, і зробить паузу, доки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленого діапазону ∆. Потім ультразвукова обробка автоматично відновиться. Ця розумна функція запобігає термічній деградації.
2. Щодо ультразвукової багатозразкової установки VialTweeter, титановий блок, який утримує пробірки зі зразками, можна попередньо охолодити. Помістіть блок VialTweeter (лише сонотрод без перетворювача!) у холодильник або морозильну камеру, щоб попередньо охолодити титановий блок, що допомагає відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо можливо, сам зразок також можна попередньо охолодити.
3. Використовуйте крижану ванну або сухий лід для охолодження під час ультразвукової обробки. Помістіть пробірки зі зразками під час ультразвукової обробки в крижану ванну. Для VialTweeter використовуйте неглибокий піддон, заповнений сухим льодом, і розмістіть VialTweeter на сухому льоду, щоб тепло могло швидко розсіятися.

Клієнти у всьому світі використовують ультразвукові гомогенізатори Hielscher зондового типу, а також багатозразкові установки для ультразвукової обробки VialTweeter та UIP400MTP для щоденної підготовки зразків у біологічних, біохімічних, медичних та клінічних лабораторіях. Інтелектуальне програмне забезпечення та контроль температури процесорів Hielscher забезпечують надійне регулювання температури та запобігання термічній деградації зразків. Підготовка зразків за допомогою ультразвукових рішень Hielscher забезпечує високонадійні та відтворювані результати!
Дізнайтеся більше про високоефективну ультразвукову обробку за допомогою багатозагнізного ультразвукового гомогенізатора UIP400MTP для аналізів!