Дрозофіла меланогастер широко використовується в лабораторіях як модельний організм. Тому необхідно часто проводити попередні аналітичні етапи підготовки, такі як лізис, порушення клітин, екстракція білка та сорування ДНК зразків drosophila melanogaster. Ультразвукові дезмембратори надійні та ефективні і можуть використовуватися для виконання різних завдань, таких як лізис, екстракція білка або фрагментація ДНК з легкістю, лише коригуючи параметри ультразвукового процесу. Ультразвукові гомогенізатори тим самим гнучкі інструменти з широким спектром застосувань.

Ультразвукова лізис і екстракція білка

Лізис, клітинна солюбілізація, гомогенізація тканин і екстракція білка є типовими завданнями для ультразвукових дисмембратів в біологічних лабораторіях. Ультразвукові дисмембративи і клітинні руйнівники добре підходять для гомогенізації тканин тварин, комах (наприклад, дрозофіла меланогастера, C. elegans) або зразків рослин. Наступними застосуваннями ультразвуку є лізис клітинних суспензій і пелет, а також вилучення внутрішньоклітинних білків.
Ультразвуковий лізис і екстракція білка є дуже надійними і відтворюваними процесами, які можуть виконуватися на основі встановлених протоколів. Оскільки інтенсивність ультразвукового процесу може бути точно скоригована за допомогою параметрів ультразвукової обробки, таких як амплітуда, режим циклу / пульсу, температура та об'єм вибірки, після того, як доведені протоколи можуть повторюватися з тим же результатом знову і знову.

Ультразвукова ДНК та фрагментація РНК

Після лізису клітин і вилучення білка поширеним необхідним кроком при підготовці зразків є перешлагування і фрагментація ДНК, РНК і хроматину, наприклад, перед імунопресітацією хроматину (CHIP). У 1990 році він був номінований на «100 000» за «1000» і 2000 років за «1000». Використовуючи фізичне перестриження, таке як ультразвукова обробка, спочатку розбиваються нитки ДНК, потім ДНК фрагментується на більш дрібні шматки.
Фрагментація ультразвукової ДНК є надійною та ефективною при звисі ДНК до цільової довжини, наприклад, 500bp (базові пари). Основні переваги фрагментації ультразвукової ДНК включають точний контроль параметрів і інтенсивності ультразвукового процесу. Параметри ультразвукового процесу можна регулювати, налаштувавши інтенсивність ультразвукової обробки, цикли та час точно. Це дає можливість створювати бажані розміри ДНК, а цільова довжина ДНК може бути надійно вироблена, а також відтворена. Ультразвукове звисання ДНК також ідеально підходить для створення фрагментів ДНК високої молекулярної ваги.

Протоколи ультразвукового лізису дрозофіла меланогастера

Нижче ви можете знайти різні протоколи для ультразвукового лізису, видалення білка, а також фрагментації ДНК або хроматину зразків Дрозофіли.

Ультразвуковий лізис для перехресного зв'язування імунопреципітації (КЛІП) Аналіз

Clip аналіз був виконаний, як раніше повідомлялося з деякими модифікаціями. Приблизно 20 мг яєчників від 0- до 1-денних самок дикого типу були УФ-зшитими (3 × 2000 μJ/см2), гомогенізовані на льоду в буфері RCB 1 мл (50 mM HEPES pH 7.4, 200 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl2, 0,1% Тритон X-100, 250 мМ сахарози, 1 мМ ДТТ, 1× EDTA-безкоштовні інгібітори повної протеази, 1 мМ ПМСФ) доповнені 300 U RNAseOUT і розміщені на льоду протягом 30 хв. Гомогенат був ультразвуком на льоду, при 80% потужності, п'ять разів в 20 сплесках з 60 с відпочинку між використанням ультразвукового процесора Hielscher UP100H (100 Вт, 30 кГц) і відцентрований (16000 × г протягом 5 хв при 4°C). Розчинний екстракт був попередньо розклеєний 20 мкл Протеїн-Г динабіади протягом 20 хв при 4 °C. Після видалення зразків для імуноблоттингу та кількісного введення РНК (1%), HP1 був імунсертифікований анти-HP1 9A9 антитілами з 450 мкл попередньо визначеного екстракту шляхом інкубації на 4 год з 50 мкл Протеїн-Г динабеади. Імунопреципітати 4 рази мили РКБ. Для того, щоб з'ясувати імунопреційовані РНК, гранульовані намистини були відварені в 100 мкл ультрапурної води, обробленої DEPC протягом 5 хв. Очищена РНК використовувалася як шаблон для синтезу cDNA за допомогою оліго dT, випадкових шестикамер і зворотної транскриптази SuperScript III відповідно до протоколу виробника.
(Кассейл та ін. 2019)

Ультразвуковий лізис для аналізу імунопреципітації хроматину

Імуноприципітація хроматину проводилася за методом, описаним Менетом з незначними модифікаціями. Приблизно 20 мг яєчників від 0 до 1-денних самок дикого типу були гомогенізовані в 1 мл буфера NEB (10 мМ HEPES-Na при рН 8,0, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ EGTA-Na при рН 8, 0,5 мМ EDTA-Na при рН 8, 1 мМ DTT, 0,5% NP-40, 0,5 мМ Спермідин, 0,15 мМ Спермін, 1× EDTA- вільний повний інгібітори протеази) з гомогенізатором / диспергатором занурення 1 хв (при 3000 об / хв). Гомогенат був перенесений в попередньо охолоджене скляне донеч і 15 повних штрихів були нанесені щільним шкідником. Вільні ядра були центрифуговані при 6000xg протягом 10 хв при 4 ° C. Гранули, що містять ядра, були повторно перероблені в 1 мл НЕБ і центрифуговані при 20000 × г протягом 20 хв на градієнті сахарози (0,65 мл 1,6 М сахарози в NEB, 0,35 мл сахарози в NEB). Гранула була повторно ресупована в 1 мл НЕБ і формальдегіду до кінцевої концентрації 1%. Ядра були зшиті протягом 10 хв при кімнатній температурі і гасили, додаючи 1/10 об гліцину 1,375 М. Ядра збирали при центрифугації на 6000 × г протягом 5 хв. Ядра були промиті двічі в 1 мл НЕБ і відновлені в 1 мл буфера Лізису (15 мМ HEPES-Na при рН 7,6, 140 мМ NaCl, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ EDTA при рН 8, 1% Тритон X-100, 0,5 мМ DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-лауройлсаркозину і 1× без ЕДТА повних інгібіторів протеази). Ядра були ультразвуком за допомогою ультразвукового процесора Hielscher UP100H (100 Вт, 30 кГц) шість разів по 20 с на і 1 хв на льоду. Sonicated ядра були центрифуговані на 13000 × г протягом 4 хв при 4 ° C. Більшість звукових хроматинів становить від 500 до 1000 базових пар (bp) в довжину. Для кожного імунопреціації інкубовано 15 мкг хроматину при наявності 10 мкг моноклональних антитіл HP1 9A9 (3 год при 4°C в обертовому колесі). Потім було додано 50 мкл білка Dynabeads G, а інкубація продовжувалася протягом ночі при 4°C. Суперприроди були відкинуті, а зразки двічі милися в буфері Лізіс (кожне миття 15 хв при 4 °C) і двічі в TE Buffer (1 мМ EDTA, 10 мМ TrisHCl при pH 8). Хроматин був вимотаний з бісеру в два етапи; перший в 100 мкл Eluition Buffer 1 (10 мМ EDTA, 1% SDS, 50 мМ TrisHCl при рН 8) при 65°C протягом 15 хв з подальшою центрифугацією і відновленням надприродного. Матеріал бісеру був повторно витягнутий в 100 мкл TE + 0,67% SDS. Комбінований елюат (200 мкл) був інкубований протягом ночі при 65 ° C для зворотного перехресного зв'язку і оброблений 50 мкг / мл RNaseA протягом 15 хв при 65 ° C і на 500 мкг / мл Протеїназа K протягом 3 год при 65 ° C. Зразки були видобуті фенол-хлороформ і етанол осаджений. ДНК було повторно в 25 мкл води. Для максимального молекулярного аналізу з імунопреційованими ДНК, гени кандидатів підсилюються парами за допомогою оптимізованого дуплексного протоколу ПЛР за допомогою двох різних наборів ґрунтовок, що мають аналогічні температури плавлення в одній реакції.
(Казале та ін. 2019)
 

Високоеструкційні ультразвукові дезресори клітин для біологічних зразків

Hielscher Ultrasonics є вашим давно досвідченим партнером, коли мова йде про високоефетичні ультразвукові апарати для порушення клітин, лізису, вилучення білка, ДНК, РНК та фрагментації хроматину, а також інших доінологічних етапів підготовки зразків. Пропонуючи всеосяжний портфель ультразвукових лабораторних гомогенізаторів та блоків підготовки зразків, Hielscher має ідеальний ультразвуковий пристрій для вашого біологічного застосування та вимог.
Класичний ультразвуковий апарат зондового типу з мікро-наконечником, таким як UP200St (200W; див. малюнок ліворуч) або один з одиниць підготовки ультразвукового зразка VialTweeter або UP200ST_TD_CupHorn з VialHolder є улюбленими моделями в дослідницьких та аналітичних лабораторіях. Класичний ультразвуковий зонд ідеально підходить, при приготувані менше зразків необхідно лишити, витягти або фрагментувати. Блоки підготовки зразків VialTweeter і UP200St_TD_CupHorn дозволяють одночасно використовувати соковиження до 10 або 5 флаконів відповідно.
Якщо необхідно обробити високі номери зразків (наприклад, 96-колодязні пластини, пластини-мікротитери тощо), (УІП400МТП) є ідеальною установкою sonication. UIP400MTP функціонує як більший купгорн, який наповнений водою і має достатньо місця для утримання мікро-колодязних пластин. Працює на потужному ультразвуковому процесорі потужністю 400 Вт, UIP400MTP забезпечує дуже рівномірну і інтенсивну ультразвукову ультразвукову речовину для того, щоб порушити клітини, зразки лізу, солюбілізувати пелети, витягти білки або підшипник ДНК.

Точне керування за допомогою інтелектуального програмного забезпечення

Всі рішення hielscher sonication від 200 Вт вгору оснащені цифровим кольоровим сенсорним екраном і інтелектуальним програмним забезпеченням. За допомогою інтелектуального протоколу даних всі параметри ультразвукового процесу автоматично зберігаються як файл CSV на вбудованій SD-карті, як тільки ультразвук запускається. Це робить дослідження та протоколи набагато зручнішими. Після випробувань на про sonication або підготовки зразків, ви можете просто переглянути параметри sonication кожного sonication запустити і порівняти їх.
Через інтуїтивне меню, численні параметри можуть бути попередньо встановлені перед ультразвуковою обробкою: Наприклад, для контролю температури в зразку та запобігання його термічної деградації може бути встановлена верхня межа температури зразка. Підключений датчик температури, який поставляється з ультразвуковим блоком, дає ультразвуковому процесору зворотний зв'язок щодо фактичної температури ультразвукової обробки. Коли верхня межа температури досягнута, ультразвуковий пристрій призупиняється до тих пір, поки не буде досягнута нижня межа набору ∆T, а потім автоматично почнеться знову ультразвукова обробка.
Якщо потрібна ультразвукова з певним введенням енергії, ви можете попередньо задати остаточну ультразвукову енергію ультразвукової ультразвукової реакції. Звичайно, ультразвуковий пульсація і режим циклу також можуть бути індивідуально встановлені.
Щоб повторно використовувати найуспішніші параметри sonication, ви можете зберегти різні режими sonication (наприклад, час sonication, інтенсивність, режим циклу тощо) як попередньо встановлені режими, так що вони можуть бути легкими і швидко почалися знову.
Для більшої зручності роботи всі цифрові ультразвукові блоки можуть працювати за допомогою пульта дистанційного керування браузера в будь-якому загальному браузері (наприклад, InternetExplorer, Safari, Chrome і т.д.). Підключення до локальної мережі є простим налаштуванням plug-n-play і не вимагає додаткової установки програмного забезпечення.
Ми в Hielscher знаємо, що успішна ультразвукова шикування біологічних зразків вимагає точності і повторюваності. Тому ми розробили наші ультразвукові пристрої як розумні пристрої з усіма функціями, які дозволяють ефективно, надійно, відтворювано і зручно готувати зразки.

Таблиця нижче дає вам вказівку на приблизну продуктивність обробки наших ультразвукових систем від ультразвукових мікро-порад та класичних ультразвукових гомогенізаторів до мультисампле ультраакукаторів для зручної, надійної підготовки численних зразків: