Ультразвукова підготовка зразків C. elegans

C. elegans, черв'як-нематода, є широко використовуваним модельним організмом у біології. Підготовка зразків перед аналізом вимагає лізису, екстракції білків і ліпідів, а також фрагментації РНК, яка може бути надійно виконана за допомогою ультразвукового дослідження. Руйнівники ультразвукових клітин є надійними, складними та простими у використанні пристроями для швидкої підготовки зразків C. elegans.

Ультразвукова підготовка зразків C. elegans

C. elegans — це круглі черви, які широко використовуються в дослідницьких лабораторіях для вивчення геноміки, біології розвитку та захворювань. Багато генів у геномі C. elegans мають функціональні аналоги у людини. Таким чином, черв'як-нематода є надзвичайно корисною моделлю для лікування захворювань людини. Іншими перевагами широкого використання C. elegans є його просте та дешеве вирощування на пластинах, що містять бактерії (наприклад, кишкова паличка), його прозорість, зручне використання, а також можливість заморожування та зберігання червів протягом більш тривалого періоду.
Аналіз білків і ліпідів є регулярними процедурами в лабораторіях, а підготовка ультразвукових зразків є встановленим методом лізування нематод C. elegans на кожній стадії розвитку (тобто ембріонів, личинок L1-L4, дорослих особин). Оскільки C. elegans також використовується як система експресії білків для надмірної експресії цільових білків, необхідний надійний, відтворюваний метод лізису та екстракції білка, який дає високі виходи білка. Ультразвукові системи руйнування та екстракції клітин доступні як гомогенізатори зондового типу та як багатозразкові ультразвукові апарати. Задовольняючи зручну підготовку зразків і всілякі цифри розмірів зразків, Hielscher Ultrasonics має ідеальний руйнівник ультразвукових клітин для вашої лабораторної процедури.

Ультразвукові протоколи для руйнування та лізису C. elegans

Ультразвукова гомогенізація та лізис C. elegans та подальша екстракція білків та ліпідів можуть бути виконані за допомогою різних процедур з використанням різних буферів гомогенізації та лізису тощо. Всі протоколи лізису мають спільну рису в тому, що зразки необхідно постійно тримати на льоду, щоб запобігти розпаду білка. Нижче ми представляємо вам кілька надійних і швидких протоколів ультразвукового лізису та екстракції для приготування високоякісних зразків C. elegans, що містять білки або ліпіди.

Переваги ультразвукового лізису C. elegans

• Надійний
• Відтворювані
• Точне регулювання температури
• Надійний контроль процесу
• щадний метод
• Легко наноситься
• Сейф

Ультразвукова екстракція білка зі зразків C. elegans

Ультразвуковий лізис і екстракція білка червів C. elegans можуть проводитися за допомогою різних протоколів. Нижче ми представляємо вам кілька надійних і швидких протоколів лізису для отримання результатів відтворюваної екстракції білка.

Швидке приготування цитозольного екстракту з червів C. elegans методом ультразвукового дослідження

За допомогою наведеного нижче протоколу ви можете приготувати лізати C. elegans менш ніж за 30 хвилин.
Колекція C. elegans
Виберіть потрібних черв'яків C. elegans у пробірковий фосфатний буферизований фізіологічний розчин (PBS) об'ємом 1,5 мл або промийте їх з тарілки 1,5 мл PBS. Центрифугуйте протягом 1 хв при 2000 об/хв до гранулювання. Зберігайте зразки весь час на льоду.
Потім двічі промийте черв'яків препаратом PBS.
Після цього двічі промийте черв'яків препаратом ddH₂O.
Повторно суспендуйте черв'яків у буфері гомогенізації (HB) не менше 500 мкл. Тепер зразки черв'яків готові до ультразвукового лізису.
Для більш високої якості білкового екстракту ви можете зменшити бактеріальне забруднення, промиваючи черв'яків протягом 5 хвилин кожен у PBS і стерильній, надчистій воді (ddH₂О) або виконати сахарозне плавання. Зберігайте зразки черв'яків постійно на льоду.

Ультразвуковий протокол лізису C. elegans

• Переконайтеся, що ви підготували ультразвуковий апарат заздалегідь, щоб ультразвуковий гомогенізатор був готовий до використання (датчик встановлений, програма ультразвуку попередньо встановлена).

Якщо ваш ультразвуковий датчик встановлений на підставці, помістіть крижану ванну з пробірками для зразків під ультразвуковий зонд і вставте ультразвуковий зонд у трубку об'ємом 1,5 мл.

• Для лізису C. elegans за допомогою UP200St або UP200Ht ультразвук слід проводити за допомогою мікронаконечника (наприклад, 2-міліметрового зонда S26d2; див. малюнок ліворуч) з амплітудою 40% протягом 1 секунди з 30-секундними паузами між ними. 5 циклів ультразвуку на кожну 1 секунду з паузами 30 секунд ідеально підходять для лізису C. elegans. Якщо ви проводите лізис вперше, ви можете перевіряти прогресування лізису в невеликих аліквотах зразка після кожного імпульсу за допомогою мікроскопа.
• Лізис успішно завершується при порушенні роботи червів. Надмірне ультразвукове дослідження призводить до розриву ядер і стає помітним, коли зразок стає в'язким або піниться. Щоб запобігти деградації зразка, використовуйте більше імпульсів, якщо це необхідно. Не збільшуйте час кожного циклу ультразвукового імпульсу для отримання якісних білкових екстрактів.
• Очистіть клітинний лізат шляхом центрифугування черв'яків, що пройшли ультразвуковий синтез, при 14 000 об/хв протягом 10 хвилин при 4ºC.
• Потім перенесіть супернатант у свіжу пробірку та підготуйтеся до імунопреципітації або інших аналізів.

Примітка для буфера гомогенізації: Підготуйте буфер гомогенізації для протоколу ультразвукового лізису, наведеного вище, наступним чином:

Високопродуктивний лізис C. elegans у 96-лункових пластинах за допомогою UIP400MTP пластинчастого сонника

C. elegans Lysis (дорослі нематоди)
UIP400MTP 80% амплітуди, 20 циклів (кожен цикл ультразвуку: 30 сек увімкнено, 30 сек вимкнено)
Буфер лізису:

• Варіант 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA
• Варіант 2) для ко-імунопреципітації (ко-ІП): 10 мМ Tris HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЕДТА, 0,5 % NP-40 (коктейль з повним інгібітором протеїнази)

Високопродуктивна фрагментація ДНК
ДНК C. elegans (дорослі нематоди) 200-300 п.н.: UIP400MTP пластинчастий ультразвуковий апарат – набір 80% амплітуди, 30імпульсів – кожні 30 секунд увімкнено, 30 сек вимкнено

UIP400MTP Пластинчастий фонікатор для високопродуктивної підготовки зразків рівномірно ультразвукує зразки в багатолункових, мікротитрових пластинах і 96-лункових планшетах

Ультразвуковий лізис C. elegans для кількісних аналізів афінного очищення

Ембріони C. elegans (∼2 млн на реплікат) були свіжозібрані в біологічному потрійному вигляді шляхом відбілювання молодих гравідних гермафродитів і проведені на льоду (цикл: 0,5 с, амплітуда: 40–45%, 5 ударів/сеанс, 5 сеансів, інтервал між сеансами: 30 с; Ультразвуковий процесор UP200S з мікронаконечником S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) в лізис-буфері (загальний об'єм: ∼600 мкл; 50 мм Tris-HCl, pH 7,4, 100 мм KCl, 1 мм MgCl2, 1 мм EGTA, 1 мм DTT, 10% гліцерин, суміш інгібіторів протеази, 0,1% замінник Нонідету Р-40). Після ультразвукового дослідження додавали замінник Нонідет П-40 до 1 % і інкубували лізати з обертанням головою через хвіст при 4 ° С протягом 30 хв з подальшим центрифугуванням при 20 000 × г протягом 20 хв при 4 ° С. Потім очищений лізат аспірували без порушення верхнього ліпідного шару і розщеплювали наполовину або на анти-GFP агарозні кульки, або на заблоковані контрольні кульки (40–50 мкл). Після обертання головою через хвіст при 4 ° C протягом 60-90 хв бісер один раз промивали лізисним буфером, що містить 0,1% замінника Нонідета П-40, з подальшим дворазовим промиванням в буфері I (25 мм Tris-HCl, pH 7,4, 300 мм NaCl, 1 мм MgCl2) або буфері II (1 мм Tris-HCl, pH 7,4, 150 мм NaCl, 1 мм MgCl2) або обидва. Для тяг GFP:MBK-2 було проведено два окремі експерименти з використанням різних умов прання. Білки елюювали шляхом орбітального струшування в 50 мкл 6 м сечовини/2 М тіосечовини при кімнатній температурі. Для експериментів з витягуванням MBK-1::GFP білки двічі елюювали шляхом струшування в 50 мкл 8 м хлориду гуанідинію при 90 °C, з подальшим осадженням етанолу. Потім зразки елюйованого білка перетравлювали в розчині.
(пор. Чен та ін., 2016)

Ультразвукова гомогенізація та лізис черв'яків

Для процедури лізису та екстракції білка C.elegans 30 000 немотод відповідної стадії збирали на зразок і промивали в крижаному S-базалі, концентрували центрифугуванням при 1500 об/хв протягом 2 хв., промивали шість разів крижаним S-базалом для видалення залишкових бактерій, а потім зберігали на льоду до готовності до використання. Для екстракції білка дорослим гравідним черв'якам дозволили сформувати компактну гранулу після останнього S-базального промивання. Потім гранули червів ресуспендували в 1 мл крижаного Extraction Buffer [20 мМ фосфату калію, рН 7,4, 2мМ ЕДТА, 1% Тритон-Х-100, інгібітори протеази (Sigma P2714)] і негайно обробляли.
∼30 000 дорослих червів (що відповідає ∼100 мг вологої ваги), були проведені ультразвукове дослідження на льоду за допомогою ультразвукового апарату зондового типу (наприклад, UP50H з мікронаконечником MS2) з амплітудою 40% протягом 10 циклів по 3 секунди, з вимкненням 30 секунд, в 1 мл буфера для екстракції льодом. (пор. Басхаран та ін. 2012)

Ультразвукова екстракція ліпідів з C. elegans

У ліпідоміці, розділі метаболоміки, охарактеризовано та проаналізовано ліпідний комплемент біологічних систем. C. elegans широко використовуються в ліпідоміці для дослідження взаємодії метаболічних ліпідів та їх впливу на здоров'я та тривалість життя.
Ультразвуковий лізис та екстракція використовується для вивільнення ліпідів, таких як сфінголіпіди, з ембріонів, личинок та дорослих червів C. elegans. Ультразвук використовується для приготування гомогенатів червів і подальшого вилучення ліпідів зі зразка.
Протокол ультразвукової екстракції ліпідів з C. elegans
Розморозьте гранули C. elegans на льоду та повторно підвісьте 0,5 мл ультраводи. 
Проведіть ультразвуковий аналіз зразків C. elegans у пробірках об'ємом 1,5 мл, при цьому постійно зберігаючи зразки на льоду.
Ультразвукове дослідження може проводитися за допомогою зонда-ультразвуку, такого як UP200Ht, блок підготовки ультразвукових зразків VialTweeter (одночасне уздання 10 зразків) або UIP400MTP (для ультразвукового дослідження багатолункових пластин, таких як 96-лункові пластини). Для ультразвукового лізису за допомогою UP200Ht використовуйте мікронаконечник S26d2. Попередньо встановіть режим ультразвукового циклу в цифровому меню. Встановіть амплітуду 10% і режим циклу звуку 2 сек, імпульси по 20 циклів з паузою в 30 сек. Між кожним сплеском ультразвукової пульсації.
Перенесіть супернатанти в скляні трубки з кришкою, що загвинчується. 
Виконайте екстракцію Фолча, додавши 1 мл ультраводи в кожну скляну трубку, а потім додавши 6 мл суміші хлороформ/метанол (співвідношення = 2:1) до кожної скляної трубки.
Кожну скляну трубку прокрутіть протягом 30 сек 4 рази. 
Центрифугуйте пробірки при 1,258 x g протягом 15 хв (Eppendorf, 5810 R) для подальшого посилення розділення фаз. 
Перенесіть нижню гідрофобну фракцію в чисту скляну трубку за допомогою скляної піпетки Пастера. 
Нижню гідрофобну фракцію просушити під потоком азоту в азотному випарнику. 
Зберігайте висушені гранули в морозильній камері при температурі -80 °C до використання.

Ультразвукове приготування лізатів черв'яків

Лізат червів: черв'яків стадії L4 збирали та тричі промивали за допомогою буфера M9 (42,26 мМ Na₂ГПО₄, 22,04 мМ KH₂ПО₄, 85,56 мМ NaCl і 0,87 мМ MgSO₄) для того, щоб видалити всі бактерії. Після видалення якомога більшої кількості буфера М9 черв'яки були ресуспендовані в лізис-буфері: 50 мМ HEPES, 50 мМ KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 мМ фосфату β-гліцерину, 0,1% (об/об) Triton X-100, 50 мМ фториду натрію, 1 мМ ортованадату натрію, 5 мМ пірофосфату натрію, 0,2 мМ фенілметансульфонілфториду та інгібітор протеази. Черв'яків заморожували в рідкому азоті і розморожували при температурі 37 ° С протягом трьох разів, потім черв'яків проводили ультразвукове дослідження на сухому льоду за допомогою ультразвукової установки VialTweeter для одночасного приготування 10 пробірок для проб. Ультразвук проводили з амплітудою 50% за 10 циклів по 2 сек з паузою 30 сек між сплесками ультразвуку. Після цього зразки центрифугували при 12000 об/хв при 4°С протягом 15 хв. Супернатант збирали і зберігали при температурі -70 ° C. Аліквота була використана для кількісного визначення білка за допомогою бредфордського аналізу.
Визначення загального глутатіону, GSH та GSSG: для кількісного визначення глутатіону лізати та визначення були проведені того ж дня. Личинок L4, яких годували глюкозою та контролювали тричі та промивали буфером М9. Після видалення якомога більшої кількості буфера М9 черв'яків ресуспендували в крижаній метафосфорній кислоті (5% мас./об), потім черв'яків проводили ультразвукове ультразвукове дослідження в льоду за допомогою ультразвукового VialTвітера з амплітудою 50% у десяти циклах ультразвуку по 2 сек. з паузою 30 сек між кожним циклом. Після цього центрифугують при 12000 об/хв при 4 ̊С протягом 15 хв.
(пор. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Підготовка проб перед імунопреципітацією та вестерн-блот

Якщо коротко, то для отримання ембріональних екстрактів личинок C. elegans L1 вирощували у великомасштабних рідких культурах S-середовища до дорослого віку. Ембріони збирали за допомогою стандартного методу хлорного вапна і підвішували в буфері лізису (50 мМ Tris, рН 7,5, 100 мМ KCl, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ MgCl2, 8,7% гліцерин, 0,05% NP-40, 1 Коктейль інгібіторів протеази та 1 Коктейль інгібіторів фосфатази I і II), швидко заморожували в рідкому азоті та лізували за допомогою ультразвукового руйнування клітин за допомогою ультразвукового апарату з мікронаконечником, таким як UP200Ht з S26d2 на 10 імпульсів протягом 10 с з амплітудою 30%. При більшій кількості зразків необхідно приготувати ультразвуковий VialTweeter або рекомендується використовувати UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator для колодязних пластин. Після ультразвукового дослідження екстракти попередньо очищали центрифугуванням при 30 000 г протягом 20 хв при температурі 4 °С. Попередньо очищений екстракт (300 мкг загального білка) інкубували з 40 мкмкл анти-CDC-25.1 афінно-очищеного антитіла (це дослідження), зшитого з білком A-агарози, або як контроль, аналогічна кількість кролячого імуноглобуліну (Ig)G, зшитого з білком A-агарози, використовувалася в загальному обсязі 200 мкл лізис-буфера, що містив 1% NP-40, включення якого зменшувало неспецифічне зв'язування білків з матриксом. Зразки обертали протягом 1 год при температурі 4 °C, кульки тричі промивали лізисним буфером і елюювали 30 мкл гліцину/HCl і 200 мМ NaCl, рН 2,2. Після імунопреципітації елюати розводили в 30 мк�� буфера для зразків SDS, нагрівали до 95 ° C протягом 4 хв, і, як правило, 3% від загальної кількості для введення і 30 % для елюатів застосовували до SDS-PAGE, після чого проводили вестерн-блот з анти-CDC-25.1 (1:400), анти-LIN-23 (1:750), анти-убіквітином (1:1000), анти-GSK3 (1:500) або анти-�β-актиновими (1:2000) антитілами. Там, де екстракти не піддавалися імунопреципітації, таку ж кількість загального білка, отриманого з цих екстрактів, ресуспендували в буфері для зразків SDS, нагрівали до 95 °C, а потім безпосередньо наносили на SDS-PAGE і аналізували методом вестерн-блотингу. (пор. Segref та ін. 2020)

Ультразвуковий лізис під контролем температури Prescise

Точний і надійний контроль температури має вирішальне значення при обробці біологічних зразків. Високі температури ініціюють термічно індуковану деградацію білка в зразках.
Як і всі механічні методи підготовки зразків, ультразвукова діагностика створює тепло. Однак температуру зразків можна добре контролювати при використанні VialTweeter. Ми представляємо вам різні варіанти моніторингу та контролю температури ваших зразків під час їх приготування за допомогою VialTweeter та VialPress для аналізу.

1. Моніторинг температури зразка: Ультразвуковий процесор UP200St, який керує VialTweeter, оснащений інтелектуальним програмним забезпеченням і датчиком температури, що підключається. Підключіть датчик температури до UP200St і вставте наконечник датчика температури в одну з пробірок для зразка. За допомогою цифрового кольорового сенсорного дисплея Ви можете встановити в меню UP200St конкретний температурний діапазон для Вашого зразка ультразвукового випромінювання. Ультразвуковий датчик автоматично зупиниться, коли буде досягнута максимальна температура, і зупиниться, поки температура зразка не знизиться до нижнього значення встановленої температури ∆. Потім УЗД знову починається автоматично. Ця інтелектуальна функція запобігає деградації через нагрівання.
2. Блок VialTweeter можна попередньо охолодити. Покладіть блок VialTweeter (тільки сонотроде без датчика!) в холодильник або морозильну камеру, щоб попереднє охолодження титанового блоку допомогло відстрочити підвищення температури в зразку. Якщо є можливість, то і сам зразок можна попередньо охолодити.
3. Використовуйте сухий лід для охолодження під час ультразвуку. Використовуйте неглибокий лоток, наповнений сухим льодом, і покладіть VialTweeter на сухий лід, щоб тепло могло швидко розсіюватися.

Знайдіть оптимальний руйнівник ультразвукових клітин для вашого застосування лізису

Hielscher Ultrasonics є багаторічним досвідченим виробником високоефективних руйнівників ультразвукових клітин і гомогенізаторів для лабораторій, настільних і промислових масштабних систем. Розмір культури бактеріальних клітин, ваша мета дослідження або виробництва, а також обсяг клітин для обробки за годину або день є важливими факторами для пошуку правильного ультразвукового руйнівника клітин для вашого застосування.
Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для одночасного ультразвукового дослідження кількох зразків (до 10 флаконів), а також зразків маси (тобто мікротитрові пластини / 96-лункові планшети), класичний лабораторний ультразвуковий апарат зондового типу з різними рівнями потужності від 50 до 400 Вт до повністю промислових ультразвукових процесорів потужністю до 16 000 Вт на одиницю для комерційного руйнування клітин та екстракції білка у великому виробництві. Всі ультразвукові апарати Hielscher розраховані на роботу 24/7/365 при повному навантаженні. Міцність і надійність є основними характеристиками наших ультразвукових пристроїв.
Всі цифрові ультразвукові гомогенізатори оснащені інтелектуальним програмним забезпеченням, кольоровим сенсорним дисплеєм і автоматичним протоколізацією даних, що перетворює ультразвуковий апарат в зручний робочий інструмент в лабораторіях і виробничих приміщеннях.
Повідомте нам, що це за клітини, який обсяг, з якою частотою і з якою метою ви повинні обробляти свої біологічні зразки. Ми порекомендуємо вам найбільш підходящий руйнівник ультразвукових елементів для ваших вимог процесу.

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових систем від компактних ручних гомогенізаторів і ультразвукових пристроїв MultiSample до промислових ультразвукових процесорів для комерційного застосування: