Ультразвуковий лізис для вестерн-блот

• Вестерн-блот – це аналітична процедура виявлення специфічних білків у зразку тканинного гомогенату або клітинного екстракту.
• Щоб провести вестерн-блот або виміряти активність ферментів, багато аналізів вимагають доступу до матеріалів (наприклад, білків, ДНК, субклітинних фрагментів), що потрапили в клітину.
• Ультразвукова хвороба є надійним і простим у використанні методом контрольованого руйнування клітин і лізису.

Руйнування ультразвукових клітин

Екстракція білка з тканин і культивованих клітин є першим кроком для багатьох біологічних, біохімічних і аналітичних методик (ПЕЙДЖ, вестерн-блотінг, ІФА, мас-спектрометрія і т.д.) або очищення білка. Щоб отримати високий вихід білка, клітинний матеріал і тканина повинні бути ефективно порушені/лізовані. Незалежно від того, чи це рослинна клітина, чи тваринна тканина, ультразвукова діагностика – це метод легкого та швидкого приготування лізату клітин.

Переваги ультразвукового дослідження

• Швидко & Ефективним
• Простота експлуатації
• високий вихід білка,
• Відтворюваний / повторюваний
• Точне керування
• Масштабованої

Протокол імунопреципітації для західного імуноблотингу

А. Реактиви

Для приготування розчинів використовуйте очищену воду, наприклад Milli-Q.

• 1X фосфатний буферизований фізіологічний розчин (PBS)
• Буфер лізису 1X клітин: 20 мМ Tris (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 мМ пірофосфат натрію, 1 мМ β-гліцерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 1 мкг/мл Лейпептин
  Важливо: додайте 1 мМ PMSF безпосередньо перед використанням.
• 15 мкл протеїну A + 15 мкл протеїну G достатньо для IP, але це може залежати від вашого первинного антитіла та об'єму зразка. Ви також можете використовувати попередньо змішаний протеїн A/G агарозу (наприклад, протеїн A для IgG кролика та протеїн G для мишачого IgG вниз)
• 3-кратний буфер для зразків SDS: 187,5 мМ Tris-HCl (pH 6,8 при 25°C), 6% w/v SDS, 30% гліцерину, 150 мМ DTT, 0,03% w/v бромфенолового синього

Б. Приготування клітинних лізатів

• Зберіть урожай з клітин. Щоб зібрати клітини в неденатуруючих умовах, видаліть середовище та один раз промийте клітини крижаним PBS.
• Видаліть PBS і додайте 0,5 мл крижаного буфера для лізису 1X cell у кожну тарілку (10 см) і інкубуйте пластини на льоду протягом 5 хвилин.
• Зішкребти клітини з пластин і перенести в пробірки з мікроцентрифугою. Тримайте на льоду.
• Проведіть ультразвуковий засіб двічі протягом 10 секунд у крижаному буфері імунопреципітації (IP-буфер: 50 мМ Tris-HCl [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 5 мМ ЕДТА, 0,1% NP-40 та суміш інгібіторів протеази). Для ультразвукового дослідження VialTweeter або зондовий ультразвуковий апарат, такий як UP100H або UP200Ht є найбільш підходящими.
• Центрифугуйте лізати при дозуванні 15 000 г протягом 10 хвилин при температурі 4 ° C.
• Перенесіть супернатант у нову трубку. (При необхідності лізат можна зберігати при –80 ° C.)
• Додайте первинне антитіло до супернатанту. Супернатант з первинним антитілом інкубують протягом 1 год при температурі 4 ° С при легкому збудженні. Первинні антитіла зазвичай додаються в кількості в 10 разів більш концентрованому, ніж використовується для вестерн-блотингу. (Ви можете почати з 1 мкг на 100 мкл.)
• Потім супернатант інкубують далі з сумішшю рівних кількостей протеїну Агарози (Invitrogen) і протеїну G-агарози ще 1 год.
• Промийте гранули агарози тричі за допомогою IP-буфера. Після цього екстрагуйте зв'язані білки за допомогою завантажувального буфера SDS-PAGE, нагріваючи при 95 ° C протягом 5 хвилин.

В. Імунопреципітація

• Візьміть 200 мкл клітинного лізату і додайте первинне антитіло. Інкубують при легкому погойдуванні протягом ночі при температурі 4°C.
• Додайте білок А або G агарозні кульки (20 мкл 50% кашки з бісеру). Інкубують при легкому погойдуванні протягом 1–3 годин при температурі 4°C.
• Мікроцентрифугу протягом 30 секунд при температурі 4°C. Промийте гранули п'ять разів 500 мкл буфера для лізису 1X клітин. Під час миття тримайте на льоду.
• Повторно суспендуйте гранулу за допомогою буфера для зразка 20 мкл 3X SDS. Вихр, потім мікроцентрифуга на 30 секунд.
• Нагрійте зразок до 95–100 ° C протягом 2-5 хвилин і мікроцентрифугу протягом 1 хвилини при 14 000 X g.
• Завантажте зразок (15-30 мкл) на гель SDS-PAGE (12-15%).
• Проаналізуйте вибірку методом вестерн-блотингу.

Аналіз вестерн-блот за допомогою Sonicator UP50H

У дослідженні Kriebisch et al. (2011) був використаний наступний протокол з використанням зондового магнітола UP50H:
Загальний білок був виділений з клітин MC3T3-E1, оброблених 1,25 (OH)₂D₃ (10⁻⁸ М) або транспортного засобу. Клітини лізували за допомогою буфера, що містить 50 мМ Tris HCl, рН 8 (Сигма-Олдріч); 150 мМ NaCl (Фішер Науковий); 0,1% додецилсульфат натрію (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) і 0,5% дезоксихолат натрію (Merck). Лізат клітин ультразвукували протягом 2 × 10 с в циклі 1 і амплітуді 80 з Ультразвуковий процесор UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Німеччина). Після цього матеріал центрифугували протягом 10 хвилин при 14 000 об/хв, а супернатант використовували для вестерн-блотингу. Двадцять п'ять мкг білка варили в буфері та відновнику зразка (Invitrogen) і згодом відокремлювали SDS-PAGE за допомогою 4–12% поліакриламідних гелів (Invitrogen) і переносили на нітроцелюлозну мембрану (GE health care). Мембрану блокували протягом 1 год TBS (10 мМ Tris-HCl; рН 7,6; 150 мМ NaCl), що містив 1% казеїну (Сигма-Олдріч) та 1% Tris (1 М). Після блокади мембрану інкубували з невеликим збудженням протягом ночі при температурі 4 °C з первинним антитілом (кролячий антилюдський CBS 1/500, розроблений у лабораторії професора Р. Банерджі, Енн-Арбор, Мічиган, США). Інкубацію з кон'югованим вторинним антитілом до пероксидази хрону (HPR) (Dako) проводили протягом 1 год при кімнатній температурі. Всі блоти були розроблені шляхом посиленої хемілюмінесценції (Perkin Elmer).
 

Натисніть тут, щоб прочитати більше про найкращі методи лізису та екстракції ультразвукових клітин, приготування лізату та рекомендації щодо вдосконалення процесу!
 
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових апаратів лабораторного розміру:

Література / Список літератури