Ультразвуковий лізис зразків Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster широко використовується в лабораторіях як модельний організм. Тому необхідно часто проводити етапи попередньої аналітичної підготовки, такі як лізис, руйнування клітин, екстракція білка та зріз ДНК зразків Drosophila melanogaster. Ультразвукові дисмембратори надійні та ефективні і можуть використовуватися для виконання різних завдань, таких як лізис, екстракція білків або фрагментація ДНК, лише регулюючи параметри ультразвукового процесу. Таким чином, ультразвукові гомогенізатори є гнучкими інструментами з широким спектром застосування.

Ультразвуковий лізис і екстракція білка

Лізис, розчинення клітин, гомогенізація тканин та екстракція білка є типовими завданнями для ультразвукових дисмебраторів у біологічних лабораторіях. Ультразвукові дисмембратори та клітинні руйнівники добре підходять для гомогенізації тканин тварин, комах (наприклад, Drosophila melanogaster, C. elegans) або зразків рослин. Подальшими застосуваннями ультразвуку є лізис клітинних суспензій і гранул, а також екстракція внутрішньоклітинних білків.
Ультразвуковий лізис і екстракція білка є високонадійними і відтворюваними процесами, які можуть виконуватися на основі встановлених протоколів. Оскільки інтенсивність ультразвукового процесу можна точно регулювати за допомогою параметрів ультразвуку, таких як амплітуда, режим циклу / імпульсу, температура і обсяг зразка, одного разу перевірені протоколи можна повторювати з одним і тим же результатом знову і знову.

Ультразвукова фрагментація ДНК та РНК

Після лізису клітин та екстракції білка загальним необхідним етапом підготовки зразків є зрізання та фрагментація ДНК, РНК та хроматину, наприклад, перед імунопреципітацією хроматину (ChIP). Фрагментація ДНК і РНК може бути надійно досягнута шляхом розриву ковалентних зв'язків, які утримують ДНК разом під дією фізичних сил. За допомогою фізичного зсуву, такого як ультразвукова діагностика, спочатку розриваються ланцюги ДНК, потім ДНК фрагментується на більш дрібні шматочки.
Ультразвукова фрагментація ДНК є надійною та ефективною при зрізанні ДНК до цільової довжини, наприклад, 500 п.н. (пар основ). До основних переваг ультразвукової фрагментації ДНК можна віднести точний контроль параметрів та інтенсивності ультразвукового процесу. Параметри ультразвукового процесу можна регулювати, точно налаштовуючи інтенсивність ультразвуку, цикли і час. Це дозволяє створювати бажані розміри ДНК, а цільову довжину ДНК можна надійно виробляти та відтворювати. Ультразвуковий зріз ДНК також ідеально підходить для створення високомолекулярних фрагментів ДНК.

Протоколи ультразвукового лізису Drosophila melanogaster

Нижче ви можете знайти різні протоколи для лізису за допомогою ультразвуку, екстракції білка та фрагментації ДНК або хроматину зразків дрозофіли.

Ультразвуковий лізис для аналізу на зшивальну імунопреципітацію (CLIP)

Аналіз CLIP був проведений, як повідомлялося раніше, з деякими модифікаціями. Приблизно 20 мг яєчників від 0 до 1 дня самок дикого типу були зшиті ультрафіолетом (3 × 2000 мкДж/см2), гомогенізовані на льоду в 1 мл буфера RCB (50 мМ HEPES pH 7,4, 200 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 мМ сахарози, 1 мМ DTT, 1× повні інгібітори протеази без ЕДТА, 1 мМ PMSF), доповнені 300 U RNAseOUT і поміщені на лід на 30 хв. Гомогенат ультразвукували на льоду, при 80% потужності, п'ять разів за 20 с сплесків з 60-секундним відпочинком між ними за допомогою ультразвукового процесора Hielscher UP100H (100 Вт, 30 кГц) і центрифуговані (16000 × г протягом 5 хв при 4 °С). Розчинний екстракт попередньо очищали за допомогою 20 мкл динамічних намистин Protein-G протягом 20 хв при 4 °C. Після вилучення зразків для імуноблотингу та кількісного визначення вхідної РНК (1%) HP1 імунопреципітували антитілом до HP1 9A9 з попередньо очищеного екстракту 450 мкл шляхом інкубації протягом 4 год з 50 мкл динамістину Protein-G. Імунопреципітати промивали 4 рази RCB. Для елюювання імунопреципітованих РНК гранульовані кульки кип'ятили в 100 мкл води, обробленої UltraPure DEPC, протягом 5 хв. До супернатанту, відновленого для приготування РНК, додавали реагент Qiazol 900 мкл. Очищену РНК використовували як матрицю для синтезу кДНК за допомогою оліго dT, випадкових гексамерів та зворотної транскриптази III SuperScript відповідно до протоколу виробника.
(Cassale та ін. 2019)

Ультразвуковий лізис для імунопреципітаційного аналізу хроматину

Імунопреципітацію хроматину проводили за методикою, описаною Менетом, з незначними модифікаціями. Приблизно 20 мг яєчників від 0 до 1 дня самок дикого типу були гомогенізовані в 1 мл буфера NEB (10 мМ HEPES-Na при рН 8,0, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ EGTA-Na при рН 8, 0,5 мМ ЕДТА-Na при рН 8, 1 мМ DTT, 0,5% NP-40, 0,5 мМ спермідину, 0,15 мМ Сперміну, 1× ЕДТА вільні повні інгібітори протеази) з гомогенізатором / диспергатором занурення 1 хв (при 3000 об/хв). Гомогенат переносили в попередньо охолоджений келих і наносили 15 повних ударів тугим товкачем. Потім вільні ядра центрифугували при 6000xg протягом 10 хв при 4 °C. Гранули, що містять ядра, ресуспендували в 1 мл NEB і центрифугували при 20000 × г протягом 20 хв на градієнті сахарози (0,65 мл 1,6 М сахарози в NEB, 0,35 мл 0,8 M сахарози в NEB). Гранулу ресуспендували в 1 мл НЕБ і формальдегіду до кінцевої концентрації 1%. Ядра зшивали протягом 10 хв при кімнатній температурі і гартували додаванням 1/10 об 1,375 М гліцину. Ядра збирали центрифугуванням при 6000 × г протягом 5 хв. Ядра двічі промивали в 1 мл NEB і ресуспендували в 1 мл буфера лізису (15 мМ HEPES-Na при рН 7,6, 140 мМ NaCl, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ ЕДТА при рН 8, 1% Тритон Х-100, 0,5 мМ ДТТ, 0,1% Na дезоксихолат, 0,1% SDS, 0,5% N-лауроілсаркозин і 1× безЕДТА-вільні повні інгібітори протеази). Ультразвукове дослідження ядер проводилося за допомогою ультразвукового процесора Hielscher UP100H (100 Вт, 30 кГц) шість разів по 20 с на льоду і 1 хв на льоду. Соніфіковані ядра центрифугували при 13000 × г протягом 4 хв при 4 °С. Більшість ультразвукових хроматинів мала довжину від 500 до 1000 пар основ (п.н.). На кожну імунопреципітацію інкубували 15 мкг хроматину в присутності 10 мкг моноклонального антитіла HP1 9A9 (3 год при 4 °С в обертовому колесі). Потім додавали 50 мкл динамічного білка G і продовжували інкубацію протягом ночі при температурі 4 °C. Супернатанти були відкинуті, а зразки двічі промивали в Lysis Buffer (кожне миття 15 хв при 4 °C) і двічі в TE Buffer (1 мМ EDTA, 10 мМ TrisHCl при рН 8). Хроматин елюювали з бісеру в два етапи; спочатку в 100 мкл Eluition Buffer 1 (10 мМ EDTA, 1% SDS, 50 мМ TrisHCl при рН 8) при 65 ° C протягом 15 хв, з подальшим центрифугуванням і відновленням супернатанту. Матеріал з бісеру повторно екстрагували в 100 мкл ТЕ + 0,67% SDS. Комбінований елюат (200 мкл) інкубували протягом ночі при температурі 65 °C для зворотних поперечних зв'язків і обробляли 50 мкг/мл RNaseA протягом 15 хв при 65 °C та 500 мкг/мл протеїназою K протягом 3 год при 65 °C. Зразки екстрагували фенол-хлороформ і осаджували етанол. ДНК ресуспендували в 25 мкл води. Для максимізації молекулярних аналізів з імунопреципітованою ДНК, гени-кандидати ампліфікували парами за допомогою оптимізованого протоколу дуплексної ПЛР за допомогою двох різних наборів праймерів з однаковими температурами плавлення в одній реакції.
(Казале та ін., 2019)
 

Високоефективні ультразвукові клітинні руйнівники для біологічних зразків

Hielscher Ultrasonics - ваш багаторічний партнер, коли справа доходить до високоефективних ультразвукових засобів для руйнування клітин, лізису, екстракції білків, фрагментації ДНК, РНК і хроматину, а також інших етапів попередньої аналітичної підготовки зразків. Пропонуючи повне портфоліо ультразвукових лабораторних гомогенізаторів та блоків для підготовки зразків, Hielscher має ідеальний ультразвуковий пристрій для вашого біологічного застосування та вимог.
Класичний ультразвуковий апарат зондового типу з мікронаконечником, таким як UP200St (200 Вт; див. малюнок ліворуч) або один з блоків ультразвукової пробопідготовки VialTweeter або UP200ST_TD_CupHorn з VialHolder є улюбленими моделями в науково-дослідних і аналітичних лабораторіях. Класичний ультразвуковий зонд ідеально підходить, при підготовці меншої кількості зразків необхідно лізувати, екстрагувати або фрагментувати. Блоки пробопідготовки VialTweeter і UP200St_TD_CupHorn дозволяють проводити одночасне ультразвукове дослідження до 10 або 5 флаконів відповідно.
Якщо необхідно обробляти великі номери зразків (наприклад, 96-лункові планшети, мікротитрові пластини тощо), UIP400MTP є ідеальною установкою для ультразвукового дослідження. UIP400MTP функціонує як більший кухор, який наповнений водою і має достатньо місця для розміщення пластин з мікролунками. Оснащений потужним ультразвуковим процесором потужністю 400 Вт, UIP400MTP забезпечує дуже рівномірне та інтенсивне ультразвукування багатолункових пластин з метою руйнування клітин, лізування зразків, розчинення гранул, екстракції білків або зсуву ДНК.

Точне керування за допомогою інтелектуального програмного забезпечення

Всі рішення для ультразвуку Hielscher потужністю від 200 Вт і вище оснащені цифровим кольоровим сенсорним екраном та інтелектуальним програмним забезпеченням. За допомогою інтелектуального протоколу даних всі параметри ультразвукового процесу автоматично зберігаються у вигляді CSV-файлу на вбудованій SD-карті, як тільки ультразвуковий апарат запускається. Це робить дослідження та протоколування набагато зручнішими. Після проб УЗД або підготовки зразків ви можете просто переглянути параметри ультразвукового випромінювання кожного прогону ультразвуку та порівняти їх.
За допомогою інтуїтивно зрозумілого меню можна попередньо встановити численні параметри перед ультразвуком: наприклад, щоб контролювати температуру в зразку та запобігти його термічному погіршенню, можна встановити верхню межу температури зразка. Роз'ємний датчик температури, який йде в комплекті з ультразвуковим блоком, дає зворотний зв'язок ультразвукового процесора про фактичну температуру звуку. При досягненні верхньої межі температури ультразвуковий прилад робить паузу до досягнення нижньої межі встановленої ∆Т і потім знову починає автоматичне ультразвукове дослідження.
Якщо потрібне ультразвукове випромінювання з певним входом енергії, ви можете попередньо встановити кінцеву ультразвукову енергію ультразвукового пробігу. Звичайно, ультразвукову пульсацію і режим циклу також можна встановити індивідуально.
Щоб повторно використати найуспішніші параметри ультразвуку, ви можете зберегти різні режими ультразвуку (наприклад, час ультразвуку, інтенсивність, режим циклу тощо) як попередньо встановлені режими, щоб їх можна було легко та швидко запустити знову.
Для більшої зручності роботи всіма цифровими ультразвуковими установками можна керувати за допомогою пульта дистанційного керування браузера в будь-якому поширеному браузері (наприклад, InternetExplorer, Safari, Chrome тощо). Підключення до локальної мережі є простим налаштуванням plug-n-play і не вимагає встановлення додаткового програмного забезпечення.
Ми в компанії Hielscher знаємо, що успішне ультразвукове дослідження біологічних зразків вимагає точності та повторюваності. Тому ми розробили наші ультразвукові апарати як розумні пристрої з усіма функціями, які забезпечують ефективну, надійну, відтворювану та зручну підготовку зразків.

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових систем від ультразвукових мікронаконечників і класичних ультразвукових гомогенізаторів до ультразвукових апаратів MultiSample для зручної та надійної підготовки численних зразків: