Ультразвуковий лізис зразків Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster широко використовується в лабораторіях як модельний організм. Тому попередні аналітичні етапи підготовки, такі як лізис, руйнування клітин, екстракція білків і подрібнення ДНК зразків Drosophila melanogaster, повинні часто виконуватися. Ультразвукові дезінтегратори є надійними та ефективними і можуть використовуватися для виконання різних завдань, таких як лізис, екстракція білків або фрагментація ДНК, просто шляхом налаштування параметрів ультразвукового процесу. Ультразвукові гомогенізатори є гнучкими інструментами з широким спектром застосувань.

Ультразвуковий лізис та екстракція білків

Лізис, розчинення клітин, гомогенізація тканин та екстракція білків є типовими завданнями для ультразвукових дезінтеграторів у біологічних лабораторіях. Ультразвукові дезінтегратори та руйнувачі клітин добре підходять для гомогенізації тваринних тканин, комах (наприклад, Drosophila melanogaster, C. elegans) або рослинних зразків. Подальшими застосуваннями ультразвукової обробки є лізис клітинних суспензій та осаду, а також екстракція внутрішньоклітинних білків.
Ультразвуковий лізис та екстракція білків є високонадійними та відтворюваними процесами, які можна виконувати на основі встановлених протоколів. Оскільки інтенсивність ультразвукового процесу може бути точно налаштована за допомогою параметрів ультразвукової обробки, таких як амплітуда, режим циклу / імпульсу, температура та об’єм зразка, перевірені протоколи можна повторювати з тим самим результатом знову і знову.

Ультразвукова фрагментація ДНК та РНК

Після лізису клітин та екстракції білків загальним необхідним етапом підготовки зразків є подрібнення та фрагментація ДНК, РНК та хроматину, наприклад, перед імунопреципітацією хроматину (ChIP). Фрагментацію ДНК та РНК можна надійно досягти, розриваючи ковалентні зв’язки, що утримують ДНК разом, за допомогою фізичних сил. Використовуючи фізичне подрібнення, таке як ультразвукова обробка, спочатку розриваються ланцюги ДНК, а потім ДНК фрагментується на менші шматки.
Ультразвукова фрагментація ДНК є надійною та ефективною для подрібнення ДНК до цільової довжини, наприклад, 500bp (пар основ). Основними перевагами ультразвукової фрагментації ДНК є точний контроль параметрів та інтенсивності ультразвукового процесу. Параметри ультразвукового процесу можна налаштувати, точно регулюючи інтенсивність ультразвукової обробки, цикли та час. Це дозволяє створювати бажані розміри ДНК, а цільова довжина ДНК може бути надійно отримана та відтворена. Ультразвукове подрібнення ДНК також ідеально підходить для створення фрагментів ДНК з високою молекулярною масою.

Протоколи для ультразвукового лізису Drosophila melanogaster

Нижче ви можете знайти різні протоколи для ультразвуково-асистованого лізису, екстракції білків та фрагментації ДНК або хроматину зразків Drosophila.

Ультразвуковий лізис для аналізу імунопреципітації з перехресним зв’язуванням (CLIP)

Аналіз CLIP проводився, як повідомлялося раніше, з деякими модифікаціями. Приблизно 20 mg яєчників від 0- до 1-денних самок дикого типу були перехресно зв’язані УФ (3 × 2000 μJ/cm2), гомогенізовані на льоду в 1 mL буфері RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM сахароза, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF), доповненому 300 U RNAseOUT, і залишені на льоду на 30 хв. Гомогенат піддавали ультразвуковій обробці на льоду при 80% потужності п’ять разів імпульсами по 20 s з перервою 60 s між ними, використовуючи Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) і центрифугували (16 000 × g протягом 5 хв при 4°C). Розчинний екстракт пре-клірингували з 20 μl Protein-G dynabeads протягом 20 хв при 4°C. Після видалення зразків для імуноблотингу та кількісної оцінки вхідної РНК (1%), HP1 імунопреципітували за допомогою анти-HP1 9A9 антитіла з 450 μl пре-клірингованого екстракту шляхом інкубації протягом 4 год з 50 μl Protein-G dynabeads. Імунопреципітати промивали 4 рази за допомогою RCB. Для елюції імунопреципітованих РНК осаджені кульки кип’ятили в 100 μL UltraPure DEPC-treated Water протягом 5 хв. До надосадової рідини, відібраної для підготовки РНК, додавали 900 μL Qiazol Reagent. Очищену РНК використовували як матрицю для синтезу кДНК за допомогою оліго dT, випадкових гексамерів та SuperScript reverse transcriptase III відповідно до протоколу виробника.
(Cassale et al. 2019)

Ультразвуковий лізис для аналізу імунопреципітації хроматину

Імунопреципітацію хроматину проводили відповідно до методу, описаного Menet, з незначними модифікаціями. Приблизно 20 мг яєчників від 0- до 1-денних самок дикого типу гомогенізували в 1 mL NEB буфері (10 mM HEPES-Na при pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na при pH 8, 0,5 mM EDTA-Na при pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors) за допомогою гомогенізатора / занурювального диспергатора протягом 1 хв (при 3000 rpm). Гомогенат переносили в попередньо охолоджений скляний донс і наносили 15 повних штрихів із щільним пестиком. Вільні ядра потім центрифугували при 6000xg протягом 10 хв при 4°C. Осадки, що містять ядра, ресуспендували в 1 mL NEB і центрифугували при 20 000 × g протягом 20 хв на градієнті сахарози (0,65 mL 1,6 M сахарози в NEB, 0,35 mL 0,8 M сахарози в NEB). Осад ресуспендували в 1 mL NEB і формальдегіду до кінцевої концентрації 1%. Ядра зшивали протягом 10 хв при кімнатній температурі та гасили, додаючи 1/10 об’єму 1,375 M гліцину. Ядра збирали центрифугуванням при 6000 × g протягом 5 хв. Ядра промивали двічі в 1 mL NEB і ресуспендували в 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na при pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA при pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine та 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Ядра сонікували, використовуючи Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) шість разів по 20 с увімкнено і 1 хв на льоду. Соніковані ядра центрифугували при 13 000 × g протягом 4 хв при 4°C. Більшість сонікованого хроматину мала довжину від 500 до 1000 пар основ (bp). Для кожної імунопреципітації 15 μg хроматину інкубували в присутності 10 μg моноклонального антитіла HP1 9A9 (3 год при 4°C на ротаційному колесі). Потім додавали 50 μl dynabeads protein G і продовжували інкубацію протягом ночі при 4°C. Надосадові рідини відкидали, а зразки промивали двічі в Lysis Buffer (кожне промивання 15 хв при 4 °C) і двічі в TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl при pH 8). Хроматин елюювали з кульок у два етапи; спочатку в 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl при pH 8) при 65°C протягом 15 хв, після чого центрифугували та відбирали надосадову рідину. Матеріал кульок повторно екстрагували в 100 μl TE + 0,67% SDS. Комбінований елюат (200 μl) інкубували протягом ночі при 65°C для зворотного розриву зшивок і обробляли 50 μg/ml RNaseA протягом 15 хв при 65°C та 500 μg/ml Proteinase K протягом 3 год при 65°C. Зразки екстрагували фенол–хлороформом і осаджували етанолом. ДНК ресуспендували в 25 μl води. Для максимізації молекулярних аналізів з імунопреципітованою ДНК, гени-кандидати ампліфікували парами через оптимізований протокол дуплекс-ПЛР, використовуючи два різні набори праймерів зі схожими температурами плавлення в одній реакції.
(Casale et al. 2019)

Високоефективні ультразвукові руйнувачі клітин для біологічних зразків

Hielscher Ultrasonics є вашим досвідченим партнером у сфері високоефективних ультразвукових гомогенізаторів для руйнування клітин, лізису, екстракції білків, фрагментації ДНК, РНК та хроматину, а також інших етапів підготовки зразків до аналізу. Пропонуючи комплексний портфель ультразвукових лабораторних гомогенізаторів та установок для підготовки зразків, Hielscher має ідеальний ультразвуковий прилад для вашого біологічного застосування та вимог.
Класичний ультразвуковий гомогенізатор зондового типу з мікронасадкою, такий як UP200St (200W; див. зображення ліворуч) або одна з установок для підготовки зразків VialTweeter або UP200ST_TD_CupHorn з VialHolder є улюбленими моделями в дослідницьких та аналітичних лабораторіях. Класичний ультразвуковий зонд ідеальний, коли потрібно лізувати, екстрагувати або фрагментувати невелику кількість зразків. Установки для підготовки зразків VialTweeter та UP200St_TD_CupHorn дозволяють одночасно проводити ультразвукову обробку до 10 або 5 флаконів відповідно.
Якщо потрібно обробити велику кількість зразків (наприклад, 96-лункові планшети, мікротитра-планшети тощо), UIP400MTP є ідеальною системою для ультразвукової обробки. UIP400MTP функціонує як більший кавітаційний стакан (cuphorn), який заповнюється водою і має достатньо місця для утримання мікролункових планшетів. Оснащений потужним 400-ватним ультразвуковим процесором, UIP400MTP забезпечує дуже рівномірну та інтенсивну ультразвукову обробку багато-лункових планшетів для руйнування клітин, лізису зразків, розчинення осаду, екстракції білків або зсуву ДНК.

Точне керування за допомогою розумного програмного забезпечення

Усі рішення Hielscher для ультразвукової обробки від 200 ват і вище оснащені цифровим кольоровим сенсорним екраном та інтелектуальним програмним забезпеченням. Завдяки розумному протоколюванню даних усі параметри ультразвукового процесу автоматично зберігаються у форматі CSV на вбудованій SD-картці одразу після запуску ультразвукового гомогенізатора. Це значно спрощує дослідження та протоколювання. Після випробувань ультразвукової обробки або підготовки зразків ви можете просто переглянути параметри ультразвукової обробки кожного циклу та порівняти їх.
Через інтуїтивно зрозуміле меню численні параметри можна попередньо налаштувати перед ультразвуковою обробкою: наприклад, щоб контролювати температуру в зразку та запобігти його термічній деградації, можна встановити верхню межу температури зразка. Знімний датчик температури, який постачається з ультразвуковою установкою, надає ультразвуковому процесору зворотний зв’язок щодо фактичної температури ультразвукової обробки. Коли досягається верхня межа температури, ультразвуковий пристрій робить паузу, доки не буде досягнута нижня межа встановленого ∆T, і потім автоматично відновлює ультразвукову обробку.
Якщо потрібна ультразвукова обробка зі специфічним енерговкладенням, ви можете попередньо налаштувати кінцеву ультразвукову енергію циклу обробки. Звичайно, імпульсний режим та циклічний режим ультразвукової обробки також можна встановити індивідуально.
Щоб повторно використовувати найуспішніші параметри ультразвукової обробки, ви можете зберегти різні режими обробки (наприклад, час, інтенсивність, циклічний режим тощо) як попередньо налаштовані режими, щоб їх можна було легко та швидко запустити знову.
Для більшої зручності в експлуатації всі цифрові ультразвукові установки можна керувати через браузер за допомогою будь-якого поширеного браузера (наприклад, InternetExplorer, Safari, Chrome тощо). Підключення LAN є простою конфігурацією «підключи і працюй» і не вимагає встановлення додаткового програмного забезпечення.
Ми в Hielscher знаємо, що успішна ультразвукова обробка біологічних зразків вимагає точності та відтворюваності. Тому ми розробили наші ультразвукові гомогенізатори як розумні пристрої з усіма функціями, які забезпечують ефективну, надійну, відтворювану та зручну підготовку зразків.

Нижче наведена таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність наших ультразвукових систем від ультразвукових мікронасадок та класичних ультразвукових гомогенізаторів до багато-зразкових ультразвукових гомогенізаторів для зручної, надійної підготовки численних зразків: