Вилучення ультразвукового білка з тканин та клітинних культур
- Білок екстракції є важливим етапом підготовки проби в протеомиці.
- Білки можуть бути вилучені з рослинних і тваринних тканин, дріжджів і мікроорганізмів.
- Sonication - це надійний, ефективний метод екстракції білка, що дає високу вихід білків протягом короткого часу вилучення.
Видобуток білка з тканин і клітин
Екстракція білка з тканин і культивованих клітин є важливим етапом підготовки зразків, який виконується під час багатьох біохімічних та аналітичних методів, таких як ІФА, PAGE, західний блоттинг, мас-спектрометрія або очищення білка. Ультразвукове порушення клітин, лізис та екстракція є точно контрольованою, нетермічною технікою для забезпечення високих врожаїв білків.
Екстракція білка з клітин за допомогою ультразвуковий зонд UP200St
- швидкий
- висока врожайність
- високоефективний
- Точний контроль над параметрами
- відтворювані результати
- Лінійна масштабованість
Загальні інструкції для ультразвукового лізису та вилучення білка
- Контроль температури: Щоб забезпечити високу вихід білка без термічної денатурації, температура під час екстракції повинна контролюватися. Ультразвукові гомогенізатори Hielscher – також називається ультразвуковим дезінтегратором або ультрасоніфікатором – є точно керованими. Вони оснащені підключеним датчиком температури. У налаштуваннях ультразвукового гомогенізатора можна встановити максимальну температуру. Коли досягнуто максимальна температура, ультразвуковий пристрій автоматично зупиняється, поки зразок не охолоне.
- Буфер: Вибір відповідного буфера та правильного обсягу буфера коливається від тканини до тканини і повинен бути визначений за допомогою тестування на випробування.
- Виділення / очищення: Бізавінні лізати можуть містити надлишок біомолекул, таких як ДНК або вуглеводи, які можуть бути видалені осадженням протеїну (деоксихолат-трихлоруксусная кислота) або буферного обміну.
Читтапало і Ноомхорм (2009) повідомили у своєму дослідженні, що вихід білка збільшився за допомогою ультразвукової обробки і що процес гомогенізації та лізису ультразвукової тканини може значно покращити існуючі процеси екстракції – що дає можливість нових комерційних можливостей видобутку.
Ультразвукова чаша для одночасної, високоефективної підготовки зразків декількох зразків за однакових умов виділення білка та фрагментації ДНК.
Вилучення протеїну з тканини тварин
Для підготовки тканини цільного розміру (наприклад, нирки, серце, легені, м'язи тощо) тканини слід розщеплювати у дуже дрібні шматочки чистими інструментами, на льоду, бажано, і якомога швидше, щоб запобігти деградації протеазами (наприклад, лізисний буфер, такий як RIPA або гіпотоничний буфер лізису, який містить коктейль інгібіторів протеази та фосфатази). Після розтирання зразок занурюють у рідкий азот для заморожування. Зразок можна зберігати при -80 ° С для подальшого використання або зберігати на льоду для негайного гомогенізації. Незадовго до вилучення з ультразвуком, у пробірку (до 10 мг тканини рекомендується приблизно 600 мкл буфера) рекомендується буфер із залишковим холодним холодом (з інгібіторами протеаз DTT, леупептин та апротинін). Приблизно 20-60 мг тканини рекомендується на пробірку.
Ультразвукова гомогенізація, лізис та екстракція виконується за допомогою ультразвукового гомогенізатора, такого як UP100H або UP200Ht, оснащеного сонотродом з мікронаконечником. Тривалість ультразвукової обробки становить 60-90 сек. при режимі ультразвукового циклу 15 сек. Зразок слід весь час тримати в льоду.
Після ультразвукової гомогенізації / екстракції лізат центрифугують при 27000г прибл. 20 хв. Після цього зібраний супернатент, так що концентрація білка може бути визначена білковим аналізом, таким як аналіз білка Pierce, BCA.
Екстракція протеїну з сироватки крові
Для однорідної суміші сироватки та фосфатного буфера зразок спочатку вихрюють перед лізисом ультразвукових клітин. Для ультразвукового лізису зразок обробляється ультразвуковим лабораторним гомогенізатором, таким як UP100H для 8 циклів з амплітудою 20%, для циклів кожні 5 секунд увімкнення та 15 секунд. Екстракція білка здійснюється ультразвуком у циклах (режим пульсації) та шляхом розміщення зразка на льоду, щоб уникнути перегріву та термічної деградації зразка. Оскільки сироватка містить велику кількість високомолекулярних білків (таких як альбумін, α1-антитрипсин, трансферин, гаптоглобулін, імуноглобулін G та імуноглобулін А), які перешкоджають поділу низькомолекулярних білків під час МЕФ, рекомендується виснажувати їх із сироватки за допомогою колонки виснаження.
Екстракція протеїну з рослинної тканини
Свіжа, м'яка тканина рослин, наприклад, моху тощо, може бути легко порушена, просто розміщуючи рубаний матеріал зразка у лізисний буфер для обробки ультразвуком. Жорсткі тканини рослин, такі як насіння, ялинки тощо, повинні бути сухими. Деякі жорсткі деревні рослинні матеріали повинні бути заморожені та заземлені в рідкому азоті до вилучення з допомогою ультразвукової обробки. Для суспензій культур клітин рослин ультразвукове лікування від 30 до 150 секунд у лізисному буфері в основному достатнє. Більш суворі матеріали, такі як насіння гарбуза, вимагають більш інтенсивної обробки ультразвуком, як описано нижче.
Протокол для ультразвукового вилучення альбуміну з насіння гарбуза
Для ультразвукової білкової екстракції альбуміну з дрібномеленого порошку насіння гарбуза в скляний стакан вагою 250 мл додають 10 г знежиреного порошку насіння гарбуза і 100 мл деіонізованої води як розчинник. Екстракція білка складається з двох етапів: Спочатку зразок ультразвукової обробки ультразвуковий апарат зондового типу UP400St (400 Вт, 24 кГц), оснащений сонотродом S24d7. Скляну склянку поміщають на холодну водяну баню під час ультразвукової гомогенізації. Підключається датчик температури та налаштування контролю температури ультразвукового пристрою UP400St гарантують, що температура зразка завжди підтримується нижче 30 ° C. Завдяки точному контролю температури під час ультразвукової обробки уникають денатурації альбуміну. По-друге, екстракція виконувалася міксером при швидкості 200 об / хв і при 30 ° C. Після цього мензурку переносять в терморегулюючий шейкер. Глобулін видаляється за допомогою діалізу дистильованою водою. Після видалення глобуліну білковий екстракт може бути відібраний для визначення профілю альбуміну і згодом коригується до pI = 3,0 з використанням 0,1 M HCl для коагуляції альбуміну. Тверду фазу відокремлюють центрифугуванням при температурі 5000г, 20°С і повторно розчиняють у деіонізованій воді. Коагуляція альбуміну проводиться двічі для збільшення співвідношення білка в концентраті альбуміну.
Екстракція ультразвукових лужних білків для одержання білкового концентрату з рисових висівок показує, що ультразвукове лікування призводить до вищих вихідних білків у значно коротший час вилучення – в порівнянні зі звичайними методами вилучення.
Протокол підготовки зразка для функціонального ферменту iNOS
Для отримання повністю функціонального ферменту iNOS (наприклад, для скринінгу лікарських засобів) рекомендується наступний протокол: Суспензія клітини повинна бути розміщена на льоду і ультразвукова обробка UP100H при амплітуді 10 мкм в режимі циклу 5 сек. Процедуру слід повторити приблизно 3 рази. Час спокою між циклами ультразвукової обробки зменшує підвищення температури і, отже, зменшить ризик денатурації.
Розчинення ультразвукових білків
Заживлення може прискорити процес солюбілізації білка, що зазвичай вимагає декількох годин. Щоб не перегріти зразок та не допускати деградації білка та модифікацій у розчинах, що містять сечовину, ультразвукові сплески не повинні тривати довше, ніж кілька секунд.
Ультразвуковий апарат UP200Ht з мікронаконечником 2 мм S26d2 для ультразвукової обробки невеликих зразків.
Ультразвукове обладнання для вилучення білка
Hielscher Ultrasonics пропонує широкий спектр ультразвукових гомогенізаторів для розпаду клітин, тканин, бактерій, мікроорганізмів, дріжджів і спор.
Ультразвукові апарати лабораторії Hielscher є потужними та простими в експлуатації. Створені для роботи 24/7, вони розроблені як надійні та ефективні лабораторні та настільні пристрої. Для всіх пристроїв вихід енергії та амплітуду можна точно контролювати. Широкий асортимент аксесуарів відкриває подальші можливості налаштування. Цифрові ультразвукові апарати, такі як VialTweeter, UP200Ht, UP200St та UP400St, мають інтегрований контроль температури та вбудовану SD-карту для автоматичного запису даних.
Для непрямої, без перехресного забруднення та одночасної ультразвукової обробки кількох зразків ми пропонуємо VialTweeter або ультразвуковий CupHorn.
Таблиця нижче дає вам огляд наших ультразвукових препаратів для підготовки зразків, порушення клітин та вилучення. Натисніть на тип пристрою, щоб отримати більше інформації про кожен ультразвуковий гомогенізатор. Наш добре навчений і багаторічний досвід технічного персоналу буде радий допомогти вам у виборі найбільш підходящого ультразвукового апарату для вашої підготовки зразка!
| пакетний Обсяг | швидкість потоку | Рекомендовані пристрої |
|---|---|---|
| до 10 флаконів або трубочок | застосовується | VialTweeter |
| мультидвелл / мікротитерні пластини | застосовується | (УІП400МТП) |
| кілька трубок / судин | застосовується | CupHorn |
| Від 1 до 500мл | Від 10 до 200мл / хв | UP100H |
| від 10 до 1000мл | від 20 до 200 мл / хв | UP200Ht, UP200St |
| Від 10 до 2000мл | Від 20 до 400мл / хв | UP400St |
Залежно від вашого застосування, матеріалу та обсягу зразка, ми рекомендуємо вам найбільш підходящий набір для підготовки зразка. Зв'язатися з нами сьогодні!
Зв'яжіться з нами! / Запитати нас!
Hielscher digital ultrasonicators мають пульт дистанційного керування браузером і автоматичне протоколювання даних на вбудованій SD-карті.
VialTweeter для непрямих ультразвуком
Факти варті знати
Протеомика
Proteomics - це дослідження, яке досліджує білки та протеоми. Білки мають повний спектр життєво важливих функцій всередині організмів. Протемон є цілим набором білків, виражених геномом, клітиною, тканиною або організмом у певний час. Протемон змінюється з часом і чіткими вимогами, або напругами, що зазнає клітина чи організм. Більш конкретно, це являє собою сукупність виражених білків у певному типі клітини або організму в певний момент часу в певних умовах. Цей термін являє собою суміш білків та геному. Протеоміка - дослідження протеома.
Протеїн
Білки - це великі біомолекули, так звані макромолекули – які складаються з однієї або декількох довгих ланцюжків амінокислотних залишків. Білки присутні у всіх організмах як рослинного, так і тваринного походження, і вони мають вирішальне значення для більшості біологічних функцій. Оскільки білки містять велику кількість біологічної інформації, вони витягуються з аналітичного призначення, наприклад, для протеомічних досліджень. Найбільш важливою функцією білків є каталіз метаболічних реакцій, реплікація ДНК, реакція на подразники та транспортування молекул з одного місця в інше. Білки відрізняються один від одного в першу чергу в їх послідовності амінокислот, що продиктовано нуклеотидною послідовністю їх генів, і що зазвичай призводить до складання білків у специфічну тривимірну структуру, яка визначає її активність. Білки є – крім пептидів – один з ключових компонентів їжі. Тому протеоміка є потужним інструментом в галузі харчової науки для оптимізації процесів, безпеки продуктів харчування та оцінки харчування.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction є преаналітичною процедурою для розділення і попереднього вигадування аналітів. У поєднанні з ультразвуком вилучення хмарних точок може бути інтенсифіковано, що робить процес більш ефективним, швидшим та екологічним. При ультразвуковому дослідженні вилучення хмарних точок є значно ефективнішим методом підготовки аналіту. Дізнайтеся більше про ультразвукове вилучення хмарних точок!Гель-електрофорез
Гель-електрофорез є основним методом розділення та аналізу макромолекул, таких як ДНК, РНК та білки, а також їх фрагменти, виходячи з їх розміру та заряду. Він використовується в клінічній хімії для розділення білків на заряд та / або розмір (IEF агароза, суттєво незалежна від величини), а також в біохімії, молекулярної біології та протеоміки, щоб відокремлювати змішану популяцію фрагментів ДНК і РНК довжиною, для оцінки розміру ДНК і фрагменти РНК або окремі білки заряд.
Клітинні культури
Клітинна культура - контрольований процес росту, за допомогою якого клітини культивують в контрольованих умовах. Умови клітинної культури варіюються для кожного типу клітин. Загалом, середовище клітинної культури складається з відповідного судини (наприклад, тарілки Петрі) з субстратом або середовищем, яке поставляє основні поживні речовини (амінокислоти, вуглеводи, вітаміни, мінерали), фактори росту, гормони та гази (СО2, О.2), і регулює фізико-хімічне середовище (pH-буфер, осмотичний тиск, температура). Більшість клітин потребують поверхні або штучного субстрату, тоді як інші культури клітин можна культивувати вільно плаваючим у культуральному середовищі (культура суспензії, клітинна суспензія).
Масові культури клітинних ліній тварин використовуються для промислового виробництва вірусних вакцин та інших біотехнологічних продуктів. Стовбурові клітини людини культивуються для збільшення кількості клітин і диференціювання клітин на різні типи соматичних клітин для цілей трансплантації.
Зразки тканин
Термін "тканина" описує клітинний проміжний продукт, де клітинний матеріал знаходиться на організаційному рівні між клітинами та повним органом. У тканинах зібрані аналогічні клітини з одного походження, які разом виконують певну функцію. За функціональною групою множинних тканин утворюються складні структури органів.
Тканини відбирають для дослідження біології, гістології / гістопатології, паразитології, біохімії, імуногістохімії, а також для вирощування та екстракції ДНК. Можна розрізняти тварину (підрозділ: тканина ссавців) і рослинну тканину. Тваринні тканини згруповані в чотири основних типи сполучної, м'язової, нервової та епітеліальної тканин. Тканина рослин підрозділяється на наступні три тканинні системи: епідерміс, тканини землі та судинну тканину.
Зразки тканин можуть бути приготовлені з частин тварин або рослин, наприклад, кістки, м'язи, листя тощо.
Тіла рідини
Кров, сироватка, плазма, спинномозкова рідина, слина і синовіальна рідина є рідинами організму, які є чудовим джерелом діагностично важливої інформації. Тому важливою є складна підготовка зразків рідини тіла для аналізу. Перша складність пов'язана з широким динамічним діапазоном компонентів, присутніх у рідинах організму.
Визначення концентрації білка
Аналіз Бредфорда, аналіз Лоурі та біцинхонінової кислоти (BCA) - це загальні аналізи для визначення концентрації білків. Бульбарний сироватковий альбумін (BSA) - один з найбільш часто використовуваних стандартних білків.
Лізисний буфер
Лізисний буфер слід вибрати відповідно до матеріалу або тканини клітини (тканинна культура, рослина, бактерії, грибки тощо), а також чи є клітини структурою та типом структури. Широкий діапазон лізисних буферів для екстракції білків, мембран та органел формується з одним або декількома миючими засобами. Засіб для миючого засобу зазвичай вибирається за допомогою випробувань на випробування або помилок – якщо доступно – згідно з існуючим протоколом вилучення білка. Миючий засіб повинен бути сумісний з джерелом тканин та білками. Загалом, найнижчий миючий засіб, який працює для певної тканини / білка, вибирається для підтримки максимальної функціональності екстракту. Крім того, у випадку екстракції мембран та органел м'який миючий засіб зберігає мембрану недоторканою. Найчастіше використовувані миючі засоби у лізисних буферах переважно неіонні або цвіттеріонні, наприклад, CHAPS, деоксихолат, Triton ™ X-100, NP40 і Tween 20.
Наприклад, тканини, такі як мозок, печінка, кишечник, нирка, селезінка тощо, можуть бути просто буферизованими з RIPA – однак протеазних інгібітори та ДТТ (наприклад, для гель-електрофорезу) повинні бути включені.
Лізисовий буфер для скелетних м'язових тканин (льоду): 20 мМ Трис (рН 7,8), 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1% Тритону Х-100, 10% (мас. / Об.) Гліцерину, 1 мМ ЕДТА , 1мМ дитіотреітолу, доповненого коктейлем інгібітора протеази та фосфатази
Таблиця загальних буферів та їх діапазон рН. Загалом, ці буфери звичайно використовуються при концентраціях 20-50 мМ.
| Буфер | діапазон рН |
|---|---|
| Лимонна кислота – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Цитрат натрію – Лимонна кислота | 3.0 – 6.2 |
| Ацетат натрію – оцтова кислота | 3.6 – 5.6 |
| Натрієва сіль качова кислота – HCl | 5.0 – 7.4 |
| МОН – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Натрій дигідрофосфат – динатрієвий водневий фосфат | 5.8 – 8.0 |
| Імідазол – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Триетаноламін гідрохлорид – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Трис – HCl | 7,0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Трицин – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Тетраборат натрію – Борна кислота | 7.6 – 9.2 |
| Біцине – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Гліцин – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Більшість буферів показують рН-залежність від температури. Це особливо стосується трис-буферів. PKa змінюється з 8.06 при 25 ° С до 8.85 при 0 ° С.
(рН і рКа буфера: рН вимірює концентрацію іонів водню у водному розчині, pKa (= константа дисоціації кислоти) є пов'язаною, але більш конкретною мірою, оскільки вона допомагає передбачити, як молекула буде діяти при певному Значення рН.)
Трізол
Трізол - це хімічний розчин, що використовується для виділення РНК / ДНК / білка під час екстракції гуанідиній тіоціанат-фенол-хлороформ. Використання ультразвукового методу екстракції TRIzol призводить до високої ДНК, РНК та виходу білка з одного зразка, і, таким чином, перевищує інші методи екстракції.
Література / Довідники
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.