Ультразвуковий Лизис E. Coli

• Бактерії E. coli є найбільш часто використовуваними бактеріями в мікробіології та біотехнології.
• Ультразвукові розлади клітин забезпечують надійні та відтворювані результати для лізису E. coli.
• Інтенсивні, але точно керовані сили кавітації та зсуву призводять до повного зриву та високої врожайності (наприклад, білків, ДНК).

Розбиття клітин за допомогою кавітації

Гомогенізатори з ультразвуковим зондом працюють з прибл. 20 000 циклів у секунду (при 20 кГц) і викликають кавітацію у рідинах або наповнювачах. Акустичні кавітаційні мікроскопічні області вакуумного тиску і високі температури, що розривають окремі клітини. Хоча температура може досягати декількох тисяч градусів за Цельсієм, кавітаційні обсяги настільки малі, що вони не суттєво нагрівають процес. Ультразвукова сформована акустична кавітація і сили зсуву перфорацію або розриву клітинної мембрани E.coli – залежно від настройки пристрою ультразвукового гомогенізатора.

Переваги ультразвукового лізису

• точний контроль лізису (інтенсивність, амплітуда, температура)
• оптимальна адаптація до конкретних зразків
• контроль температури
• для дуже малих або дуже великих зразків (μL до літрів)
• чиста механічна обробка
• лінійне збільшення від лабораторії до виробництва

Хоча хімічний і ензимний лізис може бути проблематичним – оскільки хімічний лізис може змінити білкові структури та вводити проблеми очищення, і ферментативний лізис вимагає тривалого часу інкубації і не відтворюється – ультразвуковий зрив - це складний, швидкий спосіб розриву клітин.
Ультразвуковий лізис заснований тільки на механічних силах. Хімічні речовини не додаються, звуження ламає клітину стінки силами сівші. Хімічний лізис може змінювати структуру білка і вводити проблеми з очищенням. Загадковий зрив вимагає тривалих інкубаційних часів і не відтворюється. Порушення ультразвукових клітин клітин бактерій E.coli є швидким, простим, надійним і відтворюваним. Саме тому ультразвукові апарати Hielscher використовуються в біологічних і біохімічних лабораторіях по всьому світу для підготовки зразків, доананлитики, діагонстики in-vitro і аналізів колекторів.

Загальні рекомендації

Захворювання є найпопулярнішою технікою для лізингу дуже малих, середніх і великих кількостей клітинних суспензій – від піко-літрів до 100л / год (за допомогою ультразвукової проточної комірки). Клітини лізували рідким зсувом та кавітацією. ДНК також знімається під час обробки ультразвуком, тому не слід додавати DNase до клітинної суспензії.
Контроль температури:
Заздалегідь охолоджуючи зразок та зберігаючи зразок під час ультразвукової обробки на льоді, можна легко запобігти пробковому термічному розкладі зразка.
В ідеалі, зразки повинні зберігатися крижаної холодної під час лізису, але для більшості зразків це достатньо, якщо температура не піднятися вище температури культури або тканини джерело. Тому рекомендується, щоб зберегти підвіску на льоду і Соника з декількома короткими ультраакустико імпульсів 5-10 сек і пауз 10-30 сек. Під час пауз, тепло може розсіюватися з метою повторного встановлення низької температури. Для великих стільникових зразків, різні потоки клітин потоку з охолоджувачами доступні.

Протоколи підготовки лізатів E. Coli

Аналіз експресії та очищення рекомбінантного білка

Гранули E. coli обробляли ультразвуковою системою UP100H (Хілешер). З цією метою клітинку гранули ресуспендували у охолодженому лізисному буфері (50мМ Трис-НСl, рН = 7,5, 100мМ NaCl, 5мМ ДТТ, 1мМ ПМСФ) та охолоджували на льоді протягом 10 хв. Потім клітинну суспензію обробляли ультразвуком з 10 коротких вибухів 10 с з інтервалом 30 с для охолодження. Нарешті, залишок клітин був видалений за допомогою ультрацентріфугування при 4 ° С протягом 15 хвилин при 14000 об / хв. Для підтвердження вираження rPR надосадку пропускали на 12% поліакриламідного гелю та аналізували за допомогою SDS-PAGE та Western blotting. Очищення rPR проводилось з використанням Ni²⁺-НТА смоли (Invitrogen, США) відповідно до керівництва виробника. На цьому етапі використовувався метод власного очищення. Чистоту очищеного білка оцінювали за допомогою електрофорезу на 12% поліакриламідному гелі та наступному забарвленні синього Кумассі. Концентрацію очищеного протеїну вимірювали за допомогою комплексу мікро BCA-аналізу білка (PIERCE, США). (Азарнежад та ін 2016)

Рост клітин, зшивання і одержання клітинних екстрактів E. coli

Для SeqA та РНК-полімерази ChIP-Chip E. coli MG1655 або MG1655 ΔseqA вирощували при 37 ° С до ОД₆₀₀ приблизно 0,15 в 50 мл LB (+ 0,2% глюкози) до додавання 27мкл формальдегіду (37%) на 1 мл середовища (кінцева концентрація 1%). Зшивання проводили при повільному перемішуванні (100 об / хв) при кімнатній температурі протягом 20 хв., Після чого гартували 10 мл 2,5 М гліцину (остаточна концентрація 0,5 М). Для експериментів з теплового шоку E. coli MG1655 вирощували в 65 мл середовища LB при температурі 30 ° С до ОД₆₀₀ близько 0,3. Згодом 30 мл культури переносили в попередньо нагріту колбу при 43 ° С, а залишок зберігали при 30 ° С. Перехресне зчеплення та гасіння проводили, як описано вище, за винятком того, що клітини тримали на 30 або 43 ° С протягом 5 хв, а потім продовжували повільно трястися при кімнатній температурі. Клітини збирали шляхом центрифугування та двічі промивали холодною TBS (pH7,5). Після ресуспендування в 1 мл лізисного буфера (10 мМ Трис (рН 8,0), 20% сахарози, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЕДТА, 10 мг / мл лізоциму) та інкубації при 37 ° С протягом 30 хв, а потім додавання 4 мл IP Буфер, клітини обробляли ультразвуком на льоду з 12 разів 30 секунд і 30 сек перервами на UP400St ультразвуковий процесор (Hielscher Ultrasonics GmbH) з 100% потужністю. Після центрифугування протягом 10 хв при 9000 г 800 мкл аліквотів супернатанту зберігали при -20 ° С. (Waldminghaus 2010)

Перевиробництво та очищення ферментів.

Для перевиробництва декахистидину (His10) -крейшених протеїнів E. coli BL21 (DE3) трансформувалися конструкціями pET19b. За одну добу попередню культуру збирали центрифугуванням, і 1% використовували для інокуляції культури експресії. Клітини, що несуть pET19mgtB, вирощували при 22 ° С до оптичної щільності при 600 нм (ОД₆₀₀) від 0,7. Культуру переносили до 17 ° С та індукували 100 мкМ ІПТГ. Через 16 годин культура збирали шляхом центрифугування при 7500 × г при 4 ° С. Клітини ресуспендували у 50мМ фосфатно-буферному фізіологічному розчині (PBS) з 0,3М NaCl при рН 7,4 та порушувалися шляхом ультразвукового дослідження з мікроциліндровим сонотідом S2 на UP200St ультразвуковий пристрій (Hielscher, Teltow, Німеччина) в циклі 0,5 і амплітуда 75%.
Перевиробництво GtfC, позначеного декахистидином, індукували при 37 ° С при ОД₆₀₀ 0,6 з 100 мкМ IPTG. Клітини потім інкубували протягом 4 годин, збирали і лізисували, як зазначено вище, для MgtB.
Екстракти сирої клітини центрифугували при 15000 × г та 4 ° С для осадження залишків клітин. Очищені екстракти завантажували на 1-мл HisTrap FF Crude стовпці за допомогою системи ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Ферменти очищали відповідно до протоколу виробника для градієнтного елюювання His-tagged білків. Елюйовані білкові розчини двічі діалізували проти 1000 об'ємів 50 мМ PBS, рН 7,4, з 0,3 М NaCl при 4 ° С. Очищення аналізували на 12% SDS-PAGE. Концентрація білка була визначена методом Бредфорда за допомогою Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Карлсруе, Німеччина). (Rabausch et al., 2013)

Витяг білка з бактерій E. coli
Зацікавлений протеїн (у цьому випадку, MTV1 з Arabidopsis thaliana) зливається з емблемою GST і виражається в клітинах BL21 Escherichia coli (E. coli).
1. Візьміть одне гранули GST-MTV1 та GST (відповідний до бактеріальної культури 50 мл) та ресуспендуйте кожен з 2,5 мл льодогерметичного буферу.
2. Використовуйте ультразвуковий пристрій UP100H (обладнаний мікроскопом-сонотродом MS3 для невеликих об'ємів (2-5мл)), щоб порушити бактеріальні клітини до їх лізингу, що свідчить про зниження непрозорості та підвищеної в'язкості. Це повинно проводитися на льоду, і рекомендується промінятися з інтервалом (наприклад, 10 секунд звучання, а потім 10 секунд на льосі тощо). Необхідно уважно приділяти увагу не надто високій інтенсивності ультразвуку. Якщо виявляється піноутворення або утворення білого осаду, то інтенсивність потрібно знизити.
3. Перенесіть розчин лизидних бактерій до 1,5 мл мікроцентрифугових пробирок та центрифугуйте при 4 ° С, 16000 хг протягом 20 хв.

Allicin модифіковані білки в E. coli

Визначення вмісту сульфгідрилу методом 5,5'-Дітіобіс (2-нітробензойної кислоти) (DTNB)
Культура ночівлі E. coli MG1655 використовували для прищеплення мінімального середовища МОПС (1: 100). Культуру вирощували аеробним способом, доки досягнуто значення A600 від 0,4. Культура була розподілена на три 15-мл культури для лікування стресу. Неопрацьована культура служила негативним контролем. 0,79 мМ алліцину (128 мкг мл^-1) або 1мМ діаміда додавали до однієї з двох інших культур кожна. Культури інкубували протягом 15 хв. 5 мл кожної культури збирали центрифугуванням (8,525 × г, 4 ° С, 10 хв). Клітини двічі промивали 1мл PBS (137мМ NaCl, 2,7мМ KCl, 10мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄, рН 7,4, зберігають анаеробно перед використанням) і центрифугували (13000 × г, 4 ° С, 10 хв). Клітини ресуспендували в лізисному буфері (PBS з 6мМ гуанідиніум-HCl, рН 7,4) перед порушенням при 4 ° С шляхом ультразвукового дослідження (VialTweeter ультразвуковий пристрій, Hielscher GmbH, Німеччина) (3 х 1 хв). Розчини клітин гранули центрифугуванням (13000 × г, 4 ° С, 15 хв.). Супернатант переносили на 3,5мл QS-макро-кювету (10мм) з магнітною мішалкою та змішали з 1мл лізисного буфера. Вимирання зразків контролювали при 412 нм за допомогою спектрофотометра Jasco V-650, обладнаного тримачем клітини під контролем температури PSC-718 (Jasco) при кімнатній температурі. 100мкл розчину 3мМ дитіобісу (2-нітробензойної кислоти). Вимирання контролювали, поки не досягне насичення. Розрахунок концентрації тіолу проводили з використанням коефіцієнта екстинкції ε₄₁₂ = 13 700 м^-1 см^-1 для тіо-2-нітробензойної кислоти (ТНБ). Клітинна концентрація тіолу розраховувалася на основі вмісту клітин E. coli 6,7 × 10^-15 літр і щільність клітин А₆₀₀ = 0,5 (еквівалент 1 × 10⁸ клітини мл^-1 культура) (Müller et al., 2016)

Визначення глютатіону

E.coli MG1655 вирощували в мінімальному середовищі MOPS загальним об'ємом 200мл, поки не було А₆₀₀ від 0,5 досягається. Культуру поділяють на 50-мл культури для лікування стресу. Після 15-хвилинної інкубації з 0,79 мМ алліцину, 1 мМ діаміда або диметилсульфоксиду (контроль) клітини збирали при 4000 г при 4 ° С протягом 10 хв. Клітини двічі промивають буфером KPE перед ресуспендуванням гранул у 700мкл буферу KPE. Для знезараження 300 літрів 10% (мас / об) сульфосаліцилової кислоти додавали перед порушенням клітин за допомогою ультразвукового дослідження (3 х 1 хв; VialTweeter ультразвуковий пристрій) Супернатанти збирали після центрифугування (30 хв, 13000 г, 4 ° С). Концентрації сульфосаліцилової кислоти були знижені до 1% шляхом додавання 3 об'ємів буферу KPE. Вимірювання загального глютатіону та GSSG проводили, як описано вище. Концентрації клітинного глутатіону розраховували, виходячи з обсягу клітин E. coli у 6,7×10^-15 літр і щільність клітин А₆₀₀ 0.5 (еквівалент 1×10⁸ клітини мл^-1 культура) Концентрації GSH були розраховані шляхом віднімання 2 [GSSG] від загального глютатіона. (Müller et al., 2016)