Ультразвукове руйнування біоінженерних клітин в промисловому виробництві

Біоінженерні види бактерій, такі як E. coli, а також генетично модифіковані типи клітин ссавців і рослин, широко використовуються в біотехнологіях для експресії молекул. Для вивільнення цих синтезованих біомолекул необхідна надійна техніка руйнування клітин. Високопродуктивна ультразвукова обробка є перевіреною методом для ефективного та надійного лізису клітин – з легким масштабуванням до великих продуктивностей. Hielscher Ultrasonics пропонує вам високопродуктивне ультразвукове обладнання для ефективної руйнування клітин з метою виробництва великих об’ємів високоякісних біомолекул.

Екстракція молекул із клітинних фабрик

Для виробництва широкого спектра біомолекул різні інженерні мікроби та рослинні клітини можуть використовуватися як мікробні клітинні фабрики, включаючи Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lactis, ціанобактерії, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana та водорості, серед багатьох інших. Ці клітинні фабрики можуть виробляти білки, ліпіди, біохімічні речовини, полімери, біопаливо та олеохімікати, які використовуються як харчові продукти або сировина для промислових застосувань. Клітини, що використовуються як клітинні фабрики, культивуються в закритих біореакторах, де вони можуть досягати високої ефективності, специфічності та низьких енерговитрат.
Щоб ізолювати цільові молекули з біоінженерних клітинних культур, клітини повинні бути зруйновані, щоб вивільнити внутрішньоклітинний матеріал. Ультразвукові руйнувачі клітин добре зарекомендували себе як високонедійна та ефективна техніка для дезінтеграції клітин та вивільнення сполук.

Мікробні клітинні фабрики – це метаболічно інженерні клітини, що використовуються для синтезу різних цінних сполук. Ультразвукове руйнування клітин є ефективним та надійним методом вивільнення цінних сполук із внутрішньої частини клітини.
дослідження та графіка: ©Villaverde, 2010.

Переваги ультразвукових руйнувачів клітин

Як нетермічна, м’яка, але високоефективна технологія, ультразвукові руйнувачі використовуються в лабораторії та промисловості для лізису клітин та виробництва високоякісних екстрактів, наприклад, для ізоляції молекул із клітинних фабрик.

Потужний ультразвук для ефективного руйнування мікробних клітинних фабрик

Механізм та ефекти ультразвукових руйнувачів клітин:
Руйнування клітин за допомогою ультразвуку використовує потужність ультразвукових хвиль. Ультразвуковий гомогенізатор / руйнівник клітин оснащений зондом (також відомим як сонотрод), виготовленим із титанового сплаву, який коливається з високою частотою приблизно 20 kHz. Це означає, що ультразвуковий зонд передає 20 000 коливань на секунду в оброблювану рідину. Ультразвукові хвилі, передані в рідину, характеризуються чергуванням циклів високого / низького тиску. Під час циклу низького тиску рідина розширюється, і утворюються крихітні вакуумні бульбашки. Ці дуже маленькі бульбашки зростають протягом кількох чергувань циклів тиску, доки не зможуть поглинати подальшу енергію. У цей момент кавітаційні бульбашки різко імлодують і створюють локально надзвичайно енергонасичене середовище. Це явище відоме як акустична кавітація і характеризується локально дуже високими температурами, дуже високими тисками та зсувними силами. Ці зсувні напруження ефективно руйнують клітинні стінки та збільшують масоперенесення між внутрішнім середовищем клітини та навколишнім розчинником. Як суто механічна техніка, зсувні сили, що генеруються ультразвуком, широко використовуються і є рекомендованою процедурою для руйнування бактеріальних клітин, а також для ізоляції білків. Як простий і швидкий метод руйнування клітин, ультразвукова обробка ідеально підходить для ізоляції малих, середніх і великих об’ємів. Цифрові ультразвукові пристрої Hielscher оснащені чітким меню налаштувань для точного контролю ультразвукової обробки. Усі дані про ультразвукову обробку автоматично зберігаються на вбудованій SD-картці та легко доступні. Складні варіанти відведення тепла, такі як зовнішнє охолодження, ультразвукова обробка в імпульсному режимі тощо, під час процесу ультразвукового руйнування забезпечують підтримання ідеальної температури процесу і, таким чином, цілісність витягнутих термочутливих сполук.

Дослідження підкреслюють переваги ультразвукового руйнування клітин та екстракції

Проф. Chemat та ін. (2017) у своєму дослідженні зазначають, що «ультразвукова екстракція є екологічно чистим та економічно вигідним альтернативним методом до традиційних технік для харчових продуктів і природних продуктів. Основними перевагами є зменшення часу екстракції та обробки, кількості використаної енергії та розчинників, одиничних операцій, а також викидів CO₂ ». Gabig-Ciminska та ін. (2014) використовували високопотужний гомогенізатор і ультразвуковий руйнівник клітин у своєму дослідженні для лізису спор з метою вивільнення ДНК. Порівнюючи обидва методи руйнування клітин, дослідницька група робить висновок, що щодо лізису клітин для ДНК спор, «аналіз було проведено, використовуючи лізати клітин після гомогенізації під високим тиском. Після цього ми зрозуміли, що ультразвукове руйнування клітин має видатні переваги для цієї мети. Воно є досить швидким і може застосовуватися для малих об’ємів зразків». (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Біомолекули з клітинних фабрик для виробництва харчових продуктів

Мікробні клітинні фабрики є життєздатним та ефективним методом виробництва, що використовує мікробні організми для отримання високих виходів нативних і не нативних метаболітів шляхом метаболічної біоінженерії мікробних мікроорганізмів, таких як бактерії, дріжджі, гриби тощо. Наприклад, масові ферменти виробляють за допомогою мікроорганізмів, таких як Aspergillus oryzae, гриби та бактерії. Ці масові ферменти використовуються для виробництва харчових продуктів і напоїв, а також в сільському господарстві, біоенергетиці та побутовій хімії.
Деякі бактерії, такі як Acetobacter xylinum і Gluconacetobacter xylinus, виробляють целюлозу під час процесу ферментації, де нановолокна синтезуються у процесі «знизу вгору». Бактеріальна целюлоза (також відома як мікробна целюлоза) хімічно еквівалентна рослинній целюлозі, але має високий ступінь кристалічності та високу чистоту (вільна від лігніну, гемицелюлози, пектину та інших біогенних компонентів), а також унікальну структуру целюлозного нановолокнистого тривимірного (3D) сітчастого каркасу. (пор. Zhong, 2020) У порівнянні з целюлозою рослинного походження, бактеріальна целюлоза є більш стійкою, а вироблена целюлоза є чистою і не потребує складних етапів очищення. Ультразвукова обробка та екстракція розчинником з використанням NaOH або SDS (додецилсульфат натрію) є дуже ефективними для ізоляції бактеріальної целюлози з бактеріальних клітин.

Біомолекули з клітинних фабрик для фармацевтичного виробництва та виробництва вакцин

Одним із найбільш відомих фармацевтичних продуктів, отриманих із клітинних фабрик, є інсулін людини. Для виробництва біоінженерного інсуліну переважно використовують E. coli та Saccharomyces cerevisiae. Оскільки біосинтезовані нанорозмірні молекули забезпечують високу біосумісність, біологічні наночастинки, такі як феритин, є вигідними для численних застосувань у біовиробництві. Крім того, виробництво в метаболічно модифікованих мікроорганізмах часто є значно більш ефективним за отриманими виходами. Наприклад, виробництво артемизинінової кислоти, ресвератролу та лікопіну зросло в десять разів і навіть у кілька сотень разів, і вже впроваджено або розробляється для промислового масштабу виробництва. (пор. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Наприклад, білкові нанорозмірні біомолекули з властивостями самозбирання, такі як феритин і вірусоподібні частинки, є особливо цікавими для розробки вакцин, оскільки вони імітують як розмір, так і структуру патогенів і придатні до поверхневої кон’югації антигенів для сприяння взаємодії з імунними клітинами. Такі молекули експресуються в так званих клітинних фабриках (наприклад, модифіковані штами E. coli), які виробляють певну цільову молекулу.

Протокол ультразвукового руйнування E. coli BL21 для вивільнення феритину

Феритин – це білок, основною функцією якого є зберігання заліза. Феритин демонструє перспективні можливості як наночастинки, що самозбираються, у вакцинах, де він використовується як засіб доставки вакцини (наприклад, білки шипа SARS-Cov-2). Наукове дослідження Sun et. al. (2016) показує, що рекомбінантний феритин може бути вивільнений у розчинній формі з Escherichia coli при низьких концентраціях NaCl (≤50 mmol/L). Для експресії феритину в E. coli BL21 та вивільнення феритину успішно застосовувався наступний протокол. Рекомбінантну плазміду pET-28a/феритин трансформували в штам E. coli BL21 (DE3). Клітини E. coli BL21 (DE3), що експресували феритин, культивували в середовищі росту LB з 0,5% канамицину при 37°C та індукували при OD600 0,6 за допомогою 0,4% ізопропіл-β-D-тіогалактопіранозиду протягом 3 годин при 37°C. Кінцеву культуру потім збирали шляхом центрифугування при 8000g протягом 10 хвилин при 4°C, і збирали осад. Потім осад ресуспендували в середовищі LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% екстракт дріжджів)/буфері для лізису (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) та різних концентраціях розчину NaCl (0, 50, 100, 170 і 300 mmol/L) відповідно. Для руйнування бактеріальних клітин застосовували ультразвукову обробку в імпульсному режимі: наприклад, використовуючи ультразвуковий гомогенізатор UP400St при 100% амплітуді з робочим циклом 5 секунд ВКЛ, 10 секунд ВИКЛ, протягом 40 циклів), а потім центрифугували при 10 000g протягом 15 хвилин при 4°C. Надосадову рідину та осад аналізували за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з натрій додецилсульфатом (SDS-PAGE). Усі гелі, забарвлені натрій додецилсульфатом, сканували за допомогою сканера високої роздільної здатності. Зображення гелів аналізували за допомогою програмного забезпечення Magic Chemi 1D. Для оптимальної чітності білкові смуги виявляли шляхом коригування параметрів. Дані для смуг були отримані з технічних триплікатів. (див. Sun et al., 2016)

Ультразвукові руйнівники клітин для промислового лізису клітинних фабрик

Ультразвуковий лізис та екстракція є надійним і зручним методом вивільнення метаболітів із клітинних фабрик, що сприяє ефективному виробництву цільових молекул. Ультразвукові руйнівники клітин доступні від лабораторного до промислового розміру, а процеси можна масштабувати повністю лінійно.
Hielscher Ultrasonics є вашим компетентним партнером у сфері високопродуктивних ультразвукових руйнівників і має багаторічний досвід у впровадженні ультразвукових систем у лабораторних та промислових умовах.
Коли йдеться про складне апаратне та програмне забезпечення, системи руйнування клітин Hielscher Ultrasonics відповідають усім вимогам для оптимального управління процесом, простоти експлуатації та зручності для користувача. Клієнти та користувачі ультразвукових апаратів Hielscher цінують перевагу того, що ультразвукові руйнівники та екстрактори клітин Hielscher дозволяють здійснювати точний моніторинг та контроль процесу – через цифровий сенсорний дисплей та дистанційне керування через браузер. Усі важливі дані ультразвукової обробки (наприклад, чиста енергія, загальна енергія, амплітуда, тривалість, температура, тиск) автоматично зберігаються у форматі CSV-файлу на інтегрованій SD-картці. Це допомагає отримувати відтворювані та повторювані результати, а також сприяє стандартизації процесу та виконанню вимог належної виробничої практики (cGMP).
Звичайно, ультразвукові процесори Hielscher розроблені для роботи 24/7 під повним навантаженням і тому можуть надійно експлуатуватися в умовах промислового виробництва. Завдяки високій надійності та низьким вимогам до обслуговування час простою ультразвукового обладнання дійсно незначний. Функції CIP (мийка на місці) та SIP (стерилізація на місці) мінімізують трудомістке очищення, особливо оскільки всі частини, що контактують із середовищем, мають гладкі металеві поверхні (без прихованих отворів або насадок).

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність обробки наших ультразвукових апаратів: