Ультразвуковий лізис для вестерн-блотингу

• Вестерн-блотинг – це аналітична процедура для виявлення специфічних білків у зразку гомогенату тканини або клітинного екстракту.
• Для проведення вестерн-блотингу або вимірювання активності ферментів багато методів аналізу потребують доступу до речовин і структур (наприклад, білків, ДНК, субклітинних фрагментів), що містяться всередині клітини.
• Ультразвукова обробка – це надійний і простий у застосуванні метод контрольованого руйнування та лізису клітин.

Ультразвукове руйнування клітин

Екстракція білків із тканин і культивованих клітин є першим етапом багатьох біологічних, біохімічних та аналітичних методів (PAGE, вестерн-блотинг, ELISA, мас-спектрометрія тощо) або очищення білків. Для отримання високого виходу білка клітинний матеріал і тканини необхідно ефективно зруйнувати/лізувати. Незалежно від того, чи йдеться про рослинну клітину, чи про тваринну тканину, ультразвукова обробка дає змогу легко та швидко приготувати клітинний лізат.

Переваги ультразвукової обробки

• швидкість і ефективність
• простота використання
• високий вихід білка
• відтворюваність/повторюваність
• точний контроль
• масштабованість

Протокол імунопреципітації для вестерн-імуноблотингу

A. Реагенти

Для приготування розчинів використовуйте очищену воду, наприклад Milli-Q.

• 1X фосфатно-сольовий буфер (PBS)
• 1X буфер для лізису клітин: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM пірофосфату натрію, 1 mM β-гліцерофосфату, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml лейпептину
  Важливо: додайте 1 mM PMSF безпосередньо перед використанням.
• 15 μl білка A+15 μl білка G достатньо для IP, але це може залежати від вашого первинного антитіла та об’єму зразка. Також можна використовувати попередньо змішану агарозу з білками A/G (наприклад, білок A для афінного осадження кролячих IgG і білок G для афінного осадження мишачих IgG)
• 3X буфер зразка для SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 за 25°C), 6% w/v SDS, 30% гліцеролу, 150 mM DTT, 0,03% w/v бромфенолового синього

B. Приготування клітинних лізатів

• Зберіть клітини. Щоб зібрати клітини за неденатурувальних умов, видаліть середовище й один раз промийте клітини охолодженим на льоду PBS.
• Видаліть PBS, додайте до кожної чашки (10 cm) 0,5 ml охолодженого на льоду 1X буфера для лізису клітин та інкубуйте чашки на льоду протягом 5 хвилин.
• Зіскребіть клітини з чашок і перенесіть у мікроцентрифужні пробірки. Тримайте на льоду.
• Двічі обробіть ультразвуком по 10 секунд в охолодженому на льоду буфері для імунопреципітації (буфер IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 і суміш інгібіторів протеаз). Для ультразвукової обробки VialTweeter або зондовий ультразвуковий пристрій, наприклад UP100H чи UP200Ht, підходять найкраще.
• Центрифугуйте лізати за 15 000 g протягом 10 хвилин за 4°C.
• Перенесіть супернатант у нову пробірку. (За потреби лізат можна зберігати за –80°C.)
• Додайте первинне антитіло до супернатанту. Супернатант із первинним антитілом інкубують протягом 1 h за 4°C за легкого перемішування. Первинне антитіло зазвичай додають у концентрації, у 10x вищій за ту, яку використовують для вестерн-блотингу. (Можна почати з 1μg на 100μL.)
• Потім супернатант додатково інкубують із сумішшю однакових кількостей агарози з білком A (Invitrogen) та агарози з білком G протягом ще 1 h.
• Тричі промийте осад агарози буфером IP. Потім екстрагуйте зв’язані білки буфером для нанесення зразків для SDS-PAGE, нагріваючи за 95°C протягом 5 хвилин.

C. Імунопреципітація

• Візьміть 200 μl клітинного лізату й додайте первинне антитіло. Інкубуйте за легкого погойдування протягом ночі за 4°C.
• Додайте агарозні гранули з білком A або G (20 μl 50% суспензії гранул). Інкубуйте за легкого погойдування протягом 1–3 годин за 4°C.
• Центрифугуйте в мікроцентрифузі протягом 30 секунд за 4°C. П’ять разів промийте осад 500 µl 1X буфера для лізису клітин. Під час промивання тримайте на льоду.
• Ресуспендуйте осад у 20 μl 3X буфера зразка для SDS. Перемішайте на вортексі, потім центрифугуйте в мікроцентрифузі протягом 30 секунд.
• Нагрівайте зразок до 95–100°C протягом 2–5 хвилин і центрифугуйте в мікроцентрифузі протягом 1 хвилини за 14 000 X g.
• Нанесіть зразок (15–30 μl) на гель для SDS-PAGE (12–15%).
• Проаналізуйте зразок методом вестерн-блотингу.

Вестерн-блот-аналіз з ультразвуковим пристроєм UP50H

Наведений нижче протокол із використанням зондового ультразвукового пристрою UP50H застосовували в дослідженні Kriebisch та співавт. (2011):
Загальний білок виділяли з клітин MC3T3-E1, оброблених 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) або розчинником-носієм. Клітини лізували буфером, що містив 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% додецилсульфату натрію (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) і 0,5% дезоксихолату натрію (Merck). Клітинний лізат обробляли ультразвуком протягом 2 × 10 s за налаштування циклу 1 та амплітуди 80 за допомогою ультразвукового процесора UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Тельтов, Німеччина). Після цього матеріал центрифугували протягом 10 min за 14 000 rpm, а супернатант використовували для вестерн-блотингу. Двадцять п’ять μg білка кип’ятили в буфері зразка з відновником (Invitrogen), а потім розділяли методом SDS-PAGE з використанням 4–12% поліакриламідних гелів (Invitrogen) і переносили на нітроцелюлозну мембрану (GE health care). Мембрану блокували протягом 1 h за допомогою TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), що містив 1% казеїну (Sigma-Aldrich) і 1% Tris (1 M). Після блокування мембрану інкубували за легкого перемішування протягом ночі за 4°C із первинним антитілом (кроляче антитіло проти CBS людини, 1/500, розроблене в лабораторії проф. R. Banerjee, Анн-Арбор, Мічиган, США). Інкубацію з вторинним антитілом, кон’югованим із пероксидазою хрону (HPR) (Dako), проводили протягом 1 h за кімнатної температури. Усі блоти візуалізували методом посиленої хемілюмінесценції (Perkin Elmer).
 

Натисніть тут, щоб дізнатися більше про найкращі практики ультразвукового лізису клітин та екстракції, приготування лізатів і рекомендації щодо вдосконалення процесу!
 
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність наших лабораторних ультразвукових пристроїв:

Література / Джерела

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.