Ультразвуковий лізис для західних кровотеч

  • Вестерн-блот є аналітичною процедурою для виявлення специфічних білків у зразку тканинного гомогенату або клітинного екстракту.
  • Щоб запустити вестерн-блот або вимірювати ферментну активність, багато аналізів вимагає доступ до матеріалів (наприклад, білків, ДНК, субклітинних фрагментів), захоплених в клітину.
  • Sonication - це надійний і простий у використанні метод для контролю затримки та лізису клітин.

Ультразвукові розлади клітин

Екстракція протеїну з тканин та культивованих клітин є першим кроком для багатьох біологічних, біохімічних та аналітичних методів (PAGE, Western blotting, ELISA, мас-спектрометрія тощо) або очищення білків. Щоб отримати високий вихід білка, клітинний матеріал і тканина повинні бути ефективно порушені / лізировані. Незалежно від того, чи є рослинна клітина чи тканина тварин, ультразвуком є ​​спосіб підготувати клітинний лізат легко і швидко.

Переваги Sonication

  • Швидко & ефективний
  • легка операція
  • високий вихід білка
  • відтворюваний / повторюваний
  • точно контролюється
  • масштабований

Протокол імунопреципітації для західного імуноблоттингу

A. Реагенти

Для одержання розчинів використовуйте очищену воду, таку як Milli-Q.

  • 1X фосфатно-буферний фізіологічний розчин (PBS)
  • 1X буфер лізису: 20 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ EGTA, 1% Тритон Х-100, 2,5 мМ Пірофосфат натрію, 1 мМ β-гліцерофосфат, 1 мМ Na3VO4, 1 мкг / мл лейпептину
    Важливо: додайте 1 мМ PMSF безпосередньо перед використанням.
  • 15 мкл білка A + 15 мкл Білок G достатній для ІР, але це може залежати від вашого основного антитіла та об'єму зразка. Ви також можете використовувати попередньо змішане білок A / G агароза (наприклад, білок А для кролячого IgG, що знімається, і білок G для знищення миші IgG)
  • 3X SDS зразковий буфер: 187,5 мМ Трис-HCl (рН 6,8 при 25 ° С), 6% маса / об'ємна SDS, 30% гліцерин, 150 ммоль DTT, 0,03% об / б бромфенол блакитний

B. Підготовка клітинних лізатів

  • Збирайте клітини. Щоб збирати клітини в умовах невидимості, видаліть середовище та промивайте клітини один раз з льодяним PBS.
  • Видалити PBS та додати 0,5мл льоду холодного лізисного буфера 1X клітини до кожної пластини (10 см) та інкубують пластини на льоді протягом 5 хвилин.
  • Скребок клітин з пластин і переміщення в мікроцентрифуг пробірки. Тримайся на льоду.
  • Зберігають двічі протягом 10 секунд у холодному буфері імунопреципітації (IP-буфер: 50 мМ Трис-НСl [рН 7.4], 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,1% НП-40 та суміш інгібіторів протеаз). Для ультразвукової обробки VialTweeter або зондовий ультразвук, такий як UP100H або UP200Ht найбільш підходящі.
  • Центрифугували лізати при 15000 г протягом 10 хвилин при 4 ° С.
  • Перемістіть супернатант в нову пробірку. (При необхідності лізат можна зберігати при -80 ° C.)
  • Додайте основне антитіло до супернатанту. Супернатант з первинним антитілом інкубували протягом 1 години при 4 ° С при легкому перемішуванні. Первинне антитіло зазвичай додають у кількості, що в 10 разів більше концентрована, ніж використовується для вестерн-блоттингу. (Ви можете почати з 1μg на 100μL.)
  • Супернатант потім додатково інкубували сумішшю рівних кількостей протеїну А-агарози (Invitrogen) та білка G агарози ще на 1 годину.
  • Тричі печія агарозу вимийте IP-буфером. Після цього, витягують зв'язані білки з буфером для завантаження SDS-PAGE шляхом нагрівання при 95 ° С протягом 5 хвилин.

C. Імунопреципітація

  • Візьміть 200 мкл клітинної лізати та додайте первинні антитіла. Інкубуйте з ніжним качанням протягом ночі при 4 ° С.
  • Додайте білків білка A або G агарози (20мкл 50% пудри з бісеру). Інкубуйте з ніжним качанням протягом 1-3 годин при 4 ° С.
  • Мікроцентрифуга протягом 30 секунд при 4 ° С. Промивайте гранули п'ять разів 500мкл лізисного буфера 1X клітини. Промивайте під час льоду.
  • Ресуспендуйте гранули 20мл 3-кратним проби буферу SDS. Вихор, потім мікроцентрифуга протягом 30 секунд.
  • Нагрійте зразок до 95-100 ° С протягом 2-5 хвилин та мікроцентрифугу протягом 1 хвилини при 14000 х г.
  • Завантажте зразок (15-30 мкл) на гель SDS-PAGE (12-15%).
  • Проаналізуйте зразок за допомогою Western blotting.

Зв'яжіться з нами / Запитуйте додаткову інформацію

Розкажіть нам про ваших вимогах до обробки. Ми будемо рекомендувати найбільш підходящі налаштування та параметри обробки для вашого проекту.





Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Більше протоколів Sonication

Аналіз Western Blot з ультразвуковим апаратом UP50H

Наступний протокол був використаний при вивченні Kriebisch et al. (2011 р.):
Загальний білок виділяли з клітин MC3T3-E1, оброблених 1,25 (OH)2D3 (10-8 М) або транспортний засіб. Клітини лізували буфером, що містить 50 мМ Tris HCl, рН 8 (Sigma-Aldrich); 150 мМ NaCl (Fisher Scientific); 0,1% додецилсульфат натрію (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) і 0,5% натрій деоксихолат (Merck). Лізат клітини обробляли ультразвуком на 2 × 10 с при циклі 1 та амплітуді 80 с Ультразвуковий процесор UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Німеччина). Після цього матеріал центрифугували протягом 10 хв при 14000 об / хв, а супернатант використовували для західного блотування. Двадцять п'ять мікграм білка кип'ятять у буферні та відновному агенті (Invitrogen) і потім відокремлюють SDS-PAGE, використовуючи 4-12% поліакриламідних гелів (Invitrogen) і переносять на нітроцелюлозну мембрану (охорона здоров'я GE). Мембрана була заблокована протягом 1 години за допомогою TBS (10мМ Трис-HCl, рН 7,6, 150мМ NaCl), що містить 1% казеїну (Sigma-Aldrich) та 1% Трис (1М). Після блокування мембрану інкубували з невеликим збудженням протягом ночі при 4 ° С з первинним антитілом (кролик проти людини CBS 1/500, розроблений в лабораторії проф. Р. Банерджі, Енн Арбор, штат Індіана, США). Інкубація з кон'югованим пероксидазою хрону (HPR) -кон'югованим вторинним антитілом (Dako) проводили протягом 1 години при кімнатній температурі. Всі плями були розроблені посиленою хемілюмінесценцією (Perkin Elmer).

Література / Довідники



Про Вестерн Блотінг

Блоки є аналітичними процедурами, коли ДНК, РНК та білки переносяться на носій, щоб вони могли відділятися.
Південний пляп використовується для виявлення ДНК, Північної плями для РНК та західної плями для білків.
Вестерн-блоттинг також називається імуноблоттингом протеїну, тому що антитіло використовується для специфічного виявлення його антигену. Western Blotting є одним з найважливіших методів аналізу для виявлення специфічних білків у зразку. У Western blot білки затримуються на мембранах для їх виявлення за допомогою моноклональних або поліклональних антитіл.
За допомогою SDS-поліакриламідного гель-електрофорезу (SDS-PAGE) природні білки розділяються 3-D структурою або денатурованими білками по довжині поліпептиду. Білки потім переносяться на мембрану (як правило, нітроцелюлоза або PVDF), де вони забарвлені антитілами, специфічними до цільового білка. Етап гель-електрофорезу включається в аналіз західного блоту для вирішення проблеми взаємної реактивності антитіл.
Потім відокремлені білки зливають на матрицю (переважно на нітроцелюлозну або PVDF-мембрану), де вони забарвлені антитілами. Антитіла функціонують як зонд і виділяються спеціально до цільового білка. Аналіз місця розташування та інтенсивності конкретної реакції показує деталі вираження цільових білків у даному зразку. Вестерн-блоттинг може виявити цільовий протеїн, який є настільки низьким, як 1нг, через високу роздільну здатність гель-електрофорезу та високу специфічність та високу чутливість імунологічного аналізу. Метод Western blot використовується в молекулярній біології, біохімії, імуногенетиці та інших областях молекулярного дослідження.
Інші пов'язані з цим методики включають точка-блотовий аналіз, імуногістохімію та імуноцитохімію, де антитіла використовуються для виявлення білків у тканинах і клітинах за допомогою імунозабезпечення, а також ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter для приготування ультразвукового зразка

Зв'яжіться з нами! / Запитати нас!





Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Підживлення є важливим етапом при підготовці зразка

UP200St з мікро-наконечником для зразка ультразвуком