Hielscher Ultrasonics
Будемо раді обговорити Ваш процес.
Зателефонуйте нам: +49 3328 437-420
Напишіть нам: info@hielscher.com

Ультразвукова екстракція білків з культур тканин і клітин

  • Екстракція білка є важливим етапом підготовки зразків у протеоміці.
  • Білки можуть бути вилучені з рослинних і тваринних тканин, дріжджів і мікроорганізмів.
  • Ультразвук – це надійний, ефективний метод екстракції білка, що дає високі виходи білка за короткий час екстракції.

Екстракція білка з тканин і клітин

Екстракція білка з тканин і культивованих клітин є важливим етапом підготовки зразків, який виконується під час багатьох біохімічних та аналітичних методів, таких як ІФА, ПЕЙДЖ, вестерн-блотінг, мас-спектрометрія або очищення білка. Ультразвукове руйнування, лізис та екстракція клітин є точно контрольованим, нетермічним методом для забезпечення високого виходу білків.

Інформаційний запит




Зверніть увагу на наш Політика конфіденційності.




Ультразвукові апарати зондового типу, такі як UP200St, є надійними гомогенізаторами тканин і широко використовуються для підготовки зразків у генетичних та протеомних дослідженнях.

Екстракція білка з клітин за допомогою ультразвуковий зонд UP200St

Переваги ультразвукового лізису та екстракції білка
 

  • Швидкого
  • високі врожаї,
  • Висока ефективність
  • Точний контроль параметрів
  • Відтворювані результати
  • Лінійна масштабованість

Загальні інструкції з ультразвукового лізису та екстракції білка

  • Контроль температури: Щоб забезпечити високий вихід білка без термічної денатурації, необхідно контролювати температуру під час екстракції. Найсучасніші ультразвукові гомогенізатори Hielscher – Також його називають ультразвуковим дезінтегратором або ультразвуковим апаратом – точно піддаються контролю. Вони поставляються зі штепсельним датчиком температури. У параметрах налаштувань ультразвукового гомогенізатора можна встановити максимальну температуру. При досягненні цієї максимальної температури ультразвуковий датчик автоматично зупиняється, поки зразок не охолоне.
  • Буфер: Вибір відповідного буфера та правильного об'єму буфера варіюється від тканини до тканини і має бути визначений шляхом тестування методом проб і помилок.
  • Ізоляція / очищення: Білкові лізати можуть містити надлишок біомолекул, таких як ДНК або вуглеводи, які можуть бути видалені білковим осадженням (дезоксихолат-трихлороцтова кислота) або буферним обміном.

Chittapalo і Noomhorm (2009) повідомили у своєму дослідженні, що вихід білка збільшується за допомогою ультразвукової гомогенізації тканин і процес лізису може значно покращити існуючі процеси екстракції – Це відкриває нові можливості комерційного видобутку.
 

Ультразвуковий CupHorn для одночасної пробопідготовки декількох зразків в однакових умовах для виділення білка і фрагментації ДНК.

Ультразвуковий CupHorn для одночасної, високоефективної підготовки зразків декількох зразків в однакових умовах для виділення білка і фрагментації ДНК.

Екстракція білка з тканин тварин

Ультразвуковий апарат UP100H – це лабораторний гомогенізатор, який часто використовується для підготовки зразків планшетів клітинних культур.Для приготування цілісної тканини (наприклад, нирок, серця, легенів, м'язів тощо) тканину слід розсікати на дуже маленькі шматочки за допомогою чистих інструментів, бажано на льоду, і якомога швидше, щоб запобігти деградації протеазами (наприклад, буфер лізису, такий як RIPA або гіпотонічний буфер лізису, що містить протеазу та коктейль інгібіторів фосфатази). Після препарування зразок занурюють в рідкий азот для миттєвого заморожування. Зразок можна зберігати при температурі -80 °C для подальшого використання або зберігати на льоду для негайної гомогенізації. Безпосередньо перед ультразвуковою екстракцією в пробірку для зразка швидко додають буфер крижаного лізису (з інгібіторами протеази DTT, леупептином і апротиніном) (рекомендується на ~10 мг тканини приблизно ~600 мкл буфера). На пробірку для зразка рекомендується приблизно 20-60 мг тканини.
Ультразвукова гомогенізація, лізис та екстракція проводиться за допомогою ультразвукового гомогенізатора, такого як UP100H або UP200Ht, оснащеного сонотродом з мікронаконечником. Тривалість ультразвукового апарату становить 60-90 сек при режимі ультразвукового циклу 15 сек. УЗД і 10 сек. Зразок весь час повинен знаходитися в льоду.
Після ультразвукової гомогенізації / екстракції лізат центрифугується при 27 000 г протягом приблизно 20 хв. Після цього супернатент збирають, щоб концентрацію білка можна було визначити за допомогою білкового аналізу, такого як аналіз білка Пірса BCA.

Екстракція білка з сироватки крові

Для отримання однорідної суміші сироватки та фосфатного буфера зразок спочатку вихрщують перед ультразвуковим лізисом клітин. Для ультразвукового лізису зразок ультразвукується за допомогою ультразвукового лабораторного гомогенізатора, такого як UP100H, протягом 8 циклів з амплітудою 20%, для циклів кожні 5 секунд увімкнення та 15 секунд вимкнення. Екстракція білка здійснюється шляхом ультразвукового дослідження в циклах (режим пульсації) і шляхом розміщення зразка на льоду, щоб уникнути перегріву і термічної деградації зразка. Оскільки сироватка крові містить велику кількість високомолекулярних білків (таких як альбумін, α1-антитрипсин, трансферин, гаптоглобулін, імуноглобулін G та імуноглобулін А), які перешкоджають виділенню низькомолекулярних білків під час ІЕФ, рекомендується виснажувати їх із сироватки крові за допомогою колонки виснаження.

Екстракція білка з рослинної тканини

Свіжі м'які тканини рослин, наприклад, мох тощо, можна легко порушити, просто помістивши подрібнений матеріал для зразків у лізисний буфер для ультразвукового дослідження. Жорсткі, лігенні тканини рослин, такі як насіння, хвоя ялиці тощо, слід подрібнювати в сухому стані. Деякі тверді деревні рослинні матеріали повинні бути заморожені та подрібнені в рідкому азоті перед екстрагуванням за допомогою ультразвуку. Для суспензій культур рослинних клітин в основному достатньо ультразвукової обробки від 30 до 150 секунд у лізисному буфері. Більш жорсткий матеріал, такий як гарбузове насіння, вимагає більш інтенсивного ультразвуку, як описано нижче.
 

У цьому посібнику пояснюється, який тип ультразвукового апарату найкраще підходить для ваших завдань з підготовки зразків, таких як лізис, руйнування клітин, виділення білків, фрагментація ДНК та РНК у лабораторіях, аналіз та дослідження. Виберіть ідеальний тип звукового апарату для вашого застосування, обсяг зразка, номер зразка та пропускну здатність. Hielscher Ultrasonics має ідеальний ультразвуковий гомогенізатор для вас!

Як знайти ідеальний ультразвуковий засіб для руйнування клітин та екстракції білка в науці та аналізі

Мініатюра відео

 

Протокол ультразвукової екстракції альбуміну з насіння гарбуза

Ультразвуковий тканинний гомогенізатор UP400St з S24d40 - для екстракції білка з рослинних і тваринних тканин (Натисніть для збільшення!)Для ультразвукової білкової екстракції альбуміну з порошку насіння гарбуза дрібного помелу в скляну скляну склянку об'ємом 250 мл додають 10 г знежиреного порошку насіння гарбуза та 100 мл деіонізованої води як розчинник. Екстракція білка складається з двох етапів: Спочатку зразок піддається ультразвуковому дослідженню за допомогою зондовий ультразвуковий апарат UP400St (400 Вт, 24 кГц), оснащений сонотродом S24d7. Скляну мензурку поміщають у ванну з холодною водою під час ультразвукової гомогенізації. Вставний датчик температури та налаштування контролю температури ультразвукового апарату UP400St гарантують, що температура зразка завжди залишається нижчою за 30°C. Завдяки точному контролю температури під час ультразвукового дослідження можна уникнути денатурації альбуміну. По-друге, екстракція проводилася міксером зі швидкістю 200 об/хв і при 30°С. Після цього мензурку переносять в термостатичний шейкер. Глобулін видаляється за допомогою діалізу з дистильованою водою. Після видалення глобуліну екстракт білка може бути взятий для визначення профілю альбуміну і згодом коригується до рІ = 3,0 за допомогою 0,1 М HCl для згортання альбуміну. Тверду фазу відокремлюють центрифугуванням при 5000 г, 20 ° С і повторно розчиняють в деіонізованій воді. Коагуляцію альбуміну проводять двічі для збільшення співвідношення білків в альбуміновому концентраті.

Ультразвукова екстракція лужного білка для приготування білкового концентрату з рисових висівок показує, що ультразвукова обробка призводить до більш високого виходу білка при значно коротшому часі екстракції – в порівнянні з традиційними методами екстракції.

У цьому відеоролику показаний ультразвуковий гомогенізатор Hielscher UP100H, ультразвуковий апарат, який широко використовується для підготовки зразків у лабораторіях.

Ультразвуковий гомогенізатор UP100H

Мініатюра відео

Протокол підготовки зразків функціонального ферменту iNOS

Для отримання повністю функціонального ферменту iNOS (наприклад, для скринінгу лікарських засобів) рекомендується використовувати наступний протокол: суспензію клітини слід помістити на лід і провести ультразвукову діагностику за допомогою UP100H з амплітудою 10 мкм в режимі циклу 5 сек. ультразвукове дослідження і 25 сек. відпочинок на льоду. Процедуру слід повторити приблизно 3 рази. Час відпочинку між циклами ультразвуку зменшує підвищення температури і, отже, знижує ризик денатурації.

ультразвукова солюбілізація білка

Ультразвукове дослідження може прискорити процес розчинення білка, який зазвичай займає кілька годин. Щоб не перегрівати зразок і не допустити розпаду білка і модифікації в розчинах, що містять сечовину, ультразвукові сплески не повинні тривати довше декількох секунд.

VialTweeter - це унікальна ультразвукова система для одночасного ультразвукового дослідження до 10 флаконів в абсолютно однакових умовах без перехресного забруднення.

UP200St з VialTweeter для ультразвукового випромінювання закритих флаконів

Мініатюра відео

Ультразвуковий апарат UP200Ht з мікронаконечником S26d2 для ультразвукового лізису біологічних зразків

Ультразвуковий апарат UP200Ht з 2мм мікронаконечником S26d2 для ультразвукового дослідження невеликих зразків.

Ультразвукове обладнання для екстракції білка

Hielscher Ultrasonics пропонує широкий асортимент ультразвукових гомогенізаторів для розпаду клітин, тканин, бактерій, мікроорганізмів, дріжджів і спор.
Лабораторні ультразвукові апарати Hielscher потужні та прості в експлуатації. Створені для роботи 24/7, вони розроблені як надійні та ефективні лабораторні та настільні пристрої. Для всіх пристроїв можна точно регулювати вихідну енергію та амплітуду. Широкий асортимент аксесуарів відкриває додаткові можливості для налаштування. Цифрові ультразвукові апарати, такі як VialTweeter, UP200Ht, UP200St, UP400St, мають вбудований контроль температури та вбудовану SD-карту для автоматичного запису даних.
Для непрямого, без перехресного забруднення та одночасного ультразвукового дослідження кількох зразків ми пропонуємо VialTweeter або ультразвуковий CupHorn.
Наведена нижче таблиця містить огляд наших ультразвукових засобів для підготовки зразків, руйнування та екстракції клітин. Натисніть на тип пристрою, щоб отримати більше інформації про кожен ультразвуковий гомогенізатор. Наш добре навчений і багаторічний технічний персонал буде радий допомогти Вам у виборі найбільш підходящого ультразвукового апарату для Вашої пробопідготовки!
 

Об'єм партії Витрата Рекомендовані пристрої
до 10 флаконів або туб Н.А. VialTweeter
Планшети Multiwell / Microtiter Н.А. UIP400MTP
кілька трубок / судин Н.А. Кугорн
Від 1 до 500 мл Від 10 до 200 мл/хв UP100H
Від 10 до 1000 мл Від 20 до 200 мл/хв UP200Ht, UP200St
Від 10 до 2000 мл Від 20 до 400 мл/хв UP400St

Залежно від вашого застосування, матеріалу та обсягу зразка, ми порекомендуємо вам найбільш підходящу установку для підготовки зразка. Зв'яжіться з нами сьогодні!

Зв'яжіться з нами! / Запитайте нас!

Запитайте більше інформації

Будь ласка, скористайтеся формою нижче, щоб отримати додаткову інформацію про ультразвукові гомогенізатори, застосування в біотехнологіях та протеоміці, а також ціни. Ми будемо раді обговорити з вами процес руйнування клітин і вилучення білка і запропонувати вам ультразвуковий апарат, що відповідає вашим вимогам!









Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.




 

На відео показана ультразвукова система підготовки зразків UIP400MTP, яка дозволяє проводити надійну пробопідготовку будь-яких стандартних багатолункових пластин за допомогою ультразвуку високої інтенсивності. Типові застосування UIP400MTP включають лізис клітин, зріз ДНК, РНК і хроматину, а також екстракцію білків.

Ультразвуковий UIP400MTP для багатолункового пластинчастого УЗД

Мініатюра відео

Ультразвуковими пристроями Hielscher можна дистанційно керувати за допомогою браузера. Параметри ультразвуку можна контролювати та точно регулювати відповідно до вимог процесу.

Цифрові ультразвукові апарати Hielscher оснащені пультом дистанційного керування браузером і автоматичним протоколюванням даних на вбудованій SD-карті.

Ультразвуковий апарат VialTweeter для вилучення білка зі зразків тканин (Натисніть для збільшення!)

VialTweeter при непрямому ультразвуковому дослідженні.



Факти, які варто знати

протеоміка

Протеоміка - це область досліджень, яка досліджує білки і протеом. Білки виконують широкий спектр життєво важливих функцій організмів. Протеом - це весь набір білків, що експресуються геномом, клітиною, тканиною або організмом в певний час. Протеом змінюється в залежності від часу і чітких вимог, або стресів, які зазнає клітина або організм. Точніше, це сукупність експресованих білків у певному типі клітин або організмів у певний час, за певних умов. Цей термін є сумішшю білків і геному. Протеоміка – це наука про протеом.

Білка

Білки являють собою великі біомолекули, так звані макромолекули – які складаються з одного або декількох довгих ланцюгів амінокислотних залишків. Білки присутні у всіх організмах як рослинного, так і тваринного походження, і вони мають вирішальне значення для більшості біологічних функцій. Оскільки білки містять багато біологічної інформації, їх витягують з аналітичною метою, наприклад, для протеомних досліджень. Найважливіші функції, які виконують білки, включають каталіз метаболічних реакцій, реплікацію ДНК, реакцію на подразники та транспортування молекул з одного місця в інше. Білки відрізняються один від одного в першу чергу своєю послідовністю амінокислот, яка диктується нуклеотидною послідовністю їх генів, і що зазвичай призводить до згортання білка в специфічну тривимірну структуру, що визначає його активність. Білки бувають – крім пептидів – один з ключових компонентів їжі. Таким чином, протеоміка є потужним інструментом у харчовій науці для оптимізації процесів, безпеки харчових продуктів та оцінки харчування.

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction – це попередня аналітична процедура для відділення та попереднього концетитації аналітів. У поєднанні з ультразвуковим випромінюванням можна посилити екстракцію хмарних точок, зробивши процес ефективнішим, швидшим і безпечнішим для навколишнього середовища. За допомогою ультразвуку екстракція точки хмари є значно ефективнішим методом приготування аналіту. Дізнайтеся більше про екстракцію хмарних точок за допомогою ультразвуку!

Гель-електрофорез

Гель-електрофорез є основним методом поділу та аналізу макромолекул, таких як ДНК, РНК та білки, а також їх фрагментів на основі їх розміру та заряду. Він використовується в клінічній хімії для поділу білків за зарядом та/або розміром (IEF agarose, по суті, не залежить від розміру), а в біохімії, молекулярній біології та протеоміці для поділу змішаної популяції фрагментів ДНК та РНК за довжиною, для оцінки розміру ДНК та фрагментів РНК або для поділу білків за зарядом.

Культури клітин

Культура клітин – це контрольований процес вирощування, за допомогою якого клітини культивуються в контрольованих умовах. Умови культивування клітин відрізняються для кожного типу клітин. Як правило, середовище клітинної культури складається з відповідної посудини (наприклад, чашки Петрі) з субстратом або середовищем, яке постачає необхідні поживні речовини (амінокислоти, вуглеводи, вітаміни, мінерали), фактори росту, гормони та гази (СО)2, О2), і регулює фізико-хімічне середовище (буфер рН, осмотичний тиск, температура). Більшість клітин потребують поверхневого або штучного субстрату, тоді як інші клітинні культури можна культивувати у вільному плаванні в живильному середовищі (суспензія, клітинна суспензія).
Масові культури клітинних ліній тварин використовуються в промисловому виробництві вірусних вакцин та інших продуктів біотехнологічного походження. Стовбурові клітини людини культивуються для розширення кількості клітин і диференціації клітин у різні типи соматичних клітин з метою трансплантації.

Зразки тканин

Термін «тканина» описує клітинний проміжний продукт, коли клітинний матеріал знаходиться на організаційному рівні між клітинами та цілим органом. У тканині збираються подібні клітини, одного походження, які разом виконують певну функцію. Шляхом функціонального угруповання множинних тканин утворюються складні структури органів.
Тканину відбирають для досліджень у галузі біології, гістології/гістопатології, паразитології, біохімії, імуногістохімії, а також для культивування та вилучення ДНК. Розрізняють тваринну (підрозділ: тканина ссавців) і рослинну тканину. Тканини тварин об'єднані в чотири основних типи сполучної, м'язової, нервової та епітеліальної тканини. Рослинна тканина підрозділяється на такі три тканинні системи: епідерміс, наземну тканину і судинну тканину.
Зразки тканин можуть бути виготовлені з частин тварин або рослин, наприклад, кісток, м'язів, листя тощо.

Біологічні рідини

Кров, сироватка, плазма, спинномозкова рідина, слина та синовіальна рідина – це біологічні рідини, які є чудовим джерелом діагностично значущої інформації. Тому важлива складна підготовка зразків біологічних рідин для аналізу. Перша складність пов'язана з широким динамічним діапазоном компонентів, присутніх в рідинах організму.

Визначення концентрації білка

Бредфордський аналіз, аналіз Лоурі та аналіз біцинхонінової кислоти (BCA) є поширеними аналізами для визначення концентрації білків. Бичачий сироватковий альбумін (BSA) є одним з найбільш часто використовуваних білкових стандартів.

лізис-буфер

Буфер для лізису необхідно вибирати відповідно до клітинного матеріалу або тканини (культура тканин, рослина, бактерії, гриби тощо), а також від того, чи знаходяться клітини в структурі та типу структури. Широкий спектр лізисних буферів для екстракції білків, мембран і органел складається з одного або декількох детергентних засобів. Миючий засіб зазвичай вибирається шляхом проб і помилок або – За наявності – відповідно до існуючого протоколу екстракції білка. Миючий засіб повинен бути сумісний з джерелом тканини та білками. Взагалі, найбільш м'який миючий засіб, який працює на конкретну тканину / білок, вибирають для того, щоб зберегти максимальну функціональність екстракту. Крім того, у разі екстракції мембран і органел м'який миючий засіб зберігає мембрану в цілості. Зазвичай використовувані миючі засоби в лізисних буферах в основному неіоногенні або цвіттеріонні, наприклад, CHAPS, дезоксихолат, Triton™ X-100, NP40 і Tween 20.
Наприклад, такі тканини, як мозок, печінка, кишечник, нирки, селезінка тощо, можуть бути просто буферизовані RIPA – однак слід включати інгібітори протеази та ДТЧ (наприклад, для гелевого електрофорезу).
Лізисний буфер для скелетної м'язової тканини (крижаний холод): 20 мМ Tris (рН 7,8), 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (ж/об) гліцерину, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ дітіотреїтолу з додаванням коктейлю з інгібітором протеази та фосфатази
Таблиця поширених буферів і діапазон їх рН. Загалом ці буфери зазвичай використовуються при концентраціях 20-50 мМ.
 

буфер Діапазон рН
Лимонна кислота – NaOH 2.2 – 6.5
Цитрат натрію – Лимонна кислота 3.0 – 6.2
Ацетат натрію – оцтова кислота 3.6 – 5.6
Натрієва сіль какодилової кислоти – HCl 5.0 – 7.4
МОН – NaOH 5.6 – 6.8
Натрію дигідрофосфат – динатрію гідрофосфат 5.8 – 8.0
імідазол – HCl 6.2 – 7.8
ШВАБРИ – КОХ 6.6 – 7.8
Триетаноламіну гідрохлорид – NaOH 6.8 – 8.8
Трис – HCl 7.0 – 9.0
ГЕПЕС – NaOH 7.2 – 8.2
Трічіні – NaOH 7.6 – 8.6
Натрію тетраборат – борна кислота 7.6 – 9.2
Біцин – NaOH 7.7 – 8.9
гліцин – NaOH 8.6 – 10.6

Більшість буферів демонструють залежність рН від температури. Особливо це стосується буферів Tris. рКа змінюється від 8,06 при 25 ° С до 8,85 при 0 ° С.
(pH і pKa буфера: pH вимірює концентрацію іонів водню у водному розчині. pKa (= постійна дисоціації кислоти) є спорідненим, але більш специфічним показником, оскільки він допомагає передбачити, як молекула буде діяти при певному значенні рН.)

ТРИзол

ТРИзол – це хімічний розчин, який використовується для екстракції РНК/ДНК/білка під час екстракції тіоціанату гуанідинію-фенолу-хлороформу. Використання ультразвукової екстракції TRIzol призводить до високих виходів ДНК, РНК і білків з одного зразка і тим самим перевершує інші методи екстракції.

Література/Список літератури

Будемо раді обговорити Ваш процес.

Let's get in contact.