Hielscher ультразвукова технологія

Ультразвукова ДНК Shearing

  • Під час зсуву ДНК та РНК молекули ДНК розбиті на дрібні шматочки. Дроблення ДНК / РНК є одним з важливих етапів підготовки зразків, необхідних для створення бібліотек для послідовності наступного покоління (NGS).
  • Ультразвукове з'єднання ДНК використовує сили акустичної кавітації, щоб розбити ДНК або РНК на шматочки 100 – 5kb bp.
  • Ультразвукове зсув дозволяє точно фрагментацію ДНК та адаптацію до потрібної довжини ДНК.

 

Ультразвукова ДНК Shearing

Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні рішення на основі ультразвуку для різання ДНК, РНК та хроматину. Вибирайте між зондовими ультразвуковими апаратами (наприклад, UP100H) для прямої ультразвукової обробки з використанням мікротипу, або використовуйте VialTweeeter або ультразвуковий cuphorn для непрямого одержання ДНК різних зразків одночасно. Hielscher пропонує ідеальний пристрій, який враховує ваші потреби: якщо у вас є 1 або до 10 зразків, обсяги від мікролітр до об'єму літра – Ультразвукові процесори Hielscher доступні для того, щоб відповідати вашим вимогам для приготування фрагментів ДНК, РНК та хроматину на потрібній довжині. Відтворюваність, легкість роботи та точний контроль дозволяють створювати надійну бібліотеку для послідовності наступного покоління.
На відміну від фрагментації ферментативної ДНК, ультразвукове зсув застосовує чисті механічні зсувні сили без додавання будь-яких хімікатів. За чіткої настройки параметрів процесу, ультразвукове зсув виробляє фрагменти ДНК високої молекулярної маси (плазміди та геномні ДНК).
Очищені нуклеїнові кислоти можуть бути ампліфіковані до або після етапу фрагментації.
Параметри підсилення (потужність, імпульсний цикл / сплески, час і температура) можна безпечно контролювати за допомогою програмних параметрів.

Переваги:

  • точний контроль
  • Ультразвук циклів і часу точно адаптується до бажаного розміру ДНК
  • фрагменти ДНК з високою молекулярною вагою
  • контроль температури
  • Швидко
  • відтворювані результати
  • автоклавний
  • Різні рішення: Зондований тип, VialTweeter і CupHorn

Протоколи для зсуву ультразвукової ДНК

Для аналізу імунопреципітації хроматину

Коротко, клітини були нанесені на посудини діаметром 60 мм (400000 на тарілку) і трансфіковані RhoA siRNA (як описано); через 72 години їх інкубували з формальдегідом (кінцева концентрація, 1%) протягом 10 хв при 37 ° С до білків з поперечними зв'язками до ДНК. Реакцію зшивання гасили додаванням одного десятого об'єму 1,25 моль / л гліцину, що дало кінцеву концентрацію 125 ммоль / л. Клітини двічі промивали льодом-холодним PBS, ресуспендували в буфері для аналізу радіоіммунопрепарації [150 ммоль / л NaCl, 1% NP40, 0,5% деоксихолату, 0,1% ДСН, 5 ммоль / л EDTA, 50 ммоль / л Tris-HCl (рН 8,0 )], що містить 1 ммоль / л фенілметилсульфоніл фториду, 1 Аг / мл апротиніну та 1 Аг / мл пепстатину А і тримають на льоді протягом 30 хв. Потім клітинні лізати обробляли ультразвуком на льоду з а Hielscher UP200S ультразвуковий сонікатор (3 х 40 с, амплітуда 40%, цикл 1, Hielscher Ultrasonics GmbH), поки не зшивали хрестовидні хроматини, щоб отримати фрагменти ДНК між 200 і 1000 рр. Одна десята частина цільного лізату використовувалася для кількісного визначення кількості ДНК, присутньої у різних зразках, і розглядалася як “загальна вхідна ДНК”. Супернатанти інкубували з спермою лосося ДНК / білка агароза-50% суспензії для зменшення неспецифічного фону. Імунопреципітацію проводили протягом ночі при 4 ° С з 5 Ag анти-NF-nB p65 (Upstate) або без антитіл (негативний контроль). Ці супернатанти додавали 5 моль / л NaCl і нагрівали протягом ночі при 65 ° С, щоб відновити поперечні зв'язки білка-ДНК. Імунокомплекси були додатково оброблені протеїназом K, що не містили DNaase і RNase, і ДНК очищали шляхом екстракції фенолом / хлороформом та осадженням етанолу. ПЛР проводили з використанням специфічних праймерів, що відповідають послідовності в межах промоторної ділянки гена людського iNOS (грунт p1: 5'-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ;, праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3, ¶). (Doublier et al., 2008)

Дослідження експресії EGFP

Для досліджень експресії рекомбінантний штам L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat №12 (Jena Bioscience, Німеччина) з геном EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), інтегрований хромосомний ssu, культивують в різних середовищах, як описано раніше, і додатково доповнений 100 мг л-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Німеччина). Під час культивування взяли 1 мл зразків, центрифугували (2000 × г, 20 ° С, 10 хв.) І промивали 0,9% розчином NaCl. Пелле ресуспендували у буфері (20 мМ HEPES, 5 мМ EDTA, 2 ммоль DTT) і розкладали методом sonication з ультразвуковим процесором UP400S (застосування енергії ~ 400 Вт). Стовбуровий сміття видаляли центрифугуванням (6000 x g, 4 ° С, 5 хв) та аналізували методом електрофорезу на додецилсульфат-поліакриламідний гель (SDS-PAGE) в умовах редукції за методом Лаеммлі (1970) з 12,5% поліакраламідних гелів . EGFP-експресія досліджували в агітовій культурі. (Fritsche et al., 2007)

Hielscher's UP100H використовували для підготовки ДНК EHEC для аналізу масиву чипів

Електрофоретичні аналізи геномної ДНК E. coli EDL933 піддавали 0 - 15 хв. Ультразвуку. L позначає ДНК Сходи. (Basselet et al., 2008)

Запит інформації




Зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Імунопрепарат хроматину

Ультразвуковий розрядник клітин UP100H (100 Вт) для лізису, порушення клітин та зсуву ДНК.Аналіз імунопреципітації хроматину проводили з використанням ChIP-ITТМ Експрес (Active Motif, Carlsbad, CA, США) відповідно до інструкцій виробника з деякими змінами. Коротко кажучи, диференційовані людські підкоцити були перехрещеними з 1% формальдегіду протягом 10 хв при кімнатній температурі. Клітини промивають льодом-холодним PBS, і реакцію фіксації зупиняють додаванням 0.125 М гліцину протягом 5 хв при кімнатній температурі. Клітини знову промивають льодом-холодним PBS і висіпають з посуду. Клітини гранульовано шляхом центрифугування та ресуспендували в лізисному буфері. Після центрифугування гранульовані ядра ресуспендували в стрижучому буфері, інкубували на льоді протягом 30 хв, а хроматин знімався за допомогою ультразвукової обробки, наприклад UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Німеччина) при 25% потужності 5 імпульсів по 20 секунд на лід у фрагментах приблизно 200-600 б.п. Зіставлений хроматин потім центрифугували і супернатант збирали. Для імунопреципітації 60мкл хроматину інкубували з 1мкг Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, штат Каліфорнія, США), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Великобританія) або антитілами NF-κB p50 (Abcam) або кроликом IgG (Zymed Laboratories, Південний Сан-Франциско, штат Каліфорнія, США), як негативний контроль, протягом ночі при 4 ° С з ніжним обертанням. Імунокомплекси, зв'язані з магнітними кульками, збирали з використанням магнітного стенду, промивали величезним способом, а білкові / ДНК-поперечні зв'язки були зворотними, і ДНК елюювали для ПЛР-аналізу в реальному часі. (Ristola et al., 2009)

Приготування ДНК EHEC для аналізу масиву чипів

Розстановка клітинних лізатів та екстрагованих ДНК
Бактеріальні гранули, суспендовані в PBS до бажаної кінцевої концентрації, обробляли ультразвуковий розрядник UP100H (Hielscher GmbH, Німеччина), оснащений мікротипом MS1 (діаметром 1 мм). Робоча частота становила 30 кГц, а ефективна вихідна потужність становила 100 Вт. Під час роботи зразки охолоджували в бані з льодяною водою, змішували та центрифугували. Зразки використовувались для досліджень проточної цитометрії, тоді як для подальшої обробки зразки піддавали термічній обробці (95 ° С, 5 хв). Лізати сирої клітини обробляли сумішшю фенолу: хлороформ: ізоаміловий спирт (25: 24: 1). Рідний об'єм цієї суміші додавали до зразка лізату, розчин сильно вивергали протягом 15 с та центрифугували при 15000 хг протягом 2 хв при кімнатній температурі (ТТ) приблизно 22 ° С. Верхня водна фаза, що містить геномну ДНК, ретельно відокремлюється та збирається у новій стерильній трубці Еппендорфа.
Згодом зразки обробляли ультразвуком для фрагментації ДНК. Крок обробки ультразвуком здійснювався за тих же умов, що описані вище. Щоб оцінити ефекти фрагментації на геномну ДНК, проби аналізують за допомогою електрофорезу агарозного гелю.
(…) Зразки, які обробляли знімки раніше, протягом 2,5 хв піддавали екстракції після термічної обробки та центрифугування. ДНК, що вивільняється, двічі екстраговується сумішшю фенолу: хлороформ: ізоаміловий спирт, після чого піддається вторинній обробці ультразвуком протягом 0 - 15 хв. Для визначення величини розподілу ДНК, що піддавалися ультразвуковій фрагментації після екстракції (рис., У верхній правій частині), використовували апаратний гель-електрофорез. Високофрагменований ДНК був виявлений за наявності мазка ДНК, а не високомолекулярних смуг, які були виключені з зразків з ультразвуком на 2,5-х хвилин або довше. Більш довга ультразвукова обробка поступово зменшувала довжину фрагмента до приблизно 150 - 600 б.п., а ультразвукова обробка протягом 15 хв ще більше погіршила ці фрагменти, як це можна побачити, головним чином, у верхній частині мазка. Таким чином, середній розмір фрагментів ДНК поступово зменшувався за часів ультразвуку, а обробка 5 хв дозволила одержувати розміри фрагментів ДНК, найбільш підходящих для аналізу масивів чипів. Нарешті, була встановлена ​​процедура отримання ДНК-аналету, що включала перші 2 хвилини ультразвукової обробки, екстракцію ДНК (2 ×) та наступну 5-хвилинну обробку ультразвуком. (Basselet et al., 2008)

Іммунопреципітація хроматину (ЧІП)

Ultrasonic processor UP100H for DNA, RNA and chromatin shearing. (Click to enlarge!)Клітини HEK293 культивували, як описано вище, і фіксували 2 ммоль дисукцинімідил-глутарату протягом 45 хвилин при кімнатній температурі. Згодом клітини двічі промивали PBS. Хроматин перехрестився протягом 10 хв при кімнатній температурі з використанням 1% (об. / Об.) Формальдегіду та двічі промивають льодом-холодним PBS. Реакція зшивання зупинена інкубацією з гліцином при кінцевій концентрації 0,125 М протягом 5 хв при кімнатній температурі. Після інкубації з трипсином клітини висмоктували з тарілки клітинної культури та двічі промивали PBS. Клітинні гранули ресуспендували в лізисному буфері (5мМ Труби, рН 8,0, 85мМ КСІ та 0,5% (об. / Об.) Nonidet P-40), інкубували на льоді протягом 10 хв та гомогенизували гомогенізатором Dounce. Потім ядер виділяли центрифугуванням (3500 xg, 5 хв, 4 ° С) і ресуспендували в буферу з ядрами (50мМ Трис-НС1, рН 8.1, 10мМ ЕДТА та 1% (мас. / Об.) ДСН). Ядрами були порушені ультразвуком з трьома 20-ма імпульсами в a UP50H сонікатор (Hielscher Ultraschall Technologie) при циклі 0,5 та амплітуді 30%, що дає фрагменти геномної ДНК об'ємним розміром 200-1000 п.н. Для ЧіР 50 г ДНК розбавляли 4-кратним буфером імунопреципітації (16,7 мМ Трис-НСl, рН 8.1, 167 мМ NaCl, 1,2 мМ ЕДТА, 1,1% (об. / Об.) Тритону Х-100 та 0,01% (мас / v) SDS). (Weiske et al., 2006)

Аналіз модифікації гістону за допомогою іммопрепарату хроматину (ЧІП)

Коротко, 6 х 106 клітини двічі промивали PBS і зшивали на культуральну тарілку протягом 15 хв при кімнатній температурі у присутності 0,5% формальдегіду. Перехресну реакцію зупинили, додаючи 0,125 М гліцину. Всі наступні етапи виконували при 48 ° С. Усі буфери були попередньо охолоджені та містять інгібітори протеази (Complete Mini, Roche). Клітини двічі промивають PBS, а потім очищають. Зібрані гранули розчиняли в 1мл лізисного буфера (1% ДСН, 5мМ ЕДТА, 50мМ Трис, рН 8) та знімали ультразвуком у холодній бані для етанолу протягом 10 циклів з 100% амплітудою, використовуючи UP50H сонікатор (Хелешер, Телтув, Німеччина). Фрагментація хроматину була візуалізована в 1% агарозному гелі. Отримані фрагменти були в діапазоні 200-500 пікселів. Розчинний хроматин був отриманий шляхом центрифугування зондизованих зразків при 14000 г протягом 10 хв при 48 ° С. Розчинену фракцію розбавляли 1/10 в буфері розбавлення (1% Трітон Х-100, 2 мМ ЕДТА, 20 мМ Трис, рН 8, 150 мМ NaCl), потім алікватували та зберігали при 80 ° С до використання. (Rodriguez et al., 2008)

Пристрій Потужність [Вт] Тип Об'єм [мл]
VialTweeter 200 самостійний 0.5 1.5
UP50H 50 КПК або витривалість 0.01 250
UP100H 100 КПК або витривалість 0.01 500
UP200Ht 200 КПК або витривалість 0.1 1000
UP200St 200 стоячи 0.1 1000
UP400St 400 стоячи 5.0 2000
CupHorn 200 CupHorn, сонореактор 10 200
GDmini2 200 без забруднення проточною осередки

Запит інформації




Зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Віал Твітер Хілера є ідеальним для одночасної підготовки кількох зразків

VialTweeter для приготування ультразвукового зразка

Зв'яжіться з нами! / Запитати нас!

Запитайте більше інформації

Будь ласка, використовуйте форму нижче, якщо ви хочете отримати додаткову інформацію про гомогенізацію ультразвуку. Ми будемо раді запропонувати вам ультразвукову систему, яка відповідатиме вашим вимогам.









Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Література / Довідники

  • Баселет П., Вегзін Г., Енфорс С.-О., Габіг-Цимінська М. (2008): Обробка зразків для аналізу ентеро-геморагічної кишкової палички Escherichia coli на базі ДНК-мікросхем (EHEC). Мікробні клітинні фабрики 7:29. 2008 рік.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing відновлює стійкість до доксорубіцину в клітинах раку людини кишечнику. Дослідження молекулярного раку 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Методика оцінки екстракції ДНК Fusarium з міцелій та пшениці для кількісного визначення послідовності ПЛР в режимі реального часу та кореляції з рівнем мікотоксину . Журнал мікробіологічних методів 2008 року.
  • Фріче К., Сітз М., Вайленд Н., Брейтлінг Р., Поль Х.Д. (2007): Характеристика поведінки росту Leishmania tarentolae - нова експресійна система для рекомбінантних білків. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Рістола М., Арп'яенен С., Сейлем М. А., Матісон П. У., Валлійська Г. І., Лехтонен С., Холтёфер Г. (2009): Регулювання гену Neph3 в підсистемі - основні ролі факторів транскрипції NF-κB та Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Родрігес Дж., Вівес Л., Жорда М., Моралес С., Муноз М., Вендрелл Е., Пейнадо М. А. (2008): Повне відстеження генома неметилированной ДНК Alu у звичайних та ракових клітинах. Дослідження нуклеїнових кислот Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Гістидин триад білка Hint1 тригерів апоптозу незалежно від його ферментативної активності. Журнал біологічної хімії. Т. 281, No. 37, 2006. 27356-27366.


Факти варті знати

Ультразвукова та акустична кавітація створює сильно інтенсивні сили, що сприяють процесам кристалізації та осадження (натисніть, щоб збільшити!)

Наркологія ультразвукової ДНК заснована на акустичній кавітації та її гідродинамічних зсувних силах