Біоінженерні види бактерій, такі як кишкова паличка, а також генетично модифіковані типи ссавців і рослинних клітин, широко використовуються в біотехнологіях для вираження молекул. Для того, щоб вивільнити ці синтезовані біо-молекули, потрібна надійна техніка порушення клітин. Високопродуктивна ультразвук є перевіреним методом ефективного та надійного клітинного лізису – легко масштабується до великих пропускних здатностей. Hielscher Ультразвук пропонує вам високопродуктивне ультразвукове обладнання для ефективного клітинного лізису, щоб виробляти великі обсяги високоякісних біо-молекул.

Вилучення молекул з клітинних фабрик

Для виробництва широкого спектру біомолекул, різні інженерні мікроби і рослинні клітини можуть бути використані в якості мікробних клітинних заводів, включаючи кишкову паличку, bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana і водорості, серед багатьох інших. Ці клітинні фабрики можуть виробляти білки, ліпіди, біохімічні речовини, полімери, біопаливо і олеохімічні речовини, які використовуються в якості їжі або сировини для промислового застосування. Клітини, що використовуються як клітинні фабрики, культивуються в закритих біореакторах, де вони можуть досягти високої ефективності, специфічності та низьких енергетичних потреб.
Щоб ізолювати молекули-мішені з біоінженерних клітинних культур, клітини повинні бути порушені таким чином, щоб внутрішньоклітинний матеріал був випущений. Ультразвукові порушення клітин добре зарекомендували себе як дуже надійна та ефективна техніка розпаду клітин та вивільнення складних елементів.

Мікробні клітинні фабрики - це метаболічно спроектовані клітини, що використовуються для синтезу різних цінних сполук. Ультразвукове порушення клітин є ефективним і надійним методом, щоб звільнити цінні сполуки з внутрішньої клітини.
навчання та графіка: ©Віллаверде, 2010.

Переваги ультразвукових руйнувачів клітин

Як нетермічна, м'яка, але високоефективна технологія, ультразвукові руйнівники використовуються в лабораторії та промисловості для лизати клітини та виробляти високоякісні екстракти, наприклад, використовуються для ізоляції молекул з клітинних заводів.

Power-Ультразвук для ефективного порушення роботи мікробних клітинних заводів

Механізм і ефекти ультразвукових руйнувачів клітин:
Ультразвукове порушення клітин використовувало потужність ультразвукових хвиль. Ультразвуковий гомогенізатор / клітинний руйнівник оснащений зондом (він же сонотрод), виготовленим з титанового сплаву, який коливається на високій частоті близько 20 кГц. Це означає, що ультразвуковий зонд з'їє 20 000 вібрацій в секунду в ультразвукову рідину. Ультразвукові хвилі, з'єднаних з рідиною, характеризуються чергуванням циклів високого тиску / низького тиску. Під час циклу низького тиску рідина розширюється і виникають дрібні вакуумні бульбашки. Ці дуже маленькі бульбашки ростуть протягом декількох циклів змінного тиску, поки вони не зможуть поглинути будь-яку подальшу енергію. У цей момент кавітаційні бульбашки сильно вибухають і створюють локально надзвичайне енергоємне середовище. Це явище відоме як акустична кавітація і характеризується локально дуже високими температурами, дуже високим тиском і зсувними силами. Ці зсувні напруги ефективно порушують стінки клітин і збільшують передачу маси між інтер'єром клітини і навколишнім розчинником. Як чисто механічна техніка, широко використовуються ультразвукові сили зсуву і рекомендована процедура для порушення бактеріальних клітин, а також для ізоляції білка. Як простий і швидкий метод порушення клітин, ультразвуком ідеально підходить для ізоляції малих, середніх і великих обсягів. Цифрові ультразвукові апарати Hielscher оснащені чітким меню налаштувань для точного контролю ультразвуку. Всі дані ультразвукової обробки автоматично зберігаються на вбудованій SD-карті і просто доступні. Складні варіанти розсіювання тепла, такі як зовнішнє охолодження, ультразвук в режимі пульсу і т.д. Під час процесу ультразвукової дезінтеграції забезпечують підтримку ідеальної температури процесу і, таким чином, неушкодженість витягнутих теплочутливих сполук.

Дослідження підкреслюють сильні сторони ультразвукового порушення клітин і вилучення

Професор Чемат та ін. (2017) резюмує у своєму дослідженні, що «ультразвукова екстракція є зеленою та економічно життєздатною альтернативою звичайним методам харчування та натуральних продуктів. Основними перевагами є зменшення часу видобутку та переробки, кількості використаної енергії та розчинників, операцій з одиницями та СО₂ викидів».
Gabig-Ciminska et al. (2014) використовував гомогенізатор високого тиску та ультразвуковий клітинний дсинтегатор у своєму дослідженні для лізису спор з метою вивільнення ДНК. Порівнюючи обидва методи порушення клітин, дослідницька група робить висновок, що що стосується клітинного лізису для спорної ДНК, «аналіз був зроблений шляхом використання клітинних лізатів від гомогенізації високого тиску. Потім ми зрозуміли, що порушення ультразвукових клітин має видатні переваги для цієї мети. Він досить швидкий і може бути оброблений для невеликих обсягів вибірки". (Габіг-Чімінська та ін., 2014)

Біомолекули з клітинних фабрик для виробництва продуктів харчування

Мікробні клітинні фабрики є життєздатною та ефективною методологією виробництва з використанням мікробних організмів для отримання високих врожаїв рідних та немісцевих метаболітів шляхом метаболічної біоінженії мікробних мікроорганізмів, таких як бактерії, дріжджі, гриби тощо. Об'ємні ферменти, наприклад, виробляються з використанням мікроорганізмів на жаль, як Aspergillus oryzae, гриби і бактерії. Ці сипучі ферменти використовуються для виробництва продуктів харчування та напоїв, а також у сільському господарстві, біоенергетики та домашньому догляді.
Деякі бактерії, такі як Acetobacter xylinum і Gluconacetobacter xylinus, виробляють целюлозу в процесі бродіння, де нановолокна синтезуються в процесі знизу вгору. Бактеріальна целюлоза (також відома як мікробна целюлоза) хімічно еквівалентна рослинній целюлозі, але має високий ступінь кристалічності і високу чистоту (без лігніну, геміцелюлози, пектину та інших біогенних компонентів), а також унікальну структуру целюлози нановолокнистої тривимірної (3D) сітчастої мережі. (див. Чжун, 2020) У порівнянні з рослинною целюлозою, бактеріальна целюлоза є більш стійкою, а вироблена целюлоза чиста, що не вимагає складних кроків очищення. Ультразвук і екстракція розчинника з використанням NaOH або SDS (додецилсульфат натрію) дуже ефективні для ізоляції бактеріальної целюлози від бактеріальних клітин.

Біомолекули з клітинних фабрик для фармацевтичного та вакцинного виробництва

Одним з найвідоміших фармацевтичних продуктів, отриманих з клітинних фабрик, є людський інсулін. Для біоінженерного вироблення інсуліну використовуються переважно E. coli і Saccharomyces cerevisiae. Оскільки біо-синтезовані молекули нанорозміру пропонують високу біосумісність, біологічні наночастинки, такі як феритин, є корисними для численних біовиробників. Крім того, виробництво метаболічно модифікованих мікробів часто значно ефективніше в отриманих врожаях. Наприклад, виробництво артемізинової кислоти, резвератролу і лікопіну зросло в десять разів до декількох сотень разів, і вже налагоджено або знаходиться в розробці до промислового масштабу виробництва. (пор. Лю та ін.; Мікроб. Клітинний факт. 2017)
Наприклад, білкові біомолекули на основі нанорозмірних розмірів з самозбірними властивостями, такими як феритин і вірусоподібні частинки, особливо цікаві для розробки вакцини, оскільки вони імітують як розмір, так і структуру патогенів і піддаються поверхневому кон'югації антигенів для сприяння взаємодії з імунними клітинами. Такі молекули виражаються на так званих клітинних фабриках (наприклад, інженерних штамах E. coli), які виробляють певну молекулу-мішень.

Протокол для ультразвукового лізису та E. coli BL21 для випуску феритину

Феритин - це білок, основною функцією якого є зберігання заліза. Феритин показує перспективні можливості як самостійне складання наночастинок у вакцинах, де він використовується як засіб доставки вакцин (наприклад, шипові білки SARS-Cov-2). Наукові дослідження Сонця і т.д. al. (2016) показує, що рекомбінантний феритин може виділятися як розчинна форма з кишкової палички при низьких концентраціях NaCl (≤50 ммоль /л). Для того, щоб виразити феритин в E. coli BL21 і випустити фертин, успішно був застосований наступний протокол. Рекомбінантний плазмід pET-28a/феритин був перетворений в штам E coli BL21 (DE3). Клітини феритину E coli BL21 (DE3) були культивовані в середовищі росту LB з 0,5% канаміцину при 37 °C і індуковані при OD600 0,6 з 0,4% ізопропіл-β-D-тіогалактопіранозид протягом 3 годин при 37 ° C. Потім остаточна культура була зібрана центрифугами при 8000г протягом 10 хвилин при 4 ° C, і гранула була зібрана. Потім гранула була відновлена в середовищі LB (1% NaCl, 1% типоне, 0,5% екстракт дріжджів) / лізис буфер (20 ммоль / л Tris, 50 ммоль / л NaCl, 1 ммоль / л EDTA, рН 7,6) і різні концентрації розчину NaCl (0, 50, 100, 170 і 300 ммоль / л) відповідно. Для бактеріального клітинного лізису ультразвуком застосовували в імпульсному режимі: наприклад, з використанням ультраакулятор UP400St при 100% амплітуді з циклом виконання 5 секунд ON, 10 секунд OFF, протягом 40 циклів), а потім центрифугується на 10 000 г протягом 15 хвилин при 4 ° C. Супернатант і осад були проаналізовані електрофорезом додецилсульфату натрію поліакриламідним гелем (SDS-PAGE). Всі гелі додецилсульфату натрію були відскановані за допомогою сканера високої роздільної здатності. Гелеві зображення були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Magic Chemi 1D. Для оптимальної чіткості білкові смуги були виявлені шляхом регулювання параметрів. Дані для смуг були отримані з технічних триплікатів. (пор. Нд та ін., 2016)

Ультразвукові клітинні руйнівники для промислового лізису клітинних заводів

Ультразвуковий лізис і екстракція є надійним і зручним методом звільнення метаболітів з клітинних заводів, тим самим допомагаючи ефективному виробництву молекул-мішеней. Ультразвукові порушення клітин доступні від лабораторії до промислових розмірів, і процеси можуть бути масштабовані повністю лінійними.
Hielscher Ультразвук є вашим компетентним партнером для високопродуктивних ультразвукових руйнівників і має багаторічний досвід у галузі імплантації ультразвукових систем у лавці та промислових умовах.
Коли справа доходить до складного апаратного та програмного забезпечення, Hielscher Ultrasonics системи збоєння клітин відповідають усім вимогам для оптимального управління процесом, легкої роботи та зручності користувача. Клієнти та користувач ультразвукових апаратів Hielscher цінують користь, яку ультразвукові руйнатори та екстрактори Hielscher дозволяють точно контролювати та контролювати процес – за допомогою цифрового сенсорного дисплея та пульта дистанційного керування браузера. Всі важливі дані ультразвукової обробки (наприклад, чиста енергія, загальна енергія, амплітуда, тривалість, температура, тиск) автоматично зберігаються у вигляді файлу CSV на інтегрованій SD-карті. Це допомагає отримати відтворювані та повторювані результати та полегшує стандартизацію процесу, а також виконання належної виробничої практики (cGMP).
Звичайно, ультразвукові процесори Hielscher побудовані для роботи 24/7 при повному навантаженні і тому можуть надійно працювати в умовах промислового виробництва. Через високу надійність і низьке технічне обслуговування, простої ультразвукового обладнання дійсно низькі. CIP (clean-in-place) і SIP (стерилізувати на місці) мають мінімізуйте трудомістке прибирання, тим більше, що всі мокрі деталі є гладкими металевими поверхнями (без прихованих отворів або насадок).

У таблиці нижче наведено приблизну потужність обробки наших ультразвукових пристроїв: