Ультразвуковий лізис кишкової палички
- Бактерії кишкової палички є найбільш часто використовуваними бактеріями в мікробіології та біотехнології.
- Ультразвукові руйнівники клітин забезпечують надійні та відтворювані результати лізису кишкової палички.
- Інтенсивні, але точно контрольовані кавітаційні та зсувні сили призводять до повного руйнування та високих виходів екстракції (наприклад, білків, ДНК).
Чому ультразвукове руйнування клітин кишкової палички є кращим методом?
Ультразвукові гомогенізатори або ультразвукові апарати зондового типу мають кілька переваг для лізису кишкової палички, оскільки інтенсивний ультразвук ефективно руйнує клітинні стінки та мембрани. Ультразвукові апарати зондового типу широко використовуються при лізисі кишкової палички з наступних причин:
Екстракція білка з клітин E.coli ефективно виконується за допомогою ультразвуковий зонд UP200St
Ультразвуковий апарат зондового типу має багато переваг для лізису кишкової палички. Надійний і точний контроль параметрів ультразвукового процесу дозволяє оптимізувати робочі параметри, такі як потужність, тривалість і обробка зразків, для досягнення бажаних результатів.
Електрофоретичні аналізи геномної ДНК кишкової палички EDL933 піддавали ультразвуку тривалістю 0 – 15 хв. L вказує на сходи ДНК.
(дослідження та зображення: ©Basselet et al. 2008)
Руйнування клітин за допомогою ультразвукової кавітації
Гомогенізатори ультразвукового зондового типу працюють приблизно з 20 000 циклів в секунду (на частоті 20 кГц) і викликають кавітацію в рідинах або суспензіях. Акустична кавітація, мікроскопічні ділянки вакуумного тиску і високих температур, які розривають клітини. Хоча температура може досягати кількох тисяч градусів за Цельсієм, обсяги кавітації настільки малі, що не нагрівають процес значно. Ультразвук генерує акустичну кавітацію та зсувні сили, перфорують або розривають клітинну мембрану бактеріальних клітин, таких як E.coli. Ультразвукові апарати Hielscher дозволяють точно контролювати параметри процесу, такі як інтенсивність ультразвуку, амплітуда, вхідна енергія та температура. Таким чином, процес ультразвукового лізису може бути оптимально налаштований відповідно до типу клітини, культури клітин і мети процесу.
- точний контроль лізису (інтенсивність, амплітуда, температура)
- Надійні, відтворювані результати
- оптимальна адаптація до конкретних зразків
- Контроль температури
- для дуже малих і дуже великих зразків (мкл в літри)
- Чисто механічна обробка
- Зручна та безпечна експлуатація
- Лінійне масштабування від лабораторії до виробництва
VialTweeter для ультразвукового лізису
Ультразвуковий гомогенізатор проти інших методів лізису
У той час як хімічний та ферментативний лізис може бути проблематичним – Оскільки хімічний лізис може змінити білкові структури та спричинити проблеми з очищенням, а ферментативний лізис вимагає тривалого часу інкубації та не відтворюється – Ультразвукове руйнування – це складний, швидкий метод руйнування клітин.
Ультразвуковий лізис заснований тільки на механічних силах. Хімічні речовини не додаються, ультразвук розриває клітинну стінку під дією зсувних сил. Хімічний лізис може змінити структуру білка та спричинити проблеми з очищенням. Ферментативне порушення вимагає тривалого часу інкубації і не відтворюється. Ультразвукове руйнування клітин бактерій E.coli є швидким, простим, надійним і відтворюваним. Саме тому ультразвукові апарати Hielscher використовуються в біологічних та біохімічних лабораторіях по всьому світу для підготовки зразків, преанлітики, діагонстики in vitro та різноманітного аналізу.
Загальні рекомендації по проведенню ультразвукового лізису
Ультразвукова хвороба є найбільш популярною методикою лізування дуже маленьких, середніх і великих кількостей клітинних суспензій – від піко-літрів до 100 л/год (за допомогою ультразвукової проточної камери). Клітини лізуються за допомогою рідинного зсуву і кавітації. ДНК також зрізається під час ультразвуку, тому додавати ДНКазу в клітинну суспензію не потрібно.
Контроль температури під час ультразвукового лізису E.coli
Попередньо охолоджуючи зразок і зберігаючи зразок під час ультразвуку на льоду, можна легко запобігти термічній деградації зразка зразка.
В ідеалі зразки повинні зберігатися в крижаному стані під час лізису, але для більшості зразків достатньо, якщо температура не піднімається вище температури культури або джерела тканини. Тому рекомендується тримати суспензію на льоду і проводити ультразвукові дослідження декількома короткими ультразвуковими імпульсами по 5-10 сек і паузами по 10-30 сек. Під час пауз тепло може розсіюватися, щоб знову встановити низьку температуру. Для більших зразків клітин доступні різні реактори з проточними комірками з сорочками охолодження.
Детальні поради та рекомендації щодо успішного проведення ультразвукового лізису читайте тут!
Протоколи ультразвукового приготування лізатів кишкової палички
Дослідники використовують ультразвукові гомогенізатори Hielscher для руйнування клітин E.coli. Нижче ви можете знайти різні перевірені та перевірені протоколи лізису E.coli з використанням ультразвукових гомогенізаторів Hielscher для різних застосувань, пов'язаних з кишковою паличкою.
Ріст клітин, зшивання та отримання екстрактів клітин кишкової палички за допомогою ультразвуку
Для SeqA та РНК-полімерази ChIP-Chip E. coli MG1655 або MG1655 ΔseqA вирощували при 37 °C до ОР600 приблизно 0,15 в 50 мл ЛБ (+ 0,2% глюкози) до додавання 27 мкл формальдегіду (37%) на мл середовища (кінцева концентрація 1%). Зшивання проводили при повільному струшуванні (100 об/хв) при кімнатній температурі протягом 20 хв з подальшим загартуванням 10 мл 2,5 М гліцину (кінцева концентрація 0,5 М). Для експериментів з тепловим шоком E. coli MG1655 вирощували в середовищі 65 мл LB при 30 °C до ОД600 приблизно 0,3. Згодом 30 мл культури переносили в попередньо підігріту колбу при 43 ° С, а решту зберігали при 30 ° С. Зшивання і загартування відбувалося так, як описано вище, за винятком того, що клітини витримували при температурі 30 або 43 ° C протягом 5 хв перед подальшим повільним струшуванням при кімнатній температурі. Клітини збирали центрифугуванням і двічі промивали холодним TBS (рН7,5). Після повторної суспензії в буфері лізису 1 мл (10 мМ Tris (рН 8,0), 20% сахарози, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЕДТА, 10 мг/мл лізоциму) та інкубації при 37 °C протягом 30 хв з додаванням 4 мл IP-буфера клітини проводили ультразвукову обробку на льоду з 12 перервами по 30 с і 30 сек за допомогою ультразвукового процесора Hielscher UP400St при 100% потужності. Після центрифугування протягом 10 хв при 9000 г зберігали 800 мкл аліцитат супернатанту при -20 °С. (Waldminghaus 2010)
Перевиробництво та очищення ферментів за допомогою ультразвукового зонда
Для гіперпродукції білків, мічених декагістидином (His10), E. coli BL21(DE3) була трансформована за допомогою конструкцій pET19b. За одну ніч прекультуру збирали центрифугуванням, а 1% використовували для інокуляції культури експресії. Клітини, що несуть pET19mgtB, вирощували при 22 °C до оптичної щільності при 600 нм (OD600) 0,7. Культуру переводили при температурі 17 °C та індукували 100 мкМ IPTG. Через 16 год культуру збирали центрифугуванням при 7500 × г при 4 °С. Клітини були ресуспендовані в 50 мМ фосфат-буферизованому фізіологічному розчині (PBS) з 0,3 M NaCl при рН 7,4 і порушені ультразвуком за допомогою сонотрида з мікро-наконечником S2 на ультразвуковому пристрої Hielscher UP200St з циклом 0,5 і амплітудою 75%.
Гіперпродукція GtfC, міченого декагістидином, була індукована при 37 °C при ОД600 0,6 з 100 мкМ IPTG. Потім клітини інкубували протягом 4 год, збирали та лізували, як зазначено вище для MgtB.
Екстракти неочищених клітин центрифугували при 15 000 × г і 4 °C для осадження залишків клітин. Освітлені екстракти були завантажені на колонки HisTrap FF Crude об'ємом 1 мл за допомогою системи ÄKTAprime Plus. Ферменти були очищені відповідно до протоколу виробника для градієнтного елюювання білків, мічених His. Розчини елюйованих білків двічі діалізували проти 1000 об'ємів 50 мМ PBS, рН 7,4, з 0,3 М NaCl при 4 °C. Очищення було проаналізовано за допомогою 12% SDS-PAGE. Концентрацію білка визначали за методом Бредфорда за допомогою Роті-Квант. (Rabausch et al. 2013)
Ультразвукова екстракція білка бактерій кишкової палички
Білок-приманка, що представляє інтерес (в даному випадку, MTV1 Arabidopsis thaliana) злитий з GST міткою і експресується в клітинах BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Візьміть по одній гранулі GST-MTV1 і GST (що відповідає 50 мл бактеріальної культури) і повторно суспендуйте кожну в буфері для холодної екстракції об'ємом 2,5 мл.
- Використовуйте ультразвуковий апарат UP100H (оснащений мікронаконечником-сонотродом MS3 для невеликих об'ємів приблизно 2-5 мл) для руйнування бактеріальних клітин до їх лізування, про що свідчить знижена помутніння та підвищена в'язкість. Це потрібно проводити на льоду, і рекомендується проводити ультразвукове дослідження через певні проміжки часу (наприклад, ультразвукове дослідження тривалістю 10 секунд з подальшою паузою на льоду і так далі). Слід бути обережним, щоб не проводити ультразвукові дослідження з занадто високою інтенсивністю. При виявленні піноутворення або утворення білого осаду інтенсивність потрібно знизити.
- Перемістіть розчин лізованих бактерій у мікроцентрифужні пробірки об'ємом 1,5 мл і центрифугуйте при температурі 4 °C, 16 000 x g протягом 20 хв.
Ультразвукові апарати зондового типу, такі як UP400St використовувати робочий принцип акустичної кавітації для ефективного лізису E.coli.
Аналіз експресії та очищення рекомбінантного білка за допомогою ультразвукового апарату
Гранулу кишкової палички проводили ультразвукове дослідження за допомогою ультразвукового апарату Hielscher UP100H. Для цього гранули клітин ресуспендували в охолодженому лізисному буфері (50 мМ Tris-HCl pH = 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ DTT, 1 мМ PMSF) і охолоджували на льоду протягом 10 хв. Потім суспензію клітин проводили ультразвуковим звуком з 10 короткими сплесками по 10 с з подальшим інтервалом в 30 с для охолодження. Нарешті, залишки клітин видаляли ультрацентрифугуванням при 4°С протягом 15 хв при 14000 об/хв. Для підтвердження експресії rPR супернатант проводили на 12% поліакриламідному гелі та аналізували за методами SDS-PAGE та вестерн-блоттингу. Очищення rPR проводилося з використанням смоли Ni2+-NTA (Invitrogen, США) згідно з інструкцією виробника. На цьому етапі використовувався рідний метод очищення. Чистоту очищеного білка оцінювали за допомогою електрофорезу на 12% поліакриламідному гелі та подальшого фарбування Coomassie blue. Концентрацію очищеного білка вимірювали за допомогою набору для аналізу білків Micro BCA (PIERCE, США). (Азарнежад та ін., 2016)
Ультразвукові гомогенізатори для лізису кишкової палички
Hielscher Ultrasonics розробляє, виробляє та постачає високоефективні ультразвукові гомогенізатори для надійного та ефективного лізису бактерій E. coli та інших типів клітин, тканин та клітинних культур.
Широкий асортимент ультразвукових зондів, а також систем непрямого ультразвукового випромінювання дозволяє нам запропонувати вам ідеальний ультразвуковий гомогенізатор тканин для руйнування та екстракції клітин.
Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині
Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Розумне програмне забезпечення, інтуїтивно зрозуміле меню, програмовані налаштування та автоматичне протоколювання даних – це лише деякі особливості ультразвукових систем Hielscher. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в науково-дослідні та біотехнологічні установи. Навіть з важкими умовами та складними умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.
Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових апаратів:
| Об'єм партії | Витрата | Рекомендовані пристрої |
|---|---|---|
| Багатолункові / мікротитрові пластини | Н.А. | UIP400MTP |
| CupHorn для флаконів або мензурки | Н.А. | Ультразвуковий CupHorn |
| Ультразвуковий мікропотоковий реактор | Н.А. | GDmini2 |
| до 10 флаконів об'ємом від 0,5 до 1,5 мл | Н.А. | VialTweeter |
| 0від .5 до 1.5 мл | Н.А. | VialTweeter |
| Від 1 до 500 мл | Від 10 до 200 мл/хв | UP100H |
| Від 10 до 2000 мл | Від 20 до 400 мл/хв | UP200Ht, UP400St |
| 0від 1 до 20 л | 0від .2 до 4 л/хв | UIP2000HDT |
| Від 10 до 100 л | Від 2 до 10 л/хв | UIP4000 |
| Н.А. | Від 10 до 100 л/хв | UIP16000 |
| Н.А. | Більше | кластер UIP16000 |
Зв'яжіться з нами! / Запитайте нас!
Додаткові протоколи ультразвукового лізису кишкової палички
Модифіковані аліцином білки в кишковій паличці за допомогою ультразвукового VialTвітера
Визначення вмісту сульфгідрилів за допомогою аналізу 5,5'-дітіобіс (2-нітробензойна кислота) (DTNB)
Нічна культура E. coli MG1655 була використана для інокуляції мінімального середовища MOPS (1:100). Культуру вирощували аеробним способом до досягнення показника А600 0,4. Культуру розділили на три культури по 15 мл для лікування стресу. Необроблена культура служила негативним контролем. 0,79 мМ аліцину (128 мкг мл-1) або 1 мМ діаміду додавали до однієї з двох культур, що залишилися, кожна. Культури інкубували протягом 15 хв. Методом центрифугування збирали по 5 мл кожної культури (8525 × г, 4 °С, 10 хв). Клітини двічі промивали 1 мл PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4, рН 7,4, зберігали анаеробно перед використанням) і центрифугували (13 0×00 мМ NaCl, 4 °C, 10 хв). Клітини були ресуспендовані в лізисному буфері (PBS з 6 мМ гуанідинію HCl, рН 7,4) перед порушенням при 4 °C за допомогою ультразвуку (VialTweeter ультразвукорежисер, Hielscher GmbH, Німеччина) (3 × 1 хв). Залишки клітин гранулювали центрифугуванням (13 000 × г, 4 °C, 15 хв). Супернатант переносили в кювету QS-макро об'ємом 3,5 мл (10 мм) з магнітною планкою для перемішування і змішували з 1 мл лізисного буфера. Згасання зразків відстежували при 412 нм за допомогою спектрофотометра Jasco V-650, оснащеного тримачем комірки PSC-718 з контрольованою температурою при кімнатній температурі. Було додано 100 мкл розчину дітіобісу (2-нітробензойної кислоти) розміром 3 мМ. За вимиранням стежили до тих пір, поки воно не досягло насичення. Розрахунок концентрації тіолу проводився з використанням коефіцієнта екстинкції ε412 = 13 700 м-1 См-1 для тіо-2-нітробензойної кислоти (ТНБ). Концентрацію тіолу в клітинах розраховували на основі об'єму клітин E. coli 6,7 × 10-15 літр і щільність клітин А600 = 0,5 (еквівалентно 1 × 108 клітини мл-1 культури). (Müller et al. 2016)
Визначення глутатіону in vivo за допомогою ультразвукового дробарки клітин
E.coli MG1655 вирощували в мінімальному середовищі MOPS загальним об'ємом 200 мл, поки не було досягнуто A600 0,5. Культуру розділили на культури по 50 мл для лікування стресу. Після 15 хв інкубації з 0,79 мМ аліцину, 1 мМ діаміду або диметилсульфоксиду (контроль) клітини збирали по 4000 г при 4 °C протягом 10 хв. Клітини двічі промивали буфером KPE перед повторним суспендуванням гранул у 700 мкл буфера KPE. Для депротеїнації додавали 300 л 10% (ж/об) сульфосаліцилової кислоти перед руйнуванням клітин ультразвуковим випромінюванням (3 х 1 хв; VialTweeter ультразвуковий апарат). Супернатанти збирали після центрифугування (30 хв, 13 000 г, 4 °С). Концентрація сульфосаліцилової кислоти знижувалася до 1% шляхом додавання 3 об'ємів буфера КПЕ. Вимірювання загального глутатіону та GSSG проводили, як описано вище. Концентрація глутатіону в клітинах була розрахована на основі об'єму клітин E. coli 6,7×10-15 літр і щільність осередків А600 0,5 (еквівалентно 1×108 клітини мл-1 культури). Концентрацію GSH розраховували шляхом віднімання 2[GSSG] від загальної кількості глутатіону. (Müller et al. 2016)
Експресія людського mAspAT у E. coli за допомогою ультразвукового гомогенізатора
Одиночна колонія E. coli BL21 (DE3) містила вектор експресії в 30 мл середовища Лурія-Бертані (LB), що містить 100 мкг/мл ампіциліну, а потім культивувалася при 37 ºC до оптичної щільності (OD600) досягла 0,6. Клітини збирали шляхом центрифугування при дозуванні 4000 × г протягом 10 хв і ресуспендували в 3 л свіжого середовища LB, що містило 100 мкг/мл ампіциліну.
Згодом експресію білка індукували за допомогою 1 мМ ізопропілового β-ᴅ-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) протягом 20 год при 16ºC. Клітини збирали центрифугуванням при 8000 × г протягом 15 хв і промивали буфером А (20 мМ NaH2PO4, 0,5 М NaCl, рН 7,4). Приблизно 45 г (з вологою вагою) клітин було отримано з 3 л культури. Після центрифугування гранули клітин були ресуспендовані в буфері для холодної екстракції А об'ємом 40 мл (для культури 1 л) і лізовані методом ультразвукового випромінювання при крижаній температурі за допомогою ультразвукової дробарки Hielscher UP400St. Лізис клітин центрифугували при 12 000 об/хв протягом 15 хв для розділення розчинної (супернатант) та осадженої (гранули) фракцій. (Цзян та ін., 2015)
Факти, які варто знати
Кишкова паличка
Кишкова паличка (E. coli) – грамнегативна, факультативно анаеробна, паличкоподібна, коліформна бактерія роду Escherichia, яка зазвичай зустрічається в нижніх відділах кишечника теплокровних організмів (ендотерм). Існує велика кількість штамів (або підтипів) кишкової палички з різноманітними характеристиками. Більшість штамів E. coli нешкідливі для людини, наприклад, штами B і K-12, які зазвичай використовуються для досліджень у лабораторіях. Однак деякі штами шкідливі і можуть викликати серйозні захворювання.
Кишкова паличка відіграє важливу роль у сучасній біологічній інженерії та промисловій мікробіології, оскільки бактеріями легко маніпулювати. Поширені лабораторні застосування, які часто передбачають використання кишкової палички, наприклад, для створення рекомбінантної дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або для виконання ролі модельного організму.
Кишкова паличка є дуже універсальним хазяїном для виробництва гетерологічних білків, і різноманітні системи експресії білків доступні для виробництва рекомбінантних білків у E. coli. Використовуючи плазміди, які забезпечують високий рівень експресії білка, бактерії можуть вводити гени, що дозволяє виробляти такі білки у великих кількостях у промислових процесах ферментації.
E.coli використовуються як фабрики клітин для виробництва інсуліну. Подальші застосування включають використання модифікованих клітин E. coli для розробки та виробництва вакцин та іммобілізованих ферментів, для виробництва біопалива, а також для біоремедіації.
Штам К-12 є мутантною формою кишкової палички, яка надмірно експресує фермент лужну фосфатазу (ЛФ). Ця мутація відбувається через дефект гена, який постійно кодує фермент. Якщо ген продукує продукт без будь-якого інгібування, це називається конститутивною активністю. Ця специфічна мутантна форма використовується для виділення і очищення ферменту ЛФ.
Бактерії кишкової палички також широко використовуються як фабрики клітин. Сконструйовані мікроби (наприклад, бактерії) і рослинні клітини можуть використовуватися як так звані фабрики клітин. Ці генетично модифіковані клітини виробляють молекули, хімічні речовини, полімери, білки та інші речовини, які використовуються, наприклад, у фармацевтичній, харчовій та хімічній промисловості. Щоб вивільнити молекули, що утворюються всередині таких біоінженерних клітин, ультразвуковий лізис є поширеним методом руйнування клітинних стінок і перенесення цільових речовин у навколишню рідину. Дізнайтеся більше про лізис біоінженерних клітин!
Ультразвукове зрізання ДНК
Ультразвукові сили зсуву є широко використовуваним методом для вивільнення молекул, органел і білків із внутрішньої частини клітини, а також для розриву ланцюгів ДНК на частини. Акустична кавітація розриває клітинні стінки і мембрани, щоб витягти ДНК з клітин і утворити фрагменти близько 600 – Довжина 800 п.н., що ідеально підходить для аналізу.
Натисніть тут, щоб дізнатися більше про ультразвукові гомогенізатори для фрагментації ДНК!
Література / Список літератури
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори з Лабораторії до промислові розміри.