Ультразвукове зрізання ДНК

Під час зрізу ДНК і РНК довгі молекули ДНК фрагментуються на менші частини, що є важливим етапом у підготовці зразків для побудови бібліотеки секвенування наступного покоління (NGS). Ультразвуковий зріз ДНК використовує акустичні кавітаційні сили для розщеплення ДНК або РНК на фрагменти потужністю від 100 п.н. до 5 кб. Цей метод дозволяє точно контролювати розмір фрагмента, полегшуючи налаштування на бажану довжину ДНК для оптимальних результатів секвенування.

Зріз ДНК за допомогою ультразвуку

Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні ультразвукові рішення для зрізу ДНК, РНК та хроматину. Виберіть між ультразвуковими пристроями зондового типу (наприклад, UP100H) для прямого ультразвукового дослідження за допомогою мікронаконечника, або використовуйте VialTweeeter або ультразвуковий кухорн для непрямого приготування ДНК різних зразків одночасно. Компанія Hielscher пропонує ідеальний пристрій з урахуванням ваших потреб: незалежно від того, чи є у вас 1 або до 10 зразків, обсяги від мікролітра до літрового обсягу – Ультразвукові апарати Hielscher задовольнять ваші вимоги щодо підготовки фрагментів ДНК, РНК та хроматину потрібної довжини. Відтворюваність, просте керування та точне керування дозволяють створити надійну бібліотеку для секвенування наступного покоління.
На відміну від ферментативної фрагментації ДНК, ультразвуковий зсув застосовує чисті механічні сили зсуву без додавання будь-яких хімічних речовин. Завдяки точному налаштуванню параметрів процесу ультразвуковий зсув дозволяє отримати високомолекулярні фрагменти ДНК (плазміду та геномну ДНК).
Очищені нуклеїнові кислоти можуть бути ампліфіковані до або після етапу фрагментації.
Параметрами звуку (потужність, цикл імпульсу / сплески, час і температура) можна безпечно керувати за допомогою налаштувань програмного забезпечення.

Протоколи для ультразвукового зрізу ДНК

Для імунопреципітаційного аналізу хроматину

Коротко кажучи, клітини були поміщені в посуд діаметром 60 мм (400 000 на тарілку) і пересаджені RhoA siRNA (як описано); через 72 год їх інкубували з формальдегідом (кінцева концентрація, 1%) протягом 10 хв при 37 ° С для зшивання білків з ДНК. Реакцію зшивання гасили додаванням однієї десятої об'єму гліцину 1,25 моль/л, що давало кінцеву концентрацію 125 ммоль/л. Клітини двічі промивали крижаним PBS, ресуспендували в буфері для радіоімунопреципітаційного аналізу [150 ммоль/л NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолат, 0,1% SDS, 5 ммоль/л EDTA, 50 ммоль/л Tris-HCl (pH 8,0)], що містив 1 ммоль/л фенілметилсульфонілфториду, 1 Ag/mл апротиніну та 1 Ag/мл пепстатину А, і витримували на льоду протягом 30 хв. Потім клітинні лізати проводили ультразвукове дослідження на льоду за допомогою Hielscher UP200S ультразвуковий звуковий звуковий апарат (3 х 40 с, амплітуда 40%, цикл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) до тих пір, поки зшиті хроматини не були зрізані для отримання фрагментів ДНК від 200 до 1000 п.н. Одна десята частина цілого лізату була використана для кількісного визначення кількості ДНК, присутньої в різних зразках, і розглядалася як “загальна вхідна ДНК”. Супернатанти інкубували з ДНК/білком агарози сперми лосося – 50% суспензією для зменшення неспецифічного фону. Потім імунопреципітацію проводили протягом ночі при температурі 4 °C з 5 Ag анти-NF-nB p65 (Upstate) або без антитіл (негативний контроль). Ці супернатанти були доповнені 5 моль/л NaCl і нагрівалися протягом ночі при 65 °C для відновлення поперечних зв'язків білок-ДНК. Імунокомплекси додатково лікували ДНКазо- та РНКаз-вільною протеїназою К, а ДНК очищали екстракцією фенолу/хлороформу та осадженням етанолу. ПЛР проводили зі специфічними праймерами, що відповідають послідовності в промоторній області гена iNOS людини (праймер p1: 5¶-GAGGGCTTCCCA-GAACCAAG-3¶; праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier та ін., 2008)

Дослідження EGFP-експресії

Для досліджень експресії рекомбінантний штам L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Німеччина) з геном EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), інтегрованим хромосомним ssu, культивували в різних середовищах, як описано раніше, і додатково доповнювали 100 мг л^-1 Нурсеотрицин (Jena Bioscience, Німеччина). При культивуванні відбирали проби об'ємом 1 мл, центрифугували (2000 × г, 20 ° С, 10 хв) і промивали 0,9% розчином NaCl. Гранули були пересуспендовані в буфері (20 мМ HEPES, 5 мМ EDTA, 2 мМ DTT) і розпадалися шляхом соніфікації з ультразвуковим процесором UP400S (застосування енергії ∼ 400 Вт). Залишки клітин видаляли центрифугуванням (6000 × г, 4 °С, 5 хв) та аналізували електрофорезом додецилсульфату натрію – поліакриламідного гелю (SDS-PAGE) у відновлювальних умовах за методом Laemmli (1970) з 12,5% поліакраламідними гелями. EGFP-експресію досліджували в збудженій культурі. (Fritsche et al. 2007)

імунопреципітація хроматину

Імунопреципітаційний аналіз хроматину проводили за допомогою препарату ChIP-IT^ТМ Експрес (Актив Мотив, Карлові Вари, Каліфорнія, США) згідно з інструкцією виробника з деякими модифікаціями. Якщо коротко, то диференційовані людські подоцити були зшиті з 1% формальдегідом протягом 10 хв при кімнатній температурі. Клітини промивали крижаним ПБС і припиняли реакцію фіксації додаванням 0,125 М гліцину протягом 5 хв при кімнатній температурі. Клітини знову промивали крижаним ПБС і зішкрібали з тарілки. Клітини гранулювали центрифугуванням і ресуспендували в буфері лізису. Після центрифугування гранульовані ядра знову суспендували в буфері для зсуву, інкубували на льоду протягом 30 хв, а хроматин зсіювали за допомогою ультразвуку, наприклад UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Німеччина) при 25% потужності 5 імпульсів по 20 сек на льоду на фрагменти приблизно 200-600 п.н. Потім зрізаний хроматин центрифугували і збирали супернатант. Для імунопреципітацій інкубували 60 мкл хроматину з 1 мкг Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Великобританія) або NF-κB p50 (Abcam) або з кролячим IgG (Zymed Laboratories), як негативний контроль, протягом ночі при 4 °C з легким обертанням. Імунокомплекси, зв'язані з магнітними кульками, збирали за допомогою магнітної підставки, ретельно промивали, а зшивання білок/ДНК міняли місцями та елюювали ДНК для аналізу ПЛР у реальному часі. (Ristola та ін., 2009)

Підготовка ДНК EHEC для аналізу чіп-масиву

Розташування клітинних лізатів і екстрагованих ДНК
Бактеріальні гранули, зважені в ПБС до потрібної кінцевої концентрації, обробляли Руйнівник ультразвуку UP100H (Hielscher GmbH, Німеччина) оснащений мікронаконечником MS1 (діаметром 1 мм). Робоча частота становила 30 кГц, а ефективна вихідна потужність – 100 Вт. Під час операції зразки охолоджували на крижаній водяній бані, змішували і центрифугували. Зразки використовувалися для досліджень проточною цитометрією, а для подальшої обробки зразки піддавали термічній обробці (95 ° C, 5 хв). Неочищені клітинні лізати були оброблені сумішшю фенолу:хлороформу:ізоамілового спирту (25:24:1). Рівний об'єм цієї суміші був доданий до зразка лізату, розчин енергійно вихрювали протягом 15 с і центрифугували при 15 000 x g протягом 2 хв при кімнатній температурі (RT) близько 22 °C. Верхня водна фаза, що містить геномну ДНК, була ретельно відокремлена і зібрана в нову стерильну пробірку Еппендорфа.
Згодом зразки провели ультразвукове дослідження для фрагментації ДНК. Етап ультразвукової діагностики був реалізований в тих же умовах, які були описані вище. Щоб оцінити вплив фрагментації на геномну ДНК, зразки аналізували за допомогою електрофорезу агарозного гелю.
(…) Попередньо ультразвукові зразки протягом 2,5 хв піддавали етапу екстракції після термічної обробки та центрифугування. Вивільнену ДНК двічі екстрагували сумішшю фенол:хлороформ:ізоаміловий спирт, а потім піддавали другому ультразвуку протягом 0–15 хв. Електрофорез агарозного гелю використовувався для визначення розподілу розмірів ДНК, підданої постекстракційної ультразвукової фрагментації (рис. у верхній правій частині). Високо фрагментована ДНК була очевидною за наявністю мазка ДНК, а не за високомолекулярними смугами, які були видалені зі зразків, проведених ультразвуковим звуком протягом 2,5 хв або довше. Більш тривала ультразвукова діагностика поступово зменшувала довжину фрагментів приблизно до 150 – 600 п.н., а ультразвукове дослідження протягом 15 хв ще більше деградувало ці фрагменти, що видно в основному по верхній частині мазка. Таким чином, середній розмір фрагментів ДНК поступово зменшувався з часом ультразвуку, а 5-хвилинне лікування дозволило отримати розміри фрагментів ДНК, найбільш придатні для аналізу чіп-матриці. Нарешті, була встановлена процедура підготовки ДНК-аналіту, що включає в себе спочатку 2 хв ультразвукової обробки, екстракцію ДНК (2×) і подальшу 5 хв ультразвукову діагностику. (Basselet та ін., 2008)

Імунопреципітація хроматину (ChIP)

Клітини HEK293 культивували, як описано вище, і фіксували за допомогою 2 мМ дискуциніл-глутарату протягом 45 хв при кімнатній температурі. Згодом камери двічі промивали ПБС. Хроматин зшивали протягом 10 хв при кімнатній температурі з використанням 1% (об/об) формальдегіду і двічі промивали крижаним PBS. Реакцію зшивання зупиняли інкубацією з гліцином в кінцевій концентрації 0,125 М протягом 5 хв при кімнатній температурі. Після інкубації з трипсином клітини зішкрібали з чашки для культивування клітин і двічі промивали PBS. Гранули клітин ресуспендували в лізисному буфері (5 мМ Пайпс, рН 8,0, 85 мМ KCl і 0,5% (об/об) Нонідет Р-40), інкубували на льоду протягом 10 хв і гомогенізували з гомогенізатором Dounce. Згодом ядра гранулювали центрифугуванням (3500 x g, 5 хв, 4 °C) і ресуспендували в буфері ядер (50 мМ Tris-HCl, рН 8,1, 10 мМ ЕДТА і 1% (ж/об) SDS). Ядра порушувалися звуковим звуком з трьома 20-секундними імпульсами в Звуковий апарат UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) при задачі циклу 0,5 і амплітуді 30%, отримуючи геномні фрагменти ДНК з об'ємним розміром 200 – 1000 п.н. Для ChIP 50 г ДНК було розведено в 4 рази в буфері імунопреципітації (16,7 мМ Tris-HCl, рН 8,1, 167 мМ NaCl, 1,2 мМ ЕДТА, 1,1% (об/об) Triton X-100 та 0,01% (в/об) SDS). (Weiske та ін., 2006)

Аналіз модифікації гістонів методом імунопреципітації хроматину (ChIP)

Коротко, 6 х 10⁶ клітини двічі промивали ПБС і зшивали на культуральній пластині протягом 15 хв при кімнатній температурі в присутності 0,5% формальдегіду. Реакцію зшивання зупиняли додаванням 0,125 М гліцину. Всі подальші етапи проводилися при температурі 48 ° C. Всі буфери були попередньо охолоджені і містили інгібітори протеази (Complete Mini, Roche). Клітини двічі промивали ПБС, а потім зішкрібали. Зібрані гранули розчиняли в буфері лізису об'ємом 1 мл (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) і проводили ультразвукове дослідження у ванні з холодним етанолом протягом 10 циклів з 100% амплітудою за допомогою Звуковий апарат UP50H (Hielscher, Тельтов, Німеччина). Фрагментація хроматину візуалізувалася в 1% агарозному гелі. Отримані фрагменти були в діапазоні 200–500pb. Розчинний хроматин отримували центрифугуванням ультразвукових зразків у дозі 14 000 г протягом 10 хв при температурі 48 °C. Розчинну фракцію розводили на 1/10 у буфері для розведення (1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Tris pH 8, 150 мМ NaCl), потім аліцитували та зберігали при 80 °C до використання. (Rodriguez et al. 2008)