Ультразвуковий лізис біоінженерних клітин у промисловому виробництві

Біоінженерні види бактерій, такі як кишкова паличка, а також генетично модифіковані типи клітин ссавців і рослин широко використовуються в біотехнології для експресії молекул. Для того, щоб вивільнити ці синтезовані біомолекули, потрібна надійна техніка руйнування клітин. Високоефективне ультразвукове дослідження є перевіреним методом ефективного та надійного лізису клітин – легко масштабується до великих пропускних здатностей. Hielscher Ultrasonics пропонує вам високопродуктивне ультразвукове обладнання для ефективного лізису клітин з метою виробництва великих обсягів високоякісних біомолекул.

Екстракція молекул з клітинних фабрик

Для виробництва широкого спектру біомолекул як фабрики мікробних клітин можуть використовуватися різні інженерні мікроби та рослинні клітини, включаючи Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, ціанобактерії, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica, Nicotiana benthamiana та водорості, серед багатьох інших. Ці клітинні фабрики можуть виробляти білки, ліпіди, біохімікати, полімери, біопаливо та олеохімічні речовини, які використовуються як їжа або сировина для промислового застосування. Клітини, що використовуються як фабрики клітин, культивуються в закритих біореакторах, де вони можуть досягти високої ефективності, специфічності та низьких потреб в енергії.
Щоб виділити цільові молекули з біоінженерних клітинних культур, клітини необхідно порушити, щоб внутрішньоклітинний матеріал вивільнився. Ультразвукові руйнівники клітин добре зарекомендували себе як високонадійна та ефективна техніка для розпаду клітин і вивільнення сполук.

Фабрики мікробних клітин – це метаболічно модифіковані клітини, які використовуються для синтезу різних цінних сполук. Ультразвукове руйнування клітин є ефективним і надійним методом вивільнення цінних сполук із внутрішньої частини клітини.
©– Вільяверде, 2010.

Переваги ультразвукових руйнівників клітин

Як нетермічна, м'яка, але високоефективна технологія, ультразвукові руйнівники використовуються в лабораторіях і промисловості для лізування клітин і виробництва високоякісних екстрактів, наприклад, використовуються для виділення молекул з клітинних фабрик.

Power-ультразвук для ефективного руйнування фабрик мікробних клітин

Механізм та ефекти ультразвукових руйнівників клітин:
Для руйнування ультразвукових клітин використовується сила ультразвукових хвиль. Ультразвуковий гомогенізатор / руйнівник клітин оснащений зондом (він же сонотроде), виготовленим з титанового сплаву, який коливається з високою частотою приблизно 20 кГц. Це означає, що ультразвуковий зонд поєднує 20 000 коливань на секунду з ультразвуковою рідиною. Ультразвукові хвилі, пов'язані з рідиною, характеризуються чергуванням циклів високого / низького тиску. Під час циклу низького тиску рідина розширюється і виникають дрібні бульбашки вакууму. Ці дуже маленькі бульбашки ростуть протягом декількох циклів тиску, що чергуються, поки не зможуть поглинути подальшу енергію. У цей момент кавітаційні бульбашки сильно вибухають і створюють локально надзвичайне енергетично щільне середовище. Це явище відоме як акустична кавітація і характеризується локально дуже високими температурами, дуже високим тиском і силами зсуву. Ці напруги зсуву ефективно руйнують клітинні стінки і збільшують масообмін між внутрішньою частиною клітини і навколишнім розчинником. Як чисто механічна техніка, широко використовуються ультразвукові зсувні сили і рекомендована процедура при руйнуванні бактеріальних клітин, а також при виділенні білка. Як простий і швидкий метод руйнування клітин, ультразвукова діагностика ідеально підходить для виділення малих, середніх і великих обсягів. Цифрові ультразвукові апарати Hielscher оснащені зрозумілим меню налаштувань для точного контролю ультразвуку. Всі дані ультразвуку автоматично зберігаються на вбудованій SD-карті і знаходяться в легкому доступі. Складні варіанти розсіювання тепла, такі як зовнішнє охолодження, ультразвукове випромінювання в режимі пульсу і т.д. в процесі ультразвукового розпаду, забезпечують підтримання ідеальної температури процесу і, тим самим, неушкодженість екстрагованих термочутливих сполук.

Дослідження підкреслюють сильні сторони ультразвукового руйнування та екстракції клітин

Prof. Chemat et al. (2017) у своєму дослідженні підсумовують, що «екстракція за допомогою ультразвуку є зеленою та економічно вигідною альтернативою традиційним методам для їжі та природних продуктів. Основними перевагами є зменшення часу екстракції та обробки, кількості використовуваної енергії та розчинників, роботи агрегату та CO₂ викидів».
Gabig-Ciminska et al. (2014) у своєму дослідженні використовували гомогенізатор високого тиску та ультразвуковий клітинний дсінтегратор для лізису спор з метою вивільнення ДНК. Порівнюючи обидва методи руйнування клітин, дослідницька група приходить до висновку, що щодо лізису клітин для спорової ДНК, «аналіз був проведений з використанням клітинних лізатів з гомогенізації високого тиску. Згодом ми зрозуміли, що руйнування ультразвукових клітин має видатні переваги для цієї мети. Він досить швидкий і може бути оброблений для невеликих обсягів зразків». (Габіг-Цімінська та ін., 2014)

Біомолекули з клітинних фабрик для виробництва продуктів харчування

Фабрики мікробних клітин — це життєздатна та ефективна методологія виробництва з використанням мікробних організмів для отримання високих врожаїв нативних та ненативних метаболітів шляхом метаболічної біоінженерії мікробних мікроорганізмів, таких як бактерії, дріжджі, гриби тощо. Об'ємні ферменти, наприклад, виробляються за допомогою мікроорганізмів, таких як Aspergillus oryzae, грибів і бактерій. Ці сипучі ферменти використовуються для виробництва продуктів харчування та напоїв, а також у сільському господарстві, біоенергетиці та побутовій техніці.
Деякі бактерії, такі як Acetobacter xylinum і Gluconacetobacter xylinus, виробляють целюлозу в процесі ферментації, де нановолокна синтезуються в процесі «знизу-вгору». Бактеріальна целюлоза (також відома як мікробна целюлоза) хімічно еквівалентна рослинній целюлозі, але вона має високий ступінь кристалічності та високої чистоти (не містить лігніну, геміцелюлози, пектину та інших біогенних компонентів), а також унікальну структуру тривимірної (3D) сітчастої мережі з нановолокна целюлози. (пор. Чжун, 2020) У порівнянні з целюлозою рослинного походження, бактеріальна целюлоза є більш стійкою, а вироблена целюлоза є чистою і не вимагає складних етапів очищення. Ультразвук і екстракція розчинником за допомогою NaOH або SDS (додецилсульфат натрію) дуже ефективні для виділення бактеріальної целюлози з бактеріальних клітин.

Біомолекули з клітинних заводів для фармацевтичного та вакцинного виробництва

Одним з найвідоміших фармацевтичних продуктів, отриманих на клітинних фабриках, є людський інсулін. Для біоінженерного виробництва інсуліну використовують переважно кишкову паличку і Saccharomyces cerevisiae. Оскільки біосинтезовані нанорозмірні молекули забезпечують високу біосумісність, біологічні наночастинки, такі як феритин, є вигідними для численних застосувань у біовиробництві. Крім того, продукція у метаболічно модифікованих мікробів часто значно ефективніша в отриманих виходах. Наприклад, виробництво артемізинової кислоти, ресвератролу і лікопіну зросло в десятки разів до декількох сотень разів, і вже налагоджено або знаходиться в стадії розвитку промислового масштабу. (пор. Лю та ін.; Мікроб. Факт про клітину. 2017)
Наприклад, нанорозмірні біомолекули на основі білків з властивостями самозбірки, такі як феритин і вірусоподібні частинки, особливо цікаві для розробки вакцин, оскільки вони імітують як розмір, так і структуру патогенів і піддаються поверхневій кон'югації антигенів, що сприяє взаємодії з імунними клітинами. Такі молекули експресуються в так званих фабриках клітин (наприклад, інженерні штами E. coli), які виробляють певну молекулу-мішень.

Протокол ультразвукового лізису та кишкової палички BL21 для вивільнення феритину

Феритин – це білок, основною функцією якого є зберігання заліза. Феритин демонструє багатообіцяючі можливості як самозбірні наночастинки у вакцинах, де він використовується як засіб доставки вакцин (наприклад, спайкові білки SARS-Cov-2). Наукові дослідження Sun та ін. al. (2016) показує, що рекомбінантний феритин може вивільнятися у вигляді розчинної форми з Escherichia coli при низьких концентраціях NaCl (≤50 ммоль/л). Для експресії феритину в E. coli BL21 і для вивільнення фертину був успішно застосований наступний протокол. Рекомбінантна плазміда pET-28a/феритин була трансформована в штам E. coli BL21 (DE3). Клітини феритину E. coli BL21 (DE3) культивували в середовищах росту LB з 0,5% канаміцином при 37 °C та індукували при OD600 0,6 з 0,4% ізопропіл-β-D-тіогалактопіранозидом протягом 3 годин при 37 °C. Потім остаточну культуру збирали шляхом центрифугування при 8000 г протягом 10 хвилин при 4°C, і збирали гранули. Потім гранулу ресуспендували в середовищі LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% дріжджовий екстракт)/лізис-буфері (20 ммоль/л Tris, 50 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л EDTA, pH 7,6) та різних концентраціях розчину NaCl (0, 50, 100, 170 та 300 ммоль/л) відповідно. Для лізису бактеріальних клітин ультразвук застосовувався в імпульсному режимі: наприклад, за допомогою Ультразвуковий апарат UP400St при 100% амплітуді з робочим циклом 5 секунд ON, 10 секунд OFF, протягом 40 циклів), а потім центрифугують при 10 000 г протягом 15 хвилин при 4°C. Супернатант та осад аналізували методом електрофорезу поліакриламідного гелю додецилсульфату натрію (SDS-PAGE). Всі гелі, забарвлені додецилсульфатом натрію, були відскановані сканером з високою роздільною здатністю. Зображення гелю були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Magic Chemi 1D. Для оптимальної чіткості білкові смуги визначали шляхом коригування параметрів. Дані для каналів були згенеровані з технічних триплікатів. (пор. Sun та ін., 2016)

Ультразвукові руйнівники клітин для промислового лізису клітинних фабрик

Ультразвуковий лізис та екстракція є надійним і зручним методом вивільнення метаболітів із клітинних фабрик, тим самим сприяючи ефективному виробництву цільових молекул. Руйнівники ультразвукових клітин доступні від лабораторії до промислового розміру, а процеси можна масштабувати повністю лінійно.
Hielscher Ultrasonics є вашим компетентним партнером для високопродуктивних ультразвукових руйнівників і має багаторічний досвід у галузі імплантації ультразвукових систем у настільних та промислових умовах.
Коли справа доходить до складного апаратного та програмного забезпечення, системи руйнування стільникового зв'язку Hielscher Ultrasonics відповідають усім вимогам щодо оптимального управління процесом, простоти експлуатації та зручності використання. Клієнти та користувачі ультразвукових пристроїв Hielscher цінують переваги, які ультразвукові руйнівники та екстрактори клітин Hielscher дозволяють точно відстежувати та контролювати процес – за допомогою цифрового сенсорного дисплея та пульта дистанційного керування браузером. Усі важливі дані звукового звуку (наприклад, чиста енергія, загальна енергія, амплітуда, тривалість, температура, тиск) автоматично зберігаються у форматі CSV на вбудованій SD-карті. Це допомагає отримувати відтворювані та повторювані результати та сприяє стандартизації процесів, а також виконанню належної виробничої практики (cGMP).
Звичайно, ультразвукові процесори Hielscher розраховані на роботу 24/7 при повному навантаженні і тому можуть надійно працювати в умовах промислового виробництва. Завдяки високій надійності та низькому обслуговуванню час простою ультразвукового обладнання дійсно низький. Функції CIP (clean-in-place) і SIP (sterilize-in-place) мінімізують трудомістке очищення, тим більше, що всі вологі деталі являють собою гладкі металеві поверхні (без прихованих отворів або насадок).

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових апаратів: