Ультразвукова екстракція білків з тканин та клітинних культур
- Екстракція білків є важливим етапом підготовки зразків у протеоміці.
- Білки можна екстрагувати з рослинної та тваринної тканини, дріжджів і мікроорганізмів.
- Ультразвукова обробка є надійним, ефективним методом екстракції білків, що забезпечує високі виходи білків за короткий час екстракції.
Екстракція білків з тканин та клітин
Екстракція білків з тканин та культурованих клітин є важливим етапом підготовки зразків, який виконується під час багатьох біохімічних та аналітичних методик, таких як ELISA, PAGE, вестерн-блоттинг, мас-спектрометрія або очищення білків. Ультразвукове руйнування клітин, лізис та екстракція є точно контрольованою нетермічною технікою для забезпечення високих виходів білків.
Екстракція білків з клітин за допомогою ультразвукового зонда UP200St
- Швидкість
- Високі виходи
- Висока ефективність
- Точний контроль параметрів
- Відтворювані результати
- Лінійна масштабованість
Загальні інструкції щодо ультразвукового лізису та екстракції білків
- Контроль температури: Щоб забезпечити високий вихід білка без термічної денатурації, температура під час екстракції повинна контролюватися. Сучасні ультразвукові гомогенізатори Hielscher – також відомі як ультразвукові дезінтегратори або ультразвукові обробники – є точно контрольованими. Вони постачаються з підключаємим температурним сенсором. У налаштуваннях ультразвукового гомогенізатора можна встановити максимальну температуру. Коли ця максимальна температура досягається, ультразвуковий обробник автоматично зупиняється, доки зразок не охолоне.
- Буфер: Вибір відповідного буфера та правильного об’єму буфера відрізняється залежно від тканини і має бути визначений шляхом тестування методом проб і помилок.
- Ізоляція / очищення: Білкові лізати можуть містити надлишок біомолекул, таких як ДНК або вуглеводи, які можуть бути видалені шляхом преципітації білків (дезоксихолат-трихлороцтова кислота) або обміну буфера.
Чіттапало і Нумхорм (2009) повідомили у своєму дослідженні, що вихід білка збільшився за використання ультразвукової обробки, і що процес ультразвукової гомогенізації та лізису тканин може значно покращити існуючі процеси екстракції – відкриваючи нові комерційні можливості для екстракції.
Ультразвукова чаша CupHorn для одночасної, високоефективної підготовки зразків для ізоляції білків і фрагментації ДНК.
Екстракція білків з тваринної тканини
Для підготовки тканини цілого розміру (наприклад, нирки, серця, легень, м’язів тощо) тканину слід розрізати на дуже маленькі шматочки чистими інструментами, бажано на льоду, і якнайшвидше, щоб запобігти деградації протеазами (наприклад, буфер для лізису, такий як RIPA, або гіпотонічний буфер для лізису, що містить коктейль інгібіторів протеаз і фосфатаз). Після розрізання зразок занурюють у рідкий азот для шокового заморожування. Зразок можна зберігати при -80°C для подальшого використання або тримати на льоду для негайної гомогенізації. Безпосередньо перед ультразвуковою екстракцією крижаний холодний буфер для лізису (з інгібіторами протеаз DTT, лейпептином та апротиніном) швидко додають у пробірку зі зразком (на ~10 мг тканини рекомендується приблизно ~600 μL буфера). На одну пробірку зі зразком рекомендується приблизно 20-60 мг тканини.
Ультразвукову гомогенізацію, лізис та екстракцію проводять за допомогою ультразвукового гомогенізатора, такого як UP100H або UP200Ht, обладнаного мікросонотродом. Тривалість ультразвукової обробки становить 60-90 сек. у режимі ультразвукового циклу з 15 сек. ультразвукової обробки та 10 сек. часу відпочинку. Зразок слід тримати на льоду весь час.
Після ультразвукової гомогенізації / екстракції лізат центрифугують при 27 000g протягом приблизно 20 хв. Після цього збирають супернатант, щоб концентрацію білка можна було визначити за допомогою аналізу білків, такого як аналіз білків Pierce BCA.
Екстракція білків із сироватки крові
Для отримання однорідної суміші сироватки та фосфатного буфера зразок спочатку перемішують на вихровому мікшері перед ультразвуковим руйнуванням клітин. Для ультразвукового руйнування зразок піддають ультразвуковій обробці за допомогою лабораторного ультразвукового гомогенізатора, такого як UP100H, протягом 8 циклів при амплітуді 20%, з циклами по 5 секунд увімкнення та 15 секунд вимкнення. Екстракцію білків здійснюють шляхом ультразвукової обробки в циклічному режимі (імпульсний режим) та розміщенням зразка на льоду, щоб уникнути перегрівання та термічної деградації зразка. Оскільки сироватка містить велику кількість високомолекулярних білків (таких як альбумін, α1-антитрипсин, трансферин, гаптоглобулін, імуноглобулін G та імуноглобулін A), які заважають розділенню низькомолекулярних білків під час ізоелектричного фокусування (IEF), рекомендується видаляти їх із сироватки за допомогою колонки для виснаження.
Екстракція білків із рослинної тканини
Свіжу, м’яку рослинну тканину, наприклад, мох тощо, можна легко зруйнувати, просто помістивши подрібнений зразок матеріалу в буфер для лізису для ультразвукової обробки. Жорстку, дерев’янисту рослинну тканину, таку як насіння, ялинові голки тощо, слід подрібнювати в сухому вигляді. Деякі тверді дерев’янисті рослинні матеріали необхідно заморозити та подрібнити в рідкому азоті перед екстракцією за допомогою ультразвукової обробки. Для суспензій культур рослинних клітин ультразвукова обробка тривалістю від 30 до 150 секунд у буфері для лізису зазвичай є достатньою. Більш жорсткі матеріали, такі як насіння гарбуза, потребують більш інтенсивної ультразвукової обробки, як описано нижче.
Протокол ультразвукової екстракції альбуміну з насіння гарбуза
Для ультразвукової екстракції білків альбуміну з тонко подрібненого порошку насіння гарбуза у скляну хімічну склянку об’ємом 250mL додають 10 г знежиреного порошку насіння гарбуза та 100 mL деіонізованої води як розчинника. Екстракція білків складається з двох етапів: спочатку зразок піддають ультразвуковій обробці за допомогою ультразвукового гомогенізатора зондового типу UP400St (400W, 24kHz), оснащеного сонотродом S24d7. Скляну хімічну склянку поміщають у ванну з холодною водою під час ультразвукової гомогенізації. Знімний датчик температури та налаштування контролю температури ультразвукового гомогенізатора UP400St забезпечують постійне підтримання температури зразка нижче 30°C. Завдяки точному контролю температури під час ультразвукової обробки вдається уникнути денатурації альбуміну. По-друге, екстракцію проводили за допомогою мікшера зі швидкістю 200 rpm при 30°C. Після цього склянку переносять у термостатичний шейкер. Глобулін видаляють шляхом діалізу проти дистильованої води. Після видалення глобуліну екстракт білка можна відібрати для визначення профілю альбуміну, а потім його коригують до pI=3,0 за допомогою 0,1 M HCl для коагуляції альбуміну. Тверду фазу відділяють центрифугуванням при 5000g, 20°C та повторно розчиняють у деіонізованій воді. Коагуляцію альбуміну проводять двічі для збільшення частки білка в концентраті альбуміну.
Ультразвукова лужна екстракція білків для приготування білкового концентрату з рисових висівок показує, що ультразвукова обробка призводить до вищого виходу білка за значно коротший час екстракції – порівняно з традиційними методами екстракції.
Протокол підготовки зразка для функціонального ферменту iNOS
Щоб отримати повністю функціональний фермент iNOS (наприклад, для скринінгу ліків), рекомендується наступний протокол: суспензію клітин слід помістити на лід та піддати ультразвуковій обробці за допомогою UP100H при амплітуді 10µm у циклічному режимі: 5 sec. ультразвукової обробки та 25 sec. відпочинку на льоду. Процедуру слід повторити приблизно 3 рази. Час відпочинку між циклами ультразвукової обробки зменшує підвищення температури і, отже, знижує ризик денатурації.
Ультразвукове розчинення білків
Ультразвукова обробка може прискорити процес розчинення білків, який зазвичай потребує кількох годин. Щоб не перегріти зразок та запобігти деградації та модифікаціям білків у розчинах, що містять сечовину, тривалість ультразвукових імпульсів не повинна перевищувати кілька секунд.
Ультразвуковий гомогенізатор UP200Ht з мікротипом S26d2 2mm для ультразвукової обробки малих зразків.
Ультразвукове обладнання для екстракції білків
Hielscher Ultrasonics пропонує широкий спектр ультразвукових гомогенізаторів для руйнування клітин, тканин, бактерій, мікроорганізмів, дріжджів та спор.
Лабораторні ультразвукові апарати Hielscher є потужними та простими в експлуатації. Розроблені для роботи 24/7, вони є надійними та ефективними лабораторними та настільними пристроями. Для всіх пристроїв вихідна енергія та амплітуда можуть точно контролюватися. Широкий спектр аксесуарів відкриває додаткові можливості налаштування. Цифрові ультразвукові апарати, такі як VialTweeter, UP200Ht, UP200St та UP400St, мають інтегрований контроль температури та вбудовану SD-карту для автоматичного запису даних.
Для непрямої, без перехресного забруднення та одночасної ультразвукової обробки кількох зразків ми пропонуємо VialTweeter або ультразвуковий CupHorn.
Наведена нижче таблиця дає огляд наших ультразвукових апаратів для підготовки зразків, руйнування клітин та екстракції. Натисніть на тип пристрою, щоб отримати більше інформації про кожен ультразвуковий гомогенізатор. Наші добре підготовлені технічні співробітники з багаторічним досвідом будуть раді допомогти вам вибрати найбільш підходящий ультразвуковий апарат для підготовки ваших зразків!
| Об’єм партії | Об’ємна витрата | Рекомендовані пристрої |
|---|---|---|
| до 10 флаконів або пробірок | n.a. | VialTweeter |
| багатолункові / мікротитраційні планшети | n.a. | UIP400MTP |
| кілька пробірок / посудин | n.a. | CupHorn |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–1000mL | 20–200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP400St |
Залежно від вашого застосування, матеріалу та об’єму зразка, ми порекомендуємо вам найбільш підходящу конфігурацію для підготовки зразка. Зв’яжіться з нами сьогодні!
Зв’яжіться з нами! / Запитайте нас!
Цифрові ультразвукові апарати Hielscher мають дистанційне керування через браузер та автоматичне протоколювання даних на інтегрованій SD-карті.
VialTweeter для непрямої ультразвукової обробки.
Факти, які варто знати
Протеоміка
Протеоміка – це наукова галузь, яка досліджує білки та протеом. Білки виконують величезну кількість життєво важливих функцій в організмах. Протеом – це повний набір білків, експресованих геномом, клітиною, тканиною або організмом у певний час. Протеом змінюється з часом та залежно від різних потреб або стресів, яким піддається клітина або організм. Більш конкретно, це набір експресованих білків у даному типі клітини або організму, у даний час, за визначених умов. Термін є поєднанням слів «білки» та «геном». Протеоміка – це вивчення протеому.
Білок
Білки – це великі біомолекули, так звані макромолекули, які складаються з одного або кількох довгих ланцюгів залишків амінокислот. Білки присутні в усіх організмах рослинного та тваринного походження і вони є вирішальними для більшості біологічних функцій. Оскільки білки містять багато біологічної інформації, їх екстрагують для аналітичних цілей, наприклад, для протеомних досліджень. Найважливіші функції, які виконують білки, включають каталіз метаболічних реакцій, реплікацію ДНК, реакцію на стимули та транспорт молекул з однієї локації в іншу. Білки відрізняються один від одного переважно послідовністю амінокислот, яка визначається нуклеотидною послідовністю їхніх генів, і яка зазвичай призводить до фолдингу білка у специфічну тривимірну структуру, що визначає його активність. Білки – окрім пептидів – є одним із ключових компонентів їжі. Тому протеоміка є потужним інструментом у харчовій науці для оптимізації процесів, безпеки харчових продуктів та оцінки харчування.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction є преаналітичною процедурою для розділення та попереднього концентрування аналітів. У поєднанні з ультразвуковою обробкою екстракція з хмарною точкою може бути інтенсифікована, що робить процес більш ефективним, швидшим та екологічнішим. Завдяки ультразвуковій обробці екстракція з хмарною точкою є значно більш ефективним методом підготовки аналітів. Дізнайтеся більше про ультразвукову екстракцію з хмарною точкою!
Гель-електрофорез
Гель-електрофорез є основним методом розділення та аналізу макромолекул, таких як ДНК, РНК та білки, а також їхніх фрагментів, на основі їхнього розміру та заряду. Його використовують у клінічній хімії для розділення білків за зарядом та/або розміром (ІЕФ агароза, фактично незалежна від розміру) та у біохімії, молекулярній біології та протеоміці для розділення змішаної популяції фрагментів ДНК та РНК за довжиною, для оцінки розміру фрагментів ДНК та РНК або для розділення білків за зарядом.
Клітинні культури
Клітинна культура – це контрольований процес вирощування, за допомогою якого клітини культивують у контрольованих умовах. Умови клітинної культури відрізняються для кожного типу клітин. Загалом середовище клітинної культури складається з відповідної ємності (наприклад, чашки Петрі) із субстратом або середовищем, що постачає необхідні поживні речовини (амінокислоти, вуглеводи, вітаміни, мінерали), фактори росту, гормони та гази (CO2, O2), і регулює фізико-хімічне середовище (pH-буфер, осмотичний тиск, температура). Більшості клітин потрібна поверхня або штучний субстрат, тоді як інші клітинні культури можна культивувати вільно плаваючими в культуральному середовищі (суспензійна культура, клітинна суспензія).
Масові культури ліній тваринних клітин використовуються в промисловому виробництві вірусних вакцин та інших продуктів, отриманих за допомогою біотехнологій. Стволові клітини людини культивують для збільшення кількості клітин та диференціації клітин у різні соматичні типи клітин для цілей трансплантації.
Зразки тканин
Термін «тканина» описує клітинний проміжний рівень, де клітинний матеріал перебуває на організаційному рівні між клітинами та цілим органом. У тканині зібрані подібні клітини, що мають спільне походження та разом виконують специфічну функцію. Завдяки функціональному групуванню кількох тканин утворюються складні структури органів.
Тканини відбирають для досліджень у біології, гістології/гістопатології, паразитології, біохімії, імуногістохімії, а також для культивування та екстракції ДНК. Розрізняють тваринні (підрозділ: тканина ссавців) та рослинні тканини. Тваринні тканини групують у чотири основні типи: сполучну, м’язову, нервову та епітеліальну тканини. Рослинні тканини поділяються на наступні три тканинні системи: епідерміс, основна тканина та судинна тканина.
Зразки тканин можна готувати з частин тварин або рослин, наприклад, кісток, м’язів, листя тощо.
Тілесні рідини
Кров, сироватка, плазма, спинномозкова рідина, слина та синовіальна рідина є тілесними рідинами, які пропонують велике джерело діагностично релевантної інформації. Тому складна підготовка зразків тілесних рідин для аналізу є важливою. Перша складність пов’язана з широким динамічним діапазоном компонентів, присутніх у тілесних рідинах.
Визначення концентрації білка
Аналіз за Бредфордом, аналіз за Лоурі та аналіз із біцинхоніновою кислотою (BCA) є поширеними аналізами для визначення концентрації білків. Бичачий сироватковий альбумін (BSA) є одним із найбільш часто використовуваних білкових стандартів.
Буфер для лізису
Буфер для лізису слід обирати відповідно до клітинного матеріалу або тканини (культура тканин, рослини, бактерії, гриби тощо), а також залежно від того, чи перебувають клітини в структурі, та від типу структури. Широкий спектр буферів для лізису для екстракції білків, мембран та органел сформульовано з одним або кількома детергентами. Детергент зазвичай обирають методом проб і помилок або – якщо доступно – відповідно до існуючого протоколу екстракції білків. Детергент має бути сумісним із джерелом тканини та білками. Загалом обирають найм’якший детергент, який працює для конкретної тканини / білка, щоб зберегти максимальну функціональність екстракту. Крім того, у разі екстракції мембран та органел м’який детергент зберігає мембрану цілісною. Зазвичай використовувані детергенти в буферах для лізису є переважно некоіонними або цвіттер-іонними, наприклад CHAPS, дезоксихолат, Triton™ X-100, NP40 та Tween 20.
Наприклад, такі тканини, як мозок, печінка, кишечник, нирки, селезінка тощо, можна просто буферизувати за допомогою RIPA – проте слід включити інгібітори протеаз та DTT (наприклад, для гель-електрофорезу).
Буфер для лізису скелетної м’язової тканини (крижаний): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) гліцерол, 1 mM EDTA, 1 mM дитіотреїтол, доповнений коктейлем інгібіторів протеаз та фосфатаз
Таблиця поширених буферів та їхнього діапазону pH. Загалом ці буфери зазвичай використовують у концентраціях 20-50 mM.
| Буфер | Діапазон pH |
|---|---|
| Лимонна кислота – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Цитрат натрію – лимонна кислота | 3,0 – 6,2 |
| Ацетат натрію – оцтова кислота | 3,6 – 5,6 |
| Натрієва сіль какодилової кислоти – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Дигідрофосфат натрію – гідрофосфат натрію | 5,8 – 8,0 |
| Імідазол – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Гідрохлорид триетаноламіну – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Трицин – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Тетраборат натрію – борна кислота | 7,6 – 9,2 |
| Біцин – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Гліцин – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Більшість буферів демонструють залежність pH від температури. Це особливо стосується буферів Tris. pKa змінюється від 8,06 при 25°C до 8,85 при 0°C.
(pH та pKa буфера: pH вимірює концентрацію іонів водню у водному розчині. pKa (= константа дисоціації кислоти) є спорідненим, але більш специфічним показником, оскільки він допомагає передбачити, як молекула діятиме при конкретному значенні pH.)
TRIzol
TRIzol – це хімічний розчин, що використовується для екстракції РНК/ДНК/білка під час екстракції за допомогою тіоціанату гуанідінію, фенолу та хлороформу. Використання екстракції TRIzol за ультразвукової допомоги призводить до високих виходів ДНК, РНК та білка з того самого зразка і перевищує thereby інші методи екстракції.
Література/Посилання
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.