Ультразвукова фрагментація ДНК

Під час фрагментації ДНК і РНК довгі молекули ДНК розбиваються на менші фрагменти, що є важливим етапом підготовки зразків для створення бібліотек для секвенування нового покоління (NGS). Ультразвукова фрагментація ДНК використовує сили акустичної кавітації для розщеплення ДНК або РНК на фрагменти розміром від 100 bp до 5 kb. Цей метод дає змогу точно контролювати розмір фрагментів, полегшуючи отримання ДНК бажаної довжини для оптимальних результатів секвенування.

Фрагментація ДНК за допомогою ультразвукової обробки

Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні ультразвукові рішення для фрагментації ДНК, РНК і хроматину. Виберіть ультразвуковий апарат зондового типу (наприклад, UP100H) для прямої ультразвукової обробки з використанням мікронаконечника або використовуйте VialTweeeter чи ультразвуковий cuphorn для одночасної непрямої підготовки ДНК у різних зразках. Hielscher пропонує ідеальний пристрій з урахуванням ваших потреб: незалежно від того, чи маєте ви 1 зразок або до 10 зразків, об’ємом від мікролітрів до літрів – ультразвукові апарати Hielscher задовольнять ваші вимоги до отримання фрагментів ДНК, РНК і хроматину потрібної довжини. Відтворюваність, простота експлуатації та точний контроль дають змогу отримати надійну бібліотеку для секвенування нового покоління.
На відміну від ферментативної фрагментації ДНК, ультразвукова фрагментація використовує суто механічні зсувні сили без додавання будь-яких хімічних речовин. Завдяки точному налаштуванню параметрів процесу ультразвукова фрагментація дає змогу отримувати фрагменти ДНК із високою молекулярною масою (плазмідної та геномної ДНК).
Очищені нуклеїнові кислоти можна ампліфікувати до або після етапу фрагментації.
Параметри ультразвукової обробки (потужність, імпульсний цикл / серії імпульсів, час і температура) можна безпечно контролювати за допомогою програмних налаштувань.

Протоколи ультразвукової фрагментації ДНК

Для аналізу методом імунопреципітації хроматину

Стисло: клітини висівали в чашки діаметром 60mm (400 000 клітин на чашку) і трансфікували siRNA до RhoA (як описано); через 72 h їх інкубували з формальдегідом (кінцева концентрація, 1%) протягом 10 min за температури 37°C для утворення поперечних зшивок між білками та ДНК. Реакцію поперечного зшивання зупиняли додаванням однієї десятої об’єму розчину гліцину з концентрацією 1,25 mol/L, отримуючи кінцеву концентрацію 125 mmol/L. Клітини двічі промивали охолодженим на льоду PBS, ресуспендували в буфері для радіоімунопреципітаційного аналізу [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолату, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], що містив 1 mmol/L фенілметилсульфонілфториду, 1 Ag/mL апротиніну та 1 Ag/mL пепстатину A, і витримували на льоду протягом 30 min. Потім клітинні лізати обробляли ультразвуком на льоду за допомогою ультразвукового апарата Hielscher UP200S (3 x 40 s, амплітуда 40%, цикл 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), доки поперечно зшитий хроматин не фрагментувався з утворенням фрагментів ДНК розміром від 200 до 1 000 bp. Одну десяту всього лізату використовували для кількісного визначення ДНК у різних зразках і вважали «загальною вхідною ДНК». Супернатанти інкубували з 50% суспензією ДНК сперми лосося/білка на агарозі для зниження неспецифічного фону. Потім проводили імунопреципітацію протягом ночі за температури 4°C з 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) або без антитіл (негативний контроль). До цих супернатантів додавали 5 mol/L NaCl і нагрівали протягом ночі за температури 65°C для усунення поперечних зшивок між білками та ДНК. Імунні комплекси додатково обробляли протеїназою K, вільною від ДНКаз і РНКаз, а ДНК очищали шляхом фенол-хлороформної екстракції та осадження етанолом. ПЛР проводили зі специфічними праймерами, що відповідали послідовності в промоторній ділянці гена iNOS людини (праймер p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; праймер p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Дослідження експресії EGFP

Для досліджень експресії рекомбінантний штам L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Німеччина) з геном EGFP (посиленого зеленого флуоресцентного білка), інтегрованим у хромосомний локус ssu, культивували в різних середовищах, як описано раніше, з додатковим внесенням 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Німеччина). Під час культивування відбирали зразки об’ємом 1 ml, центрифугували (2000 × g, 20°C, 10 min) і промивали розчином 0,9% NaCl. Осад ресуспендували в буфері (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) і руйнували шляхом ультразвукової обробки за допомогою ультразвукового процесора UP400S (підведення енергії ∼ 400 Ws). Клітинні рештки видаляли центрифугуванням (6000 × g, 4°C, 5 min) та аналізували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE) у відновних умовах за методом Laemmli (1970) з використанням 12,5% поліакриламідних гелів. Експресію EGFP досліджували в культурі, яку перемішували. (Fritsche et al. 2007)

Імунопреципітація хроматину

Аналіз методом імунопреципітації хроматину проводили з використанням ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Карлсбад, Каліфорнія, США) згідно з інструкціями виробника з деякими модифікаціями. Коротко, диференційовані подоцити людини піддавали поперечному зшиванню за допомогою 1% формальдегіду протягом 10 min за кімнатної температури. Клітини промивали охолодженим на льоду PBS, а реакцію фіксації зупиняли додаванням 0,125 M гліцину на 5 min за кімнатної температури. Клітини знову промивали охолодженим на льоду PBS і зішкрібали з чашки. Клітини осаджували центрифугуванням і ресуспендували в буфері для лізису. Після центрифугування осаджені ядра ресуспендували в буфері для фрагментації, інкубували на льоду протягом 30 min, а хроматин фрагментували шляхом ультразвукової обробки, наприклад за допомогою UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Тельтов, Німеччина) за потужності 25%, застосовуючи на льоду 5 імпульсів по 20 sec кожний, до фрагментів розміром приблизно 200–600 bp. Фрагментований хроматин потім центрифугували та збирали надосадову рідину. Для імунопреципітації 60 μl хроматину інкубували з 1 μg антитіл до Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Каліфорнія, США), NF-κB p65 (Abcam, Кембридж, Велика Британія) або NF-κB p50 (Abcam) чи з кролячим IgG (Zymed Laboratories) як негативним контролем протягом ночі за 4°C з обережним обертанням. Імунні комплекси, зв’язані з магнітними мікросферами, збирали за допомогою магнітного штатива, ретельно промивали, після чого руйнували поперечні зв’язки між білками та ДНК й елюювали ДНК для аналізу методом ПЛР у реальному часі. (Ristola et al. 2009)

Підготовка ДНК EHEC для аналізу на мікрочипах

Підготовка клітинних лізатів і екстрагованої ДНК
Бактеріальні осади, суспендовані в PBS до бажаної кінцевої концентрації, обробляли за допомогою ультразвукового дезінтегратора UP100H (Hielscher GmbH, Німеччина), оснащеного мікронаконечником MS1 (діаметром 1mm). Робоча частота становила 30 kHz, а ефективна вихідна потужність – 100 W. Під час роботи зразки охолоджували у водяній бані з льодом, перемішували та центрифугували. Зразки використовували для досліджень методом проточної цитометрії, а для подальшої роботи їх піддавали термічній обробці (95°C, 5 min). Неочищені клітинні лізати обробляли сумішшю фенол:хлороформ:ізоаміловий спирт (25:24:1). До зразка лізату додавали рівний об’єм цієї суміші, розчин інтенсивно перемішували на вортексі протягом 15 s і центрифугували при 15 000 x g протягом 2 min за кімнатної температури (RT), приблизно 22°C. Верхню водну фазу, що містила геномну ДНК, обережно відокремлювали та переносили в нову стерильну пробірку Eppendorf.
Потім зразки піддавали ультразвуковій обробці для фрагментації ДНК. Етап ультразвукової обробки проводили за тих самих умов, що описані вище. Для оцінювання впливу фрагментації на геномну ДНК зразки аналізували методом електрофорезу в агарозному гелі.
(…) Зразки, попередньо оброблені ультразвуком протягом 2,5 min, після термічної обробки та центрифугування піддавали екстракції. Вивільнену ДНК двічі екстрагували сумішшю фенол:хлороформ:ізоаміловий спирт, а потім піддавали повторній ультразвуковій обробці протягом 0 – 15 min. Електрофорез в агарозному гелі використовували для визначення розподілу за розмірами ДНК, підданої ультразвуковій фрагментації після екстракції (рис. угорі праворуч). Про значну фрагментацію ДНК свідчила наявність дифузного шлейфу ДНК замість високомолекулярних смуг, які зникали у зразках, оброблених ультразвуком протягом 2,5 min або довше. Триваліша ультразвукова обробка поступово зменшувала довжину фрагментів приблизно до 150 – 600 bp, а обробка протягом 15 min спричиняла подальшу деградацію цих фрагментів, що видно переважно за верхньою частиною шлейфу. Отже, середній розмір фрагментів ДНК поступово зменшувався зі збільшенням тривалості ультразвукової обробки, а обробка протягом 5 min давала змогу отримати фрагменти ДНК розмірів, найбільш придатних для аналізу на мікрочипах. Зрештою було розроблено процедуру підготовки ДНК для аналізу, яка включала спочатку 2 min ультразвукової обробки, екстракцію ДНК (2×) та подальшу ультразвукову обробку протягом 5 min. (Basselet et al. 2008)

Імунопреципітація хроматину (ChIP)

Клітини HEK293 культивували, як описано вище, та фіксували за допомогою 2 mM дисукцинімідилглутарату протягом 45 min за кімнатної температури. Потім клітини двічі промивали PBS. Хроматин піддавали поперечному зшиванню протягом 10 min за кімнатної температури з використанням 1% (v/v) формальдегіду та двічі промивали охолодженим на льоду PBS. Реакцію поперечного зшивання зупиняли інкубацією з гліцином у кінцевій концентрації 0,125 M протягом 5 min за кімнатної температури. Після інкубації з трипсином клітини зішкрібали з чашки для культивування клітин і двічі промивали PBS. Клітинний осад ресуспендували в буфері для лізису (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl та 0,5% (v/v) Nonidet P-40), інкубували на льоду протягом 10 min і гомогенізували за допомогою гомогенізатора Даунса. Потім ядра осаджували центрифугуванням (3500 x g, 5 min, 4 °C) і ресуспендували в буфері для ядер (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA та 1% (w/v) SDS). Ядра руйнували ультразвуковою обробкою трьома імпульсами тривалістю 20 s кожен в ультразвуковому апараті UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) з налаштуванням циклу 0,5 та амплітудою 30%, отримуючи фрагменти геномної ДНК, переважна частина яких мала розмір 200 – 1000 bp. Для ChIP 50g ДНК розводили в 4 рази в буфері для імунопреципітації (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 та 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Аналіз модифікацій гістонів методом імунопреципітації хроматину (ChIP)

Коротко: 6 x 10⁶ клітин двічі промивали PBS і піддавали поперечному зшиванню на культуральному планшеті протягом 15 min за кімнатної температури в присутності 0,5% формальдегіду. Реакцію поперечного зшивання зупиняли додаванням 0,125 M гліцину. Усі наступні етапи проводили за температури 48°C. Усі буфери попередньо охолоджували, і вони містили інгібітори протеаз (Complete Mini, Roche). Клітини двічі промивали PBS, а потім зішкрібали. Зібрані осади розчиняли в 1 ml буфера для лізису (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) та піддавали ультразвуковій обробці в холодній етанольній бані протягом 10 циклів за амплітуди 100% за допомогою ультразвукового гомогенізатора UP50H (Hielscher, Teltow, Німеччина). Фрагментацію хроматину візуалізували в 1% агарозному гелі. Отримані фрагменти мали розміри в діапазоні 200–500pb. Розчинний хроматин отримували центрифугуванням зразків після ультразвукової обробки за 14 000g протягом 10 min за температури 48°C. Розчинну фракцію розводили 1/10 у буфері для розведення (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), потім розподіляли на аліквоти та зберігали за температури 80°C до використання. (Rodriguez et al. 2008)