Ультразвукова підготовка зразків C. Elegans

C. elegans, круглий черв’як, є широко використовуваною модельною організмом у біології. Підготовка зразків перед аналізом вимагає лізису, екстракції білків і ліпідів, а також фрагментації РНК, що може бути надійно виконано за допомогою ультразвукової обробки. Ультразвукові руйнівники клітин є надійними, складними та простими у використанні пристроями для швидкої підготовки зразків C. elegans.

Ультразвукова підготовка зразків C. elegans

Caenorhabditis elegans – це круглі черв’яки, які широко використовуються в дослідницьких лабораторіях для вивчення геноміки, біології розвитку та захворювань. Багато генів у геномі C. elegans мають функціональні аналоги у людини. Таким чином, круглий черв’як є надзвичайно корисною моделлю для дослідження людських захворювань. Інші переваги для широкого використання C. elegans – це його легке та дешеве вирощування на чашках, що містять бактерії (наприклад, E. coli), його прозорість, зручність у роботі, а також можливість заморожувати та зберігати черв’яків протягом тривалого періоду.
Аналіз білків і ліпідів є регулярними процедурами в лабораторіях, а ультразвукова підготовка зразків є усталеним методом лізису нематод C. elegans на будь-якій стадії розвитку (тобто ембріони, личинки L1-L4, дорослі особини). Оскільки C. elegans також використовується як система експресії білків для надмірної експресії цільових білків, необхідний надійний, відтворюваний метод лізису та екстракції білків, який забезпечує високі виходи білків. Системи ультразвукового руйнування клітин та екстракції доступні як гомогенізатори зондового типу та як багатозразкові ультразвукові апарати. Для зручної підготовки зразків та всіх видів розмірів і кількостей зразків Hielscher Ultrasonics має ідеальний ультразвуковий руйнівник клітин для вашої лабораторної процедури.

Ультразвукові протоколи для руйнування та лізису C. Elegans

Ультразвукову гомогенізацію та лізис C. elegans і подальшу екстракцію білків і ліпідів можна виконувати, використовуючи різні процедури з різними буферами для гомогенізації та лізису тощо. Усі протоколи лізису мають спільну рису: зразки необхідно постійно тримати на льоду, щоб запобігти деградації білків. Нижче ми представляємо вам кілька надійних та швидких ультразвукових протоколів лізису та екстракції для підготовки високоякісних зразків C. elegans, що містять білки або ліпіди.

Переваги ультразвукового лізису C. elegans

• надійний
• відтворюваний
• точно термостатований
• надійне управління процесом
• м’який метод
• простий у застосуванні
• безпечний

Ультразвукова екстракція білків із зразків C. elegans

Ультразвуковий лізис та екстракцію білків черв’яків C. elegans можна виконувати, використовуючи різні протоколи. Нижче ми представляємо вам кілька надійних та швидких протоколів лізису для відтворюваних результатів екстракції білків.

Швидка підготовка цитозольного екстракту з черв’яків C. elegans за допомогою ультразвукової обробки

За допомогою наступного протоколу ви можете підготувати лізати C. elegans менш ніж за 30 хвилин.
Збір C. elegans
Перенесіть бажаних черв’яків C. elegans у пробірку об’ємом 1,5ml з фосфатно-буферним розчином (PBS) або змийте їх з чашки за допомогою 1,5ml PBS. Центрифугуйте протягом 1min при 2000rpm для отримання осаду. Тримайте зразки постійно на льоду.
Потім двічі промийте черв’яків PBS.
Після цього двічі промийте черв’яків ddH₂O.
Ресуспензуйте черв’яків у щонайменше 500ul буфера для гомогенізації (HB). Зразки черв’яків тепер готові до ультразвукового лізису.
Для отримання екстракту білків вищої якості ви можете зменшити бактеріальне забруднення, промиваючи черв’яків протягом 5min кожен раз у PBS та стерильній, ультрачистій воді (ddH₂O) або виконати флотацію в сахарозі. Тримайте зразки черв’яків постійно на льоду.

Протокол ультразвукового лізису C. elegans

• Переконайтеся, що ви підготували ультразвуковий апарат заздалегідь, щоб ультразвуковий гомогенізатор був готовий до використання (зонд встановлено, програма ультразвукової обробки попередньо налаштована). 

Якщо ваш ультразвуковий гомогенізатор встановлений на стійці, розмістіть крижану ванну з пробірками для зразків під ультразвуковим зондом і вставте ультразвуковий зонд у пробірку 1,5ml.

• Для лізису C. elegans за допомогою UP200St або UP200Ht ультразвукову обробку слід виконувати, використовуючи мікротип (наприклад, зонд 2mm S26d2; див. зображення ліворуч) при амплітуді 40% протягом 1sec з паузами 30sec між циклами. Ідеальними для лізису C. elegans є 5 циклів ультразвукової обробки по 1 секунді кожен з паузами 30sec. Якщо ви виконуєте лізис вперше, ви можете перевірити прогрес лізису в невеликих аліквотах зразка після кожного імпульсу за допомогою мікроскопа.
• Лізис завершується успішно, коли черв’яки руйнуються. Надмірна ультразвукова обробка призводить до руйнування ядер і стає видимою, коли зразок стає в’язким або піниться. Щоб запобігти деградації зразка, використовуйте більше імпульсів, якщо потрібно. Не збільшуйте тривалість кожного циклу ультразвукового імпульсу, щоб отримати високоякісні білкові екстракти.
• Очистіть клітинний лізат, центрифугуючи ультразвуково лизованих черв’яків при 14 000rpm протягом 10min при 4ºC.
• Потім перенесіть супернатант у свіжу пробірку та підготуйте його для імунопреципітації або інших аналізів.

Примітка щодо буфера для гомогенізації: Підготуйте буфер для гомогенізації для наведеного вище протоколу ультразвукового лізису наступним чином:

Високопродуктивний лізис C. elegans у 96-лункових планшетах за допомогою планшетного сонікатора UIP400MTP

Лізис C. elegans (дорослі нематоди)
UIP400MTP 80% амплітуда, 20 циклів (кожен цикл ультразвукової обробки: 30 sec ON, 30 sec OFF)
Буфер для лізису:

• Варіант 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Варіант 2) для співімунопреципітації (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete proteinase inhibitor cocktail)

Високопродуктивне фрагментування ДНК
ДНК C. elegans (дорослі нематоди) 200-300bp: планшетний сонікатор UIP400MTP – встановіть амплітуду 80%, 30 імпульсів – кожен 30sec увімкнено, 30sec вимкнено

Планшетний сонікатор UIP400MTP для високопродуктивної підготовки зразків рівномірно обробляє ультразвуком зразки у багато-лункових, мікротитр-планшетах та 96-лункових планшетах

Ультразвуковий лізис C. elegans для кількісних аналізів афінної очистки

Ембріони C. elegans (∼2 мільйони на повтор) були свіжо зібрані в біологічних триплікатах шляхом відбілювання молодих вагітних гермафродитів і оброблені ультразвуком на льоду (цикл: 0,5 s, амплітуда: 40–45%, 5 ударів/сесію, 5 сесій, інтервал між сесіями: 30 s; ультразвуковий процесор UP200S з мікротипом S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) у буфері для лізису (загальний об’єм: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% гліцерол, суміш інгібіторів протеаз, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Після ультразвукової обробки Nonidet P-40 Substitute додавали до 1%, і лізати інкубували з обертанням «голова через хвіст» при 4°C протягом 30 min, після чого центрифугували при 20 000 × g протягом 20 min при 4°C. Очищений лізат потім аспірували, не порушуючи верхній ліпідний шар, і розділили навпіл між агарозними кульками anti-GFP або контрольними кульками (40–50 μl). Після обертання «голова через хвіст» при 4°C протягом 60–90 min кульки промивали один раз буфером для лізису, що містить 0,1% Nonidet P-40 Substitute, після чого двічі промивали або буфером I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), або буфером II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), або обома. Для пул-даунів GFP:MBK-2 було проведено два окремих експерименти з використанням різних умов промивання. Білки елюювали орбітальним струшуванням у 50 μl 6 m urea/2 M thiourea при кімнатній температурі. Для експериментів пул-даун MBK-1::GFP білки елюювали двічі струшуванням у 50μl 8 m guanidinium chloride при 90°C, після чого проводили преципітацію етанолом. Елюовані зразки білків потім перетравлювали в розчині.
(пор. Chen et al., 2016)

Ультразвукова гомогенізація та лізис червів

Для процедури лізису C. elegans та екстракції білків на зразок збирали 30 000 nemotodes відповідної стадії та промивали їх у крижаному S-basal, концентрували шляхом центрифугування при 1500 rpm протягом 2 min., промивали шість разів крижаним S-basal для видалення залишкових бактерій, а потім зберігали на льоду до готовності до використання. Для екстракції білків дорослим вагітним черв’якам дозволяли утворити компактний осад після останнього промивання S-basal. Осад червів потім ресуспендували в 1 ml крижаного буфера для екстракції [20 mM калій фосфат, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, інгібітори протеаз (Sigma P2714)] та обробляли негайно.
∼30 000 дорослих вагітних червів (що відповідає ∼100 mg вологої маси) піддавали ультразвуковій обробці на льоду, використовуючи ультразвуковий апарат зондового типу (наприклад, UP50H з мікротипом MS2) при 40% амплітуді протягом 10 циклів по 3 sec ввімкнено, 30 sec вимкнено, в 1 ml крижаного буфера для екстракції. (пор. Baskharan et al. 2012)

Ультразвукова екстракція ліпідів із C. elegans

У ліпідоміці, розділі метаболоміки, характеризують та аналізують ліпідний склад біологічних систем. C. elegans широко використовуються в ліпідоміці для дослідження взаємодії метаболічних ліпідів та їхнього впливу на здоров’я та тривалість життя.
Ультразвуковий лізис та екстракція використовуються для вивільнення ліпідів, таких як сфінголіпіди, з ембріонів, личинок та дорослих червів C. elegans. Ультразвукову обробку використовують для приготування гомогенатів червів та подальшої екстракції ліпідів зі зразка.
Протокол ультразвукової екстракції ліпідів із C. elegans
Розморозьте осад C. elegans на льоду та ресуспендуйте в 0,5 ml ultrawater. 
Піддайте зразки C. elegans ультразвуковій обробці в пробірках об’ємом 1,5mL, постійно тримаючи зразки на льоду.
Ультразвукову обробку можна проводити, використовуючи ультразвуковий апарат зондового типу, такий як UP200Ht, модуль підготовки зразків VialTweeter (одночасна ультразвукова обробка 10 зразків) або UIP400MTP (для ультразвукової обробки багатолуночних планшетів, таких як 96-луночні планшети).
Для ультразвукового лізису з UP200Ht використовуйте мікротип S26d2. Попередньо налаштуйте режим циклічної ультразвукової обробки в цифровому меню. Встановіть амплітуду на 10% та режим циклічної ультразвукової обробки з імпульсами по 2 сек протягом 20 циклів з паузою 30 сек. між кожною серією ультразвукових імпульсів.
Перенесіть надосадову рідину в скляні пробірки з гвинтовою кришкою. 
Проведіть екстракцію за Фолчем, додавши 1 ml ultrawater до кожної скляної пробірки, а потім додавши 6 ml 
суміші хлороформу/метанолу (співвідношення = 2:1) до кожної скляної пробірки.
Вібраційно перемішайте кожну скляну пробірку протягом 30 сек. 4 рази. 
Центрифугуйте пробірки при 1 258 x g протягом 15 хв (Eppendorf, 5810 R) для подальшого покращення 
розділення фаз. 
Перенесіть нижню гідрофобну фракцію в чисту скляну пробірку за допомогою скляної пастерівської піпетки. 
Висушіть нижню гідрофобну фракцію під потоком азоту в азотному випарнику. 
Зберігайте висушений осад у морозильній камері при -80 °C до використання. 


Ультразвукове приготування лізатів червів

Лізат червів: Черві стадії L4 були зібрані та промиті тричі буфером M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl, та 0,87 mM MgSO₄) для видалення всіх бактерій. Після видалення максимально можливої кількості буфера M9 черви були ресуспендовані в буфері для лізису: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM phosphate β-glycerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM sodium fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0,2 mM phenylmethanesulfonylfluoride та інгібітор протеази. Черви були заморожені в рідкому азоті та розморожені при 37°C тричі, потім черви були піддані ультразвуковій обробці на сухому льоду за допомогою ультразвукового VialTweeter для одночасної підготовки 10 пробірок зі зразками. Ультразвукова обробка проводилася при 50% амплітуді в 10 циклах по 2 sec. з паузою 30 sec. між імпульсами ультразвукової обробки. Після цього зразки були центрифуговані при 12 000 rpm при 4°C протягом 15 min. Надосадову рідину зібрали та зберігали при -70°C. Аліквоту використовували для кількісного визначення білків за методом Бредфорда.
Визначення загального глутатіону, GSH та GSSG: Для кількісного визначення глутатіону лізати та визначення проводилися в той самий день. Личинки L4, годівлювані глюкозою, та контрольні личинки були зібрані та промиті буфером M9 тричі. Після видалення максимально можливої кількості буфера M9 черви були ресуспендовані в крижаній метафосфорній кислоті (5% w/v), потім черви були піддані ультразвуковій обробці в льоду за допомогою ультразвукового VialTweeter при 50% амплітуді в десяти циклах ультразвукової обробки по 2 sec. з паузою 30 sec. між кожним циклом. Після цього центрифугували при 12 000 rpm при 4 ̊C протягом 15 min.
(пор. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Підготовка зразків C. elegans перед імунопреципітацією та вестерн-блотингом

Коротко кажучи, для ембріональних екстрактів личинки C. elegans L1 вирощували в великомасштабних рідких культурах S-medium до дорослого стану. Ембріони збирали за допомогою стандартного методу з використанням відбілювача та суспендували в буфері для лізису (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% гліцеролу, 0,05% NP-40, 1􏰅 Protease Inhibitor Cocktail та 1􏰅 Phosphatase Inhibitor Cocktail I та II), швидко заморожували в рідкому азоті та лізували шляхом ультразвукового руйнування клітин за допомогою ультразвукового гомогенізатора з мікротипом, такого як UP200Ht з S26d2 протягом 10 імпульсів за 10 s при 30% амплітуді. Якщо необхідно підготувати більшу кількість зразків, рекомендується використовувати ультразвуковий VialTweeter або MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP для мікропланшетів. Після ультразвукової обробки екстракти були попередньо очищені шляхом центрифугування при 30 000g протягом 20 min при 4°C. Попередньо очищений екстракт (300µ􏰂g загального білка) інкубували з 40µ􏰂g афінно-очищеного антитіла проти CDC-25.1 (це дослідження), зшитого з протеїн А-агарозою, або, як контроль, використовували аналогічну кількість імуноглобуліну (Ig)G кролика, зшитого з протеїн А-агарозою, у загальному об’ємі 200µl буфера для лізису, що містив 1% NP-40, включення якого зменшувало неспецифічне зв’язування білків з матрицею. Зразки обертали протягом 1 h при 4°C, кульки промивали тричі буфером для лізису та елюювали 30µl glycine/HCl та 200 mM NaCl, pH 2,2. Після імунопреципітації елюати розбавляли в 30µ􏰂l буфера для зразків SDS, нагрівали до 95°C протягом 4 min, і зазвичай 3% від загального об’єму для вхідного зразка та 30% для елюатів наносили на SDS-PAGE, після чого проводили вестерн-блотинг з антитілами проти CDC-25.1 (1:400), проти LIN-23 (1:750), проти убіквітину (1:1000), проти GSK3􏰁 (1:500) або проти 􏰁β-актину (1:2000). Там, де екстракти не піддавалися імунопреципітації, та сама кількість загального білка, отримана з цих екстрактів, ресуспендувалася в буфері для зразків SDS, нагрівалася до 95°C, а потім безпосередньо наносилася на SDS-PAGE та аналізувалася за допомогою вестерн-блотингу. (пор. Segref et al. 2020)

Ультразвуковий лізис під точним контролем температури

Точне та надійне регулювання температури є критично важливим при роботі з біологічними зразками. Високі температури ініціюють термічно-індуковану деградацію білків у зразках.
Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова обробка створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні VialTweeter. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх підготовки за допомогою VialTweeter та VialPress для аналізу.

1. Моніторинг температури зразка: ультразвуковий процесор UP200St, який приводить в дію VialTweeter, оснащений інтелектуальним програмним забезпеченням та знімним температурним сенсором. Підключіть температурний сенсор до UP200St і вставте наконечник температурного сенсора в одну з пробірок для зразків. Через цифровий кольоровий сенсорний дисплей ви можете в меню UP200St встановити конкретний температурний діапазон для ультразвукової обробки вашого зразка. Ультразвуковий апарат автоматично зупиниться, коли буде досягнута максимальна температура, і зробить паузу, доки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленого діапазону ∆. Потім ультразвукова обробка автоматично відновиться. Ця розумна функція запобігає деградації, спричиненій нагріванням.
2. Блок VialTweeter можна попередньо охолодити. Помістіть блок VialTweeter (лише сонотрод без перетворювача!) у холодильник або морозильну камеру, щоб попередньо охолодити титановий блок; це допомагає відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо можливо, сам зразок також можна попередньо охолодити.
3. Використовуйте сухий лід для охолодження під час ультразвукової обробки. Використовуйте неглибокий піддон, заповнений сухим льодом, і розмістіть VialTweeter на сухому льоду, щоб тепло могло швидко розсіятися.

Знайдіть оптимальний ультразвуковий руйнівник клітин для вашого застосування лізису

Hielscher Ultrasonics є досвідченим виробником високопродуктивних ультразвукових руйнівників клітин та гомогенізаторів для лабораторій, настільних та промислових систем. Розмір вашої культури бактеріальних клітин, ваша дослідницька або виробнича мета та обсяг клітин, які потрібно обробити за годину або день, є важливими факторами для вибору правильного ультразвукового руйнівника клітин для вашого застосування.
Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для одночасної ультразвукової обробки мультизразків (до 10 флаконів), а також масових зразків (наприклад, мікропланшети / планшети на 96 лунок), класичний лабораторний ультразвуковий апарат зондового типу з різними рівнями потужності від 50 до 400 watts до повністю промислових ультразвукових процесорів з потужністю до 16 000watts на одиницю для комерційного руйнування клітин та екстракції білків у великому виробництві. Всі ультразвукові апарати Hielscher розроблені для роботи 24/7/365 під повним навантаженням. Надійність та стабільність є ключовими характеристиками наших ультразвукових пристроїв.
Всі цифрові ультразвукові гомогенізатори оснащені розумним програмним забезпеченням, кольоровим сенсорним дисплеєм та автоматичним протоколюванням даних, що перетворює ультразвуковий пристрій на зручний робочий інструмент у лабораторних та виробничих умовах.
Повідомте нам, які саме клітини, який обсяг, з якою частотою та з якою метою вам потрібно обробляти ваші біологічні зразки. Ми порекомендуємо вам найбільш підходящий ультразвуковий руйнівник клітин для ваших процесних вимог.

Нижче наведена таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність обробки наших ультразвукових систем від компактних ручних гомогенізаторів та MultiSample Ultrasonicators до промислових ультразвукових процесорів для комерційних застосувань: