Hielscher ультразвукова технологія

Вилучення ультразвукового білка з тканин та клітинних культур

  • Білок екстракції є важливим етапом підготовки проби в протеомиці.
  • Білки можуть бути вилучені з рослинних і тваринних тканин, дріжджів і мікроорганізмів.
  • Sonication - це надійний, ефективний метод екстракції білка, що дає високу вихід білків протягом короткого часу вилучення.

 

Видобуток білка з тканин і клітин

Екстракція протеїну з тканин та культивованих клітин є основною стадією підготовки проб, яка виконується під час багатьох біохімічних та аналітичних методів, таких як ELISA, PAGE, Вестерн-блотінг, мас-спектрометрія або очищення білка. Ультразвукова порушення клітин, лізис та вилучення є точно контрольованою технікою для забезпечення високої врожайності білків.

Вилучення протеїну з тканини тварин

Для підготовки тканини цільного розміру (наприклад, нирки, серце, легені, м'язи тощо) тканини слід розщеплювати у дуже дрібні шматочки чистими інструментами, на льоду, бажано, і якомога швидше, щоб запобігти деградації протеазами (наприклад, лізисний буфер, такий як RIPA або гіпотоничний буфер лізису, який містить коктейль інгібіторів протеази та фосфатази). Після розтирання зразок занурюють у рідкий азот для заморожування. Зразок можна зберігати при -80 ° С для подальшого використання або зберігати на льоду для негайного гомогенізації. Незадовго до вилучення з ультразвуком, у пробірку (до 10 мг тканини рекомендується приблизно 600 мкл буфера) рекомендується буфер із залишковим холодним холодом (з інгібіторами протеаз DTT, леупептин та апротинін). Приблизно 20-60 мг тканини рекомендується на пробірку.
Ультразвукова гомогенізація, лізис та екстракція виконуються ультразвуковим гомогенізатором, таким як UP200Ht або UP200St, оснащений мікро-наконечником сонотрода. Тривалість синхронізації становить 60-90 сек. при ультразвуковому циклі режиму 15 сек. ультразвуком та 10 сек. час відпочинку Зразок завжди слід зберігати у льоду.
Після ультразвукової гомогенізації / екстракції лізат центрифугують при 27000г прибл. 20 хв. Після цього зібраний супернатент, так що концентрація білка може бути визначена білковим аналізом, таким як аналіз білка Pierce, BCA.

Білкова сокації є важливим методом зразка підготовки

Ультразвуковий видобуток білка з клітин з UP200St

Запит інформації




Зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Екстракція протеїну з сироватки крові

Для однорідної суміші сироватки та фосфатного буфера, зразок вивергають спочатку перед лізисом ультразвукового клітин. Для ультразвукового лізису зразок обробляється ультразвуковим лабораторним гомогенізатором, таким як UP100H для 8 циклів з амплітудою 20%, для циклів кожні 5 секунд і 15 секунд. Зонкування здійснюється за допомогою ультразвукової терапії г у циклах і шляхом розміщення зразка на льоду, щоб уникнути перегрівання та термічної деградації зразка. Оскільки сироватка містить велику кількість високомолекулярних білків (таких як альбумін, α1-антитрипсин, трансферин, гаптоглобулін, імуноглобулін G та імуноглобулін А), які перешкоджають розділенню низькомолекулярних білків під час МЕФ, рекомендується їх виснаження з сироватки, використовуючи колонку з виснаженням.

Екстракція протеїну з рослинної тканини

Свіжа, м'яка тканина рослин, наприклад, моху тощо, може бути легко порушена, просто розміщуючи рубаний матеріал зразка у лізисний буфер для обробки ультразвуком. Жорсткі тканини рослин, такі як насіння, ялинки тощо, повинні бути сухими. Деякі жорсткі деревні рослинні матеріали повинні бути заморожені та заземлені в рідкому азоті до вилучення з допомогою ультразвукової обробки. Для суспензій культур клітин рослин ультразвукове лікування від 30 до 150 секунд у лізисному буфері в основному достатнє. Більш суворі матеріали, такі як насіння гарбуза, вимагають більш інтенсивної обробки ультразвуком, як описано нижче.

Протокол для ультразвукового вилучення альбуміну з насіння гарбуза

Гомогенизатор ультразвукової тканини UP400St з S24d40 - для вилучення білків з тканин рослин і тварин (натисніть, щоб збільшити!)Для екстракції ультразвукового білка альбуміну з дрібнозернистого зерна порошку з насіння гарбуза додають 10 г порошкозного порошку порошку гарбуза та 100 мл деіонізованої води у вигляді розчинника у скляній склянці з об'ємом 250 мл. Видобуток білків складається з двох етапів: по-перше, зразок з ультразвуковим ультразвуком зондується UP400St (400 Вт, 24 КГц) з монтуючим сонотродом S24d7. Скляний скляний стакан поміщають у холодну водяну баню під час ультразвукової гомогенізації. Налаштування ультразвукового пристрою UP400St з включеним датчиком температури забезпечує, що температура зразка завжди тримається нижче 30 ° C. За точного контролю температури під час обробки ультразвуком, уникати денатурації альбуміну. По-друге, екстракція виконувалась за допомогою змішувача зі швидкістю 200 об / хв та 30 ° С. Далі склянку переносять у термостатичний шейкер. Глобулін видаляється шляхом дилянізування дистильованою водою. Після видалення глобуліну білковий екстракт може бути відібраний для визначення профілю альбуміну і згодом налаштовується до pI = 3,0, використовуючи 0,1 М HCl для коагуляції альбуміну. Тверду фазу відокремлюють шляхом центрифугування при 5000г, 20 ° С і повторно розчиняють у деіонізованій воді. Коагуляція альбуміну виконується двічі, щоб збільшити співвідношення білка в концентраті альбуміну.

Екстракція ультразвукових лужних білків для одержання білкового концентрату з рисових висівок показує, що ультразвукове лікування призводить до вищих вихідних білків у значно коротший час вилучення – в порівнянні зі звичайними методами вилучення.

Ультразвуковий пристрій VialTweeter для вилучення білків з зразків тканини (натисніть, щоб збільшити!)

VialTweeter для непрямих ультразвуком

Переваги

  • швидкий
  • висока врожайність
  • високоефективний
  • Точний контроль над параметрами
  • відтворювані результати
  • Лінійна масштабованість

Протокол підготовки зразка для функціонального ферменту iNOS

Для отримання цілком функціонального ферменту iNOS (наприклад, для скринінгу препаратів) рекомендується наступний протокол: клітинну суспензію слід розміщувати на льоду та наносити сонячну форму з UP100H при амплітуді 10мкм в режимі циклу 5 сек. ультразвуком та 25 сек. відпочинок на льоду. Процедура повинна бути повторена приблизно. 3 рази. Час відпочинку між циклами ультразвукової обробки знижує підвищення температури і, отже, зменшує ризик денатурації.

Розчинення ультразвукових білків

Заживлення може прискорити процес солюбілізації білка, що зазвичай вимагає декількох годин. Щоб не перегріти зразок та не допускати деградації білка та модифікацій у розчинах, що містять сечовину, ультразвукові сплески не повинні тривати довше, ніж кілька секунд.

Загальні інструкції

Контроль температури: Щоб забезпечити високу вихід білка без термічної денатурації, температура під час екстракції повинна контролюватися. Ультразвукові гомогенізатори Hielscher – також називають ультразвуковим дезінтегратором або універсальним пристроєм – є точно керованими. Вони оснащені підключеним датчиком температури. У налаштуваннях ультразвукового гомогенізатора можна встановити максимальну температуру. Коли досягнуто максимальна температура, ультразвуковий пристрій автоматично зупиняється, поки зразок не охолоне.
Буфер: Вибір відповідного буфера та правильного обсягу буфера коливається від тканини до тканини і повинен бути визначений за допомогою тестування на випробування.
Виділення / очищення: Бізавінні лізати можуть містити надлишок біомолекул, таких як ДНК або вуглеводи, які можуть бути видалені осадженням протеїну (деоксихолат-трихлоруксусная кислота) або буферного обміну.

Chittapalo і Noomhorm (2009) повідомляють, що збільшення білка зростає при використанні ультразвукової терапії, і що процес гомогенізації та лізису ультразвукових тканин може значно покращити існуючі процеси екстракції – що дає можливість нових комерційних можливостей видобутку.

Звуковий захист із звукоізоляцією Hielscher SPB-L та ультразвуковим пристроєм UP200St. (Натисніть, щоб збільшити!)

Гомогенізатор ультразвукової тканини UP200St для ефективного вилучення білка

Точний контроль над ультразвуковим лікуванням (натисніть, щоб збільшити!)

Контроль браузера для точної роботи та моніторингу процесу обробки ультразвуком

Ультразвукове обладнання для вилучення білка

Hielscher Ultrasonics пропонує широкий спектр ультразвукових гомогенізаторів для розпаду клітин, тканин, бактерій, мікроорганізмів, дріжджів і спор.
Ультразвукові апарати Hielscher лабораторії є потужними і прості в експлуатації. Побудовані для роботи цілодобово, вони розроблені як надійні та ефективні пристрої для лабораторних і настільних пристроїв. Для всіх пристроїв можна точно контролювати вихід енергії та амплітуду. Широкий асортимент Аксесуари відкриває додаткові параметри налаштування. Цифрові пристрої, такі як VialTweeter, UP200Ht, UP200St, і UP400St мають інтегрований контроль температури та вбудовану SD-карту для автоматичного запису даних.
Для непрямої, безперешкодної та одночасної ультразвукової обробки декількох зразків ми пропонуємо VialTweeter або Ультразвукова чаша.
Залежно від вашого застосування, матеріалу та обсягу зразка, ми рекомендуємо вам найбільш підходящий набір для підготовки зразка. Зв'язатися з нами сьогодні!

Зв'яжіться з нами! / Запитати нас!

Будь ласка, використовуйте форму нижче, якщо ви хочете отримати додаткову інформацію про гомогенізацію ультразвуку. Ми будемо раді запропонувати вам ультразвукову систему, яка відповідатиме вашим вимогам.









Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.


Література / Довідники

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ультразвукова лужна екстракція білків з висушених рисових висівок та властивостей білкових концентратів. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Семієс, Андре ЕС :; Перейра, Діана М .; Амарал, Джоана Д .; Нунеса, Ана Ф .; Гомес, Софія Е .; Родрігес, Педро М .; Ось, Адріан К .; D'Hooge, Rudi; Стер, Кліффорд Дж.; Тібодо, Стефен Н .; Борралхо, Педро М .; Родрігес, Сесілія МП (2013 р.): Ефективне відновлення білків з декількох зразків джерел після екстракції тризолу або тризолу LS РНК та тривалого зберігання. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Факти варті знати

Протеомика

Proteomics - це дослідження, яке досліджує білки та протеоми. Білки мають повний спектр життєво важливих функцій всередині організмів. Протемон є цілим набором білків, виражених геномом, клітиною, тканиною або організмом у певний час. Протемон змінюється з часом і чіткими вимогами, або напругами, що зазнає клітина чи організм. Більш конкретно, це являє собою сукупність виражених білків у певному типі клітини або організму в певний момент часу в певних умовах. Цей термін являє собою суміш білків та геному. Протеоміка - дослідження протеома.

Протеїн

Білки - це великі біомолекули, так звані макромолекули – які складаються з однієї або декількох довгих ланцюжків амінокислотних залишків. Білки присутні у всіх організмах як рослинного, так і тваринного походження, і вони мають вирішальне значення для більшості біологічних функцій. Оскільки білки містять велику кількість біологічної інформації, вони витягуються з аналітичного призначення, наприклад, для протеомічних досліджень. Найбільш важливою функцією білків є каталіз метаболічних реакцій, реплікація ДНК, реакція на подразники та транспортування молекул з одного місця в інше. Білки відрізняються один від одного в першу чергу в їх послідовності амінокислот, що продиктовано нуклеотидною послідовністю їх генів, і що зазвичай призводить до складання білків у специфічну тривимірну структуру, яка визначає її активність. Білки є – крім пептидів – один з ключових компонентів їжі. Тому протеоміка є потужним інструментом в галузі харчової науки для оптимізації процесів, безпеки продуктів харчування та оцінки харчування.

Гель-електрофорез

Гель-електрофорез є основним методом розділення та аналізу макромолекул, таких як ДНК, РНК та білки, а також їх фрагменти, виходячи з їх розміру та заряду. Він використовується в клінічній хімії для розділення білків на заряд та / або розмір (IEF агароза, суттєво незалежна від величини), а також в біохімії, молекулярної біології та протеоміки, щоб відокремлювати змішану популяцію фрагментів ДНК і РНК довжиною, для оцінки розміру ДНК і фрагменти РНК або окремі білки заряд.

Клітинні культури

Клітинна культура - контрольований процес росту, за допомогою якого клітини культивують в контрольованих умовах. Умови клітинної культури варіюються для кожного типу клітин. Загалом, середовище клітинної культури складається з відповідного судини (наприклад, тарілки Петрі) з субстратом або середовищем, яке поставляє основні поживні речовини (амінокислоти, вуглеводи, вітаміни, мінерали), фактори росту, гормони та гази (СО2, О.2), і регулює фізико-хімічне середовище (pH-буфер, осмотичний тиск, температура). Більшість клітин потребують поверхні або штучного субстрату, тоді як інші культури клітин можна культивувати вільно плаваючим у культуральному середовищі (культура суспензії, клітинна суспензія).
Масові культури клітинних ліній тварин використовуються для промислового виробництва вірусних вакцин та інших біотехнологічних продуктів. Стовбурові клітини людини культивуються для збільшення кількості клітин і диференціювання клітин на різні типи соматичних клітин для цілей трансплантації.

Зразки тканин

Термін "тканина" описує клітинний проміжний продукт, де клітинний матеріал знаходиться на організаційному рівні між клітинами та повним органом. У тканинах зібрані аналогічні клітини з одного походження, які разом виконують певну функцію. За функціональною групою множинних тканин утворюються складні структури органів.
Тканини відбирають для дослідження біології, гістології / гістопатології, паразитології, біохімії, імуногістохімії, а також для вирощування та екстракції ДНК. Можна розрізняти тварину (підрозділ: тканина ссавців) і рослинну тканину. Тваринні тканини згруповані в чотири основних типи сполучної, м'язової, нервової та епітеліальної тканин. Тканина рослин підрозділяється на наступні три тканинні системи: епідерміс, тканини землі та судинну тканину.
Зразки тканин можуть бути приготовлені з частин тварин або рослин, наприклад, кістки, м'язи, листя тощо.

Тіла рідини

Кров, сироватка, плазма, спинномозкова рідина, слина і синовіальна рідина є рідинами організму, які є чудовим джерелом діагностично важливої ​​інформації. Тому важливою є складна підготовка зразків рідини тіла для аналізу. Перша складність пов'язана з широким динамічним діапазоном компонентів, присутніх у рідинах організму.

Визначення концентрації білка

Аналіз Бредфорда, аналіз Лоурі та біцинхонінової кислоти (BCA) - це загальні аналізи для визначення концентрації білків. Бульбарний сироватковий альбумін (BSA) - один з найбільш часто використовуваних стандартних білків.

Лізисний буфер

Лізисний буфер слід вибрати відповідно до матеріалу або тканини клітини (тканинна культура, рослина, бактерії, грибки тощо), а також чи є клітини структурою та типом структури. Широкий діапазон лізисних буферів для екстракції білків, мембран та органел формується з одним або декількома миючими засобами. Засіб для миючого засобу зазвичай вибирається за допомогою випробувань на випробування або помилок – якщо доступно – згідно з існуючим протоколом вилучення білка. Миючий засіб повинен бути сумісний з джерелом тканин та білками. Загалом, найнижчий миючий засіб, який працює для певної тканини / білка, вибирається для підтримки максимальної функціональності екстракту. Крім того, у випадку екстракції мембран та органел м'який миючий засіб зберігає мембрану недоторканою. Найчастіше використовувані миючі засоби у лізисних буферах переважно неіонні або цвіттеріонні, наприклад, CHAPS, деоксихолат, Triton ™ X-100, NP40 і Tween 20.
Наприклад, тканини, такі як мозок, печінка, кишечник, нирка, селезінка тощо, можуть бути просто буферизованими з RIPA – однак протеазних інгібітори та ДТТ (наприклад, для гель-електрофорезу) повинні бути включені.
Лізисовий буфер для скелетних м'язових тканин (льоду): 20 мМ Трис (рН 7,8), 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1% Тритону Х-100, 10% (мас. / Об.) Гліцерину, 1 мМ ЕДТА , 1мМ дитіотреітолу, доповненого коктейлем інгібітора протеази та фосфатази
Таблиця загальних буферів та їх діапазон рН. Загалом, ці буфери звичайно використовуються при концентраціях 20-50 мМ.

Буфер діапазон рН
Лимонна кислота – NaOH 2.2 – 6.5
Цитрат натрію – Лимонна кислота 3.0 – 6.2
Ацетат натрію – оцтова кислота 3.6 – 5.6
Натрієва сіль качова кислота – HCl 5.0 – 7.4
МОН – NaOH 5.6 – 6.8
Натрій дигідрофосфат – динатрієвий водневий фосфат 5.8 – 8.0
Імідазол – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Триетаноламін гідрохлорид – NaOH 6.8 – 8.8
Трис – HCl 7,0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Трицин – NaOH 7.6 – 8.6
Тетраборат натрію – Борна кислота 7.6 – 9.2
Біцине – NaOH 7.7 – 8.9
Гліцин – NaOH 8.6 – 10.6

Більшість буферів показують рН-залежність від температури. Це особливо стосується трис-буферів. PKa змінюється з 8.06 при 25 ° С до 8.85 при 0 ° С.
(рН і рКа буфера: рН вимірює концентрацію іонів водню у водному розчині, pKa (= константа дисоціації кислоти) є пов'язаною, але більш конкретною мірою, оскільки вона допомагає передбачити, як молекула буде діяти при певному Значення рН.)

Трізол

Трізол - це хімічний розчин, що використовується для виділення РНК / ДНК / білка під час екстракції гуанідиній тіоціанат-фенол-хлороформ. Використання ультразвукового методу екстракції TRIzol призводить до високої ДНК, РНК та виходу білка з одного зразка, і, таким чином, перевищує інші методи екстракції.