Підготовка ультразвукових зразків для аналізу ІФА
Аналізи, такі як ІФА, широко використовуються для діагностики in vitro, виявлення білків, пов'язаних із захворюваннями, та контролю якості (наприклад, моніторингу харчових алергенів). Підготовка ультразвукових зразків – це швидка, надійна та відтворювана методика для лізу клітин та виділення внутрішньоклітинних білків, ДНК, РНК та органел. Hielscher Ultrasonics пропонує різні ультразвукові рішення для зручної підготовки одиничних зразків, кількох флаконів, а також для планшетів з мікротитром і планшетів з 96 лунками.
ІФА – Імуноферментний аналіз
ELISA розшифровується як імуноферментний аналіз і є широко використовуваним методом біохімічного аналізу категорії аналізів, що зв'язують ліганди. При ІФА рідкий зразок додається на нерухому тверду фазу зі спеціальними властивостями зв'язування. Як правило, нерухома тверда фаза наноситься як покриття на плиту свердловини або ІФА плиту. Потім послідовно додають, інкубують і промивають різні рідкі реагенти, так що в кінцевій рідині в лунці нарешті відбувається оптична зміна (наприклад, розвиток кольору продуктом ферментативної реакції). Оптична зміна дозволяє вимірювати кількість аналіту за допомогою так званого кількісного “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “пов'язані з ферментами” immunosorbent assay.
Оскільки аналіз ELISA проводиться в мікротитрових пластинах? 96-лункових планшетах, він відомий як метод аналізу на основі пластин і використовується, наприклад, у клінічній діагностиці in vitro, дослідженнях, розробці ліків тощо для виявлення та кількісного визначення антитіл, пептидів, білків та гормонів.
Метод ELISA часто використовується як діагностичний інструмент у медицині, біотехнологіях, патології рослин, а також є важливим вимірюванням контролю якості в багатьох галузях промисловості.

Блок підготовки ультразвукових зразків VialTweeter використовується для лізису клітин та екстракції білка перед аналізом ІФА
Підготовка ультразвукових зразків перед ІФА
Перш ніж можна буде провести аналіз ELISA, зразки вимагають етапів підготовки, таких як лізис клітин та екстракція внутрішньоклітинних білків, ДНК, РНК тощо. Перевагою ультразвукового лізису клітин і виділення білка є його висока ефективність, надійність і відтворюваність. Всі ці фактори важливі для того, щоб отримати якісну діагностику та результати досліджень
- Обробка однорідних зразків
- Повний лізис
- Повна екстракція білка (наприклад, антитіл, ДНК)
- Оптимальна адаптація до типу клітин
- Для будь-якого розміру вибірки
- Відтворювані
- З температурним контролем
- Автоматичне протоколування даних на SD-карті
Протокол для лізису ультразвукових клітин до ELISA
- Для культур клітин: Перед ультразвуковим лізисом клітини центрифугують клітини протягом 5 хв при 270 х г у мікроцентрифузі. Видаліть супернатант шляхом аспірації та ресуспендуйте клітини в 30–100 мкл буфера RIPA. Потім інкубують гранулу клітини на льоду протягом 30 хв.
- Тепер зразок клітини готовий до ультразвукового лізису:
Використовуйте ультразвуковий датчик зондового типу (наприклад, UP200Ht з зондом S26d2) або ультразвуковим пристроєм для кількох зразків (наприклад, VialTweeter для одночасного ультразвукового дослідження до 10 флаконів або UIP400MPT для мікротитрних пластин? 96-лункових планшетів) залежно від кількості зразків, які вам потрібно підготувати.
Для ультразвукового дослідження одного зразка за допомогою зонда помістіть клітини в мікроцентрифужні пробірки об'ємом 1,5 мл. - Попередньо встановіть тривалість ультразвуку, загальну споживану енергію, режим циклу та/або межі температури в цифровому меню ультразвукового апарату. Це забезпечує високу надійність і повторюваність звуку.
- Вставте сонотрод і увімкніть ультразвуковий пристрій. Обережно проведіть мікрокінчиком ультразвукового зонда по зразку, щоб рівномірно провести ультразвукове дослідження.
Для більшості клітин ультразвуковий лізис завершиться після 2 -4 циклів по 10 сек ультразвуку. - Після ультразвукового дослідження видаліть сонотрод зі зразка. Зразки слід інкубувати на льоду протягом 5 хв. Потім центрифугуйте при 10 000 x g протягом 20 хвилин, щоб видалити сміття. Перенесіть супернатанти в нову мікроцентрифужну пробірку. Позначте аналіти та зберігайте при температурі -20°C.
- Ультразвуковий сонотрод можна очистити, належним чином протерши його спиртом, або провести ультразвук у мензурці, наповненій спиртом, наприклад, 70% етанолом. Всі ультразвукові зонди, виготовлені з титану, піддаються автоклавуванню.

Екстракція білка з клітин E.coli за допомогою ультразвуковий зонд UP200St
- Промийте тканину крижаним PBS (0,01M, pH = 7,4), щоб ретельно видалити надлишок крові при гемолізі.
- Зважте тканини (нирки, серце, легені, селезінка тощо) і мацеруйте їх на невеликі шматочки, які гомогенізуються в PBS. Необхідний обсяг ПБС пов'язаний з вагою тканини. Як правило, на 1 г тканини потрібно приблизно 9 мл PBS. Рекомендується додати до ПБС трохи інгібітора протеази. (В якості альтернативи можна використовувати RIPA або гіпотонічний буфер лізису, що містить коктейль з протеазою та інгібітором фосфатази.)
- Залежно від розміру тканини, коротке вихрове лікування (приблизно 1-2 хв. за 15 сек. імпульсів) може бути корисним для попередньої обробки тканини.
- Встановіть мікронаконечник, наприклад, S26d2, на ультразвуковий пристрій. Помістіть пробірку для зразка з серветкою в крижану ванну.
- Проведіть звуковий звук за допомогою ультразвукового апарату, наприклад UP200St (амплітуда 80%) протягом 1 хв в імпульсному режимі (15 секунд увімкнено, 15 секунд пауза). Зберігайте зразок у ванні з льодом.
- Потім гомогенати центрифугують для отримання специфічних пулів (цитозольних, ядерних, мітохондріальних або лізосомних) з метою збагачення білка для аналізу. Центрифугуючи зразок протягом 5 хвилин при температурі 5000×г, витягують супернатант.
Надійний контроль температури під час ультразвуку
Температура є важливим фактором, що впливає на процес, який особливо важливий для обробки біологічних зразків, наприклад, для запобігання термічній деградації білків. Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова діагностика створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні апаратів Hielscher Ultrasonics. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх попередньої аналітичної підготовки за допомогою ультразвукового апарату зондового типу або VialTweeter.
- Моніторинг температури зразка: Всі цифрові ультразвукові процесори Hielscher оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням і вставним датчиком температури. Підключіть датчик температури до ультразвукового пристрою (наприклад, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP) і вставте наконечник датчика температури в одну з пробірок для зразка. За допомогою цифрового кольорового сенсорного дисплея Ви можете встановити в меню ультразвукового процесора конкретний температурний діапазон для Вашого зразка ультразвуку. Ультразвуковий пристрій автоматично зупиниться, коли буде досягнуто максимальної температури, і зупиниться, поки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленої температури ∆. Потім ультразвукове дослідження знову починається автоматично. Ця розумна функція запобігає деградації через нагрівання.
- Що стосується ультразвукового мультизразкового блоку VialTweeter, то титановий блок, в якому утримуються пробірки для зразків, може бути попередньо охолоджений. Покладіть блок VialTweeter (тільки сонотроде без датчика!) в холодильник або морозильну камеру, щоб попереднє охолодження титанового блоку допомогло відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо є можливість, то і сам зразок можна попередньо охолодити.
- Використовуйте крижану ванну або сухий лід для охолодження під час ультразвуку. Помістіть пробірку (трубки) для зразка під час ультразвуку в крижану ванну. Для VialTweeter використовуйте неглибокий лоток, наповнений сухим льодом, і покладіть VialTweeter на сухий лід, щоб тепло могло швидко розсіюватися.
Клієнти в усьому світі використовують ультразвукові апарати зондового типу Hielscher, а також багатовибіркові ультразвукові установки VialTweeter і UIP400MTP для щоденної роботи з підготовки зразків у біологічних, біохімічних, медичних та клінічних лабораторіях. Інтелектуальне програмне забезпечення та контроль температури процесорів Hielscher забезпечують надійний контроль температури та дозволяють уникнути деградації зразка, спричиненої нагріванням. Ультразвукова підготовка зразків за допомогою ультразвукових рішень Hielscher забезпечує високу надійність і відтворюваність результатів!
Дізнайтеся більше про високопродуктивне ультразвукове дослідження з використанням багатолункового пластинчастого УЗД UIP400MTP для аналізів!
Зв'яжіться з нами!? Запитайте нас!
Література? Список літератури
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Факти, які варто знати
Які типи ІФА існують?
Існує кілька видів ІФА, які розрізняють за принципом функціонування. Вони відомі як прямий ІФА, непрямий ІФА, сендвіч ІФА, конкурентний ІФА та зворотний ІФА. Нижче ми представляємо вам огляд різних типів ІФА та їх основних характеристик і відмінностей.
ІФА може проводитися в якісному або кількісному форматі. Якісні результати дають простий позитивний або негативний результат, тоді як у кількісному ІФА оптична щільність (ОД) зразка порівнюється зі стандартною кривою, яка зазвичай є серійним розведенням розчину цільової молекули відомої концентрації.
Прямий ІФА
Прямий ІФА є найпростішою формою аналізу ІФА, де використовується тільки мічені ферментами первинні антитіла, а вторинні антитіла не потрібні. Мічений ферментом первинний антитіло зв'язується безпосередньо з мішенню, тобто з антигеном. Буферизований розчин антигену додається в кожну лунку мікротитрової пластинки (зазвичай 96-лункові пластини, ІФА-пластини), де прилипає до пластичної поверхні за допомогою взаємодії зарядів. Коли фермент, пов'язаний з первинним антитілом, реагує з його субстратом, він виробляє видимий сигнал, який можна виміряти за допомогою спектрофотометра, флуорометра або люмінометра.
Непрямий ІФА
Для непрямого ІФА-тесту потрібне як первинне, так і вторинне антитіло. Однак, на відміну від прямого ІФА, не первинне антитіло, а вторинне антитіло мічається ферментом. Антиген іммобілізується до лункової пластинки і зв'язується первинним антитілом. Згодом мічене ферментом вторинне антитіло зв'язується з первинним антитілом. Нарешті, фермент, пов'язаний з вторинним антитілом, реагує з його субстратом, виробляючи видимий сигнал, який можна виявити.
Сендвіч ІФА
У той час як при прямих і непрямих тестах ІФА антиген іммобілізується і наноситься на поверхню лункової пластини, в сендвічі ІФА антитіло іммобілізується на пластикову поверхню ІФА-планшета. Іммобілізовані антитіла в бутербродному ІФА відомі як антитіла захоплення. Крім захоплення антитіл, в ІФА бутерброда також потрібне так зване виявлення антитіл. Антитіла для виявлення включають немічені антитіла первинного виявлення та ензимно-мічені вторинні антитіла для виявлення.
Поступово цікавий антиген зв'язується з іммобілізованим на пластинку антитілом захоплення. Потім антитіло первинного виявлення зв'язується з антигеном. Після цього антитіло вторинного виявлення зв'язується з антитілом первинного виявлення. На заключному етапі реакції фермент реагує зі своїм субстратом, виробляючи видимий сигнал, який можна виявити оптично.
Конкурентний ІФА
Конкурентний ІФА, також відомий як інгібуючий ІФА, є найскладнішим типом ІФА, оскільки передбачає використання інгібіторного антигену. Кожен з трьох форматів, прямий, непрямий і сендвіч-ІФА, може бути адаптований до конкурентного формату ІФА. У конкурентному ІФА антиген-інгібітор і антиген, що представляє інтерес, змагаються за зв'язування з первинним антитілом.
Для конкурентного ІФА немічені антитіла інкубують у присутності його антигену, тобто зразка. Ці зв'язані комплекси антитіл/антиген потім додають у лунку, покриту антигеном.
Пластину промивають, щоб видалити незв'язані антитіла. Конкурентний ІФА отримав свою назву через те, що чим більше антигену в зразку, тим більше утворюється комплексів антиген-антитіло. Це означає, що в лунці менше незв'язаних антитіл для зв'язування з антигеном, і антигени повинні конкурувати за доступне антитіло. Додається вторинне антитіло, що відповідає первинному антитілу. Це друге антитіло пов'язане з ферментом. При додаванні субстрату інші ферменти виробляють хромогенний або флуоресцентний сигнал.
У цей момент реакція припиняється, щоб уникнути можливого насичення сигналу.
Деякі змагальні набори ELISA включають антиген, пов'язаний з ферментами, замість ензимо-пов'язаного антитіла. Мічений антиген конкурує за первинні ділянки зв'язування антитіл зі зразком антигену (немічений). Чим менше антигену в зразку, тим більше мічений антиген утримується в лунці і тим сильніше сигнал.
Зворотний ІФА
При зворотному ІФА не використовуються well планшети, але залишає антигени в підвішеному стані в досліджуваної рідини. Зворотний ІФА-тест вимірює кількість зв'язаних антитіл за допомогою антигену. Він був розроблений спеціально для виявлення та дослідження білка оболонки вірусу Західного Нілу та того, як він здатний знаходити вірус-специфічні антитіла.
Які ферментативні маркери використовуються при ІФА?
У наведеному нижче списку наведено найбільш поширені ферментативні маркери, що використовуються в аналізах ELISA, які дозволяють вимірювати результати аналізу після завершення.
- ОПД (о-фенілендіамін дигідрохлорид) забарвлюється в бурштиновий колір для виявлення HRP (пероксидази хрону), яку часто використовують як кон'югований білок.
- ТМБ (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин) синіє при виявленні ЧСС і жовтіє після додавання сірчаної або фосфорної кислоти.
- ABTS (2,2′-Азинобіс [3-етилбензотіазолін-6-сульфокислота]-діамонійна сіль) стає зеленим при виявленні ЧСС.
- ПНПП (п-нітрофенілфосфат, динатрію сіль) жовтіє при виявленні лужної фосфатази.