Hielscher Ultrasonics
Будемо раді обговорити Ваш процес.
Зателефонуйте нам: +49 3328 437-420
Напишіть нам: info@hielscher.com

Препарування плазмід за допомогою ультразвуку

Ультразвук є надійним методом фрагментації плазмідної ДНК. Точно контрольована амплітуда, режим пульсації та контроль температури є найважливішими характеристиками ультразвукового апарату для непошкоджуючої фрагментації плазміди. Крім того, використання деяких засобів допомагає захиститися від деградації плазмід. Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для контрольованої фрагментації плазміди з окремих флаконів, одночасно ультразвукового дослідження численних зразків, а також багатолункових пластин. Дізнайтеся більше про успішну ультразвукову фрагментацію плазміди!

Інформаційний запит




Зверніть увагу на наш Політика конфіденційності.




Ультразвукова фрагментація ДНК є надійним та ефективним методом, який зазвичай використовується в секвенуванні наступного покоління (NGS)

Про UIP400MTP Дозволяє проводити точно контрольоване ультразвукове дослідження багатолункових пластин. Одним із застосувань UIP400MTP є фрагментація плазмідної ДНК з метою отримання фрагментів специфічно цільової довжини.

Плазмідний зсув за допомогою ультразвуку

Коли зразки ДНК піддаються впливу ультразвукових хвиль, ультразвукові вібрації створюють акустичну кавітацію в рідині, яка зрізає або розриває високомолекулярні молекули ДНК за допомогою механічних сил. Ультразвук є найбільш широко використовуваним методом для експериментів з масовим зрізом ДНК, включаючи такі програми, як імунопреципітація хроматину (ChIP), для якого невеликі розміри фрагментів є абсолютно важливими для отримання високої роздільної здатності. (пор. Ценг та ін., 2012)
ДНК плазміди (пДНК) є специфічною формою ДНК, що характеризується кільцевою формою і зустрічається у бактерій і деяких еукаріотів.
Суперспіральна пДНК є бажаною формою плазмідної ДНК, оскільки вона показує найкращі результати в подальших процесах, таких як автоматизоване секвенування та трансфекція. Ультразвук підходить для успішного фрагментування пДНК, включаючи суперспіральну пДНК.
Thompson et al. (2008) продемонстрували, що ультразвукова діагностика плазміди, яка, як відомо, фрагментує суперспіральну ДНК, є ефективним способом покращення довжини зчитування послідовності phred20 до такої міри, що вони суттєво не відрізняються від контрольного шаблону Бекмана Колтера або ферментативно лінеаризованих плазмід.

Переваги ультразвукової фрагментації ДНК

  • Точно керований
  • Відтворювані результати
  • Регулюється для націлювання на довжину фрагментів ДНК
  • Контроль температури
  • Масштабується до будь-якого розміру вибірки
На відео показана ультразвукова система підготовки зразків UIP400MTP, яка дозволяє проводити надійну пробопідготовку будь-яких стандартних багатолункових пластин за допомогою ультразвуку високої інтенсивності. Типові застосування UIP400MTP включають лізис клітин, зріз ДНК, РНК і хроматину, а також екстракцію білків.

Ультразвуковий UIP400MTP для багатолункового пластинчастого УЗД

Мініатюра відео

Використання плазмідних векторів

Плазміди часто використовуються як інструменти для клонування, перенесення та маніпулювання генами. Коли плазміди використовуються експериментально для цих цілей, їх називають векторами. Фрагменти ДНК або гени можуть бути вставлені в плазмідний вектор, створюючи так звану рекомбінантну плазміду. Плазмідні вектори використовуються як транспортні засоби для введення рекомбінантної ДНК у клітину-хазяїна та є ключовим компонентом молекулярного клонування.
“Невірусні вектори широко вивчаються на предмет їх потенційного використання в генній терапії для лікування різних складних захворювань. Невірусні вектори захищають плазмідну ДНК від фізичної, хімічної та ферментативної деградації та доставляють молекулу ДНК до цільового місця. Наприклад, катіонні ліпосоми, хітозан та інші позитивно заряджені наночастинки утворюють комплекси з плазмідною ДНК за допомогою електростатичних взаємодій. Однак легко утворені комплекси катіонних ліпосом/плазмідних ДНК є відносно великими (тобто 300–400 нм) і неоднорідними за своєю природою, що ускладнює їх використання у фармацевтичних цілях. Великі та гетерогенні плазмідні ДНК/ліпосоми, плазмідна ДНК/аерозолі та комплекси плазмідної ДНК/пептидів можуть бути відновлені до менших та однорідніших частинок за допомогою ультразвуку.” (Sarker et al., 2019)
Яскравим прикладом використання плазмідних векторів є CRISPR–Cas9. Система CRISPR–Cas9 зазвичай доставляється до клітин у вигляді однієї великої плазміди або кількох менших плазмід, які кодують цільову послідовність, провідник CRISPR та Cas9.

Ультразвукова підготовка ДНК-наночастинок PLGA методом наноосадження

Jo et al. (2020) використовували полі(молочно-ко-гліколеву кислоту) (PLGA) для формування носія наночастинок для доставки модельної плазміди CRISPR–Cas9 у макрофаги, отримані з первинного кісткового мозку. Для наноосадження наночастинок PLGA використовувалися PLGA з двома різними кінцевими групами (ефірні та амінні групи) з метою, що позитивно заряджені кінцеві кришки амінів підвищують ефективність інкапсуляції та навантаження за рахунок взаємодії зарядів між нею та негативно зарядженим кістяком ДНК. У поліпропіленовій конічній центрифужній трубці об'ємом 50 мл 100 мг Pluronic F127 розчиняли в 20 мл автоклавної DI води шляхом вихрового змішування з подальшим 30 хв м'якої ультразвукової діагностики за допомогою ультразвукової ванни (дивись CupHorn). Була додана автоклавна магнітна мішалка, і розчин перемішувався при 600 об/хв протягом 30 хв, поки виготовлялися інші розчини. Замість скляного посуду всюди використовувався пластиковий лабораторний посуд, щоб мінімізувати неспецифічну адсорбцію ДНК. Окремо виготовляли розчини ПЛГА, розчиненого в ДМФ (44,48 мг/мл), та пентацену ТІПС, розчиненого в ПТГС (0,667 мг/мл). PLGA залишали спокійно мочити в DMF протягом 30 хвилин, а потім проводили ультразвукове дослідження протягом 30 хв (повний протокол див. Jo et al., 2020)

Пов'язані програми:

  • Екстракція ДНК
  • Інкапсуляція ДНК
  • Дисперсія ДНК, покритої наночастинками
  • Доставка плазмідної ДНК в клітини
UP200St TD_CupHorn для непрямого ультразвукового дослідження зразків

UP200St CupHorn для непрямої ультразвукової обробки зразків, наприклад, для екстракції та фрагментації ДНК.

Інформаційний запит




Зверніть увагу на наш Політика конфіденційності.




Захист плазмідної ДНК під час ультразвукового дослідження

ДНК, включаючи плазміди та суперспіральні плазміди, мають високу чутливість до деградації. Всі наявні методи фрагментації відомі певними недоліками. Ультразвукова фрагментація ДНК є одним з кращих методів, оскільки контрольована ультразвукова обробка в поєднанні із захисними заходами дозволяє зменшити зсувне та термічне пошкодження ланцюгів ДНК.
Крім налаштувань низької амплітуди, режиму пульсації та контролю температури під час ультразвукового зрізу ДНК, використання деяких агентів показало значний захисний ефект проти деградації ДНК. Наприклад, різні полімери, пептиди та ліпіди захищають плазмідну ДНК під час ультразвуку.

Іонні рідини можуть захистити плазмідну ДНК від пошкоджень під час ультразвуку.

Стабільність плазмідної ДНК та нанокомплексів плазмідної ДНК/IL проти ультразвукового стресу зсуву досліджували за допомогою електрофорезного аналізу агарозного гелю. Як плазмідна ДНК, так і нанокомплекси плазмідної ДНК/IL були піддані ультразвуковому стресу зсуву протягом різних моментів часу. ДНК плазміди піддавалася впливу ультразвукового стресу зсуву протягом 0, 10, 20, 30 і 40 хвилин. Однак нанокомплекси плазмідної ДНК/IL піддавалися ультразвуковому напрузі зсуву протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 та 120 хвилин.
(дослідження та ілюстрація: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрували, що коли наноструктури плазмідної ДНК / іонної рідини (pDNA/IL) піддавалися ультразвуковому напрузі зсуву протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 і 120 хв і комплексувалися з комерційно доступним агентом доставки катіонних генів ліпофектаміном, відсоток флуоресцентних позитивних клітин становив 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% і 50% відповідно (див. діаграму нижче). Відсоток флуоресцентних позитивних клітин збільшувався, коли наноструктури піддавалися ультразвуковому напрузі зсуву протягом 10, 20 хв, і після цього повільно знижувався.

Ультразвукова фрагментація плазмідної ДНК

Вплив іонної рідини [Bmim][PF6] на доставку плазмідної ДНК до клітин COS7. Нанокомплекси плазмідної ДНК/IL (іонна рідина) піддавалися ультразвуковому зсуву протягом 120 хвилин і комплексувалися з ЛА перед доставкою в клітини COS7. Дані показують середню кількість (%) GFP-позитивних клітин HeLa, підрахованих у 10 різних мікроскопічних полях, і експеримент проводився кілька разів у три різні дні. (Дослідження та діаграма: ©Sarker et al., 2019)

ДНК плазміди можна захистити, додавши агент перед ультразвуковою фрагментацією.

Плазмідну ДНК можна захистити, додаючи агент перед ультразвуковою фрагментацією: спричинена ультразвуковим випромінюванням деградація голої пДНК (A) та пДНК, що складається з 1,5 мМ CaCl2 та 20 % (об/об) t-бутанолу (B)
Зразки проводили ультразвукове дослідження за допомогою зонда потужністю 20 Вт протягом 120 секунд, як зазначено на верхній частині кожної смуги. Смуга H відповідає позначці Hyperladder I ™️. Показані плазмідні смуги OC і SC.
(дослідження та ілюстрації: ©Wu et al., 2009)

Приготування ультразвукового лізату

Протокол лізису ультразвукових клітин
Ультразвуковий апарат UP200Ht з мікронаконечником S26d2 для ультразвукового лізису біологічних зразківПочніть зі збагаченого зразка клітин, який був підготовлений за допомогою методу клітинного поділу (наприклад, імуномагнітне виділення клітин, сортування клітин, активоване флуоресценцією (FACS), центрифугування з градієнтом щільності, виділення клітин з імунощільністю).
Зразки клітин повинні показувати об'єм лізисного буфера, що відповідає експериментальній меті, і ультразвукового апарату зондового типу.
Перевага віддається гіпотонічним буферам, оскільки вони підсилюють лізис ультразвукових клітин. Важливо, щоб добавки та концентрація солі використовувалися відповідним чином.
Виберіть свій ультразвуковий лізисний пристрій: Для непрямого ультразвукового випромінювання флаконів рекомендується VialTweeter або CupHorn. Для багатолункових пластин UIP400MTP є ідеальним ультразвуковим апаратом. А для класичного зондового типу найбільше підходить ультразвуковий гомогенізатор на кшталт UP100H або UP200Ht з мікронаконечником.
Протокол проведення УЗД зондового типу: Помістіть ультразвуковий зонд в об'єм зразка в мікроцентрифужну пробірку і проведіть ультразвукове дослідження протягом приблизно 10 секунд. Залежно від зразка ДНК, ультразвукове дослідження може повторюватися ще один або два рази. Необхідний вхідний ультразвуковий сигнал енергії (Вт/мл) залежить від в'язкості зразка та типу ДНК. Охолодження за допомогою крижаної ванни та режиму пульсації ультразвукового апарату допомагає запобігти термічній деградації зразка.
Після ультразвукового лізису зразок центрифугують для відділення залишків гранул (що містять нелізовані клітини, ядра та нелізовані органели)
Якщо зразок не піддається негайній подальшій обробці, його можна зберігати при відповідній температурі, щоб зберегти його життєздатність.

Ультразвукові апарати для фрагментації ДНК

Hielscher Ultrasonics пропонує різні платформи на основі ультразвуку для фрагментації ДНК, РНК і хроматину. Ці різні платформи включають ультразвукові зонди (сонотроди), непрямі ультразвукові розчини для одночасної підготовки зразків кількох трубок або багатолункових пластин (наприклад, 96-лункові пластини, мікротитрові пластини), сонореактори та ультразвукові чашоги. Всі платформи для стрижки ДНК працюють на основі високопродуктивних ультразвукових процесорів з частотним налаштуванням, які точно контролюються і забезпечують відтворювані результати.

Ультразвукові процесори для будь-якого числа та розміру зразка

За допомогою багатозразкових ультразвукових апаратів Hielscher VialTweeter (для 10 пробірок) і UIP400MTP (для мікропланшетів / багатолункових пластин) стає легко можливим скоротити час обробки зразків завдяки інтенсивному і точно контрольованому ультразвуку, отримуючи при цьому бажаний розмір фрагментів ДНК, розподіл і вихід. Ультразвукова фрагментація ДНК робить етапи підготовки плазмід ефективними, надійними та масштабованими. Протоколи можуть бути лінійно масштабовані від одного до декількох зразків шляхом застосування постійних параметрів ультразвуку.
Зондові ультразвукові апарати з одним до п'яти пальців ідеально підходять для приготування менших номерів зразків. Лабораторні ультразвукові апарати Hielscher доступні з різними рівнями потужності, щоб ви могли вибрати ідеальний ультразвуковий руйнівник для вашого застосування, пов'язаного з ДНК.

VialTweeter - це ультразвуковий прилад MultiSample, який дозволяє надійно готувати зразки в точно контрольованих температурних умовах.

Ультразвуковий блок мультипробопідготовки VialTweeter Дозволяє проводити одночасне ультразвукове дослідження до 10 флаконів. За допомогою затискного пристрою VialPress можна притиснути до 4 додаткових трубок спереду для інтенсивного ультразвуку.

Точне управління процесом

Ультразвуковими пристроями Hielscher можна дистанційно керувати за допомогою браузера. Параметри ультразвуку можна контролювати та точно регулювати відповідно до вимог процесу.Точно контрольовані налаштування ультразвуку мають вирішальне значення, оскільки виснажлива соніфікація може знищити ДНК, РНК і хроматин, але неадекватне ультразвукове зрізання призводить до занадто довгих фрагментів ДНК і хроматину. Цифрові ультразвукові апарати Hielscher можна легко налаштувати на точний параметр ультразвуку. Конкретні налаштування ультразвукового апарату також можуть бути збережені як запрограмовані налаштування для швидкого повторення однієї і тієї ж процедури.
Всі ультразвукові дослідження автоматично протоколюються і зберігаються у вигляді CSV-файлу на вбудованій SD-карті. Це дозволяє точно документувати проведені дослідження та легко переглядати результати ультразвукових досліджень.
За допомогою пульта дистанційного керування браузером можна керувати всіма цифровими ультразвуковими пристроями та контролювати їх за допомогою будь-якого стандартного браузера. Установка додаткового програмного забезпечення не потрібна, оскільки підключення до локальної мережі є дуже простою настройкою plug-n-play.

Найвища зручність для користувача під час ультразвукового препарування ДНК

Всі ультразвукові апарати Hielscher розроблені для забезпечення високопродуктивного ультразвуку, в той же час завжди дуже зручні у використанні і прості в експлуатації. Всі налаштування добре структуровані в зрозумілому меню, доступ до якого можна легко отримати за допомогою кольорового сенсорного дисплея або пульта дистанційного керування браузером. Інтелектуальне програмне забезпечення з програмованими налаштуваннями та автоматичним записом даних забезпечує оптимальні налаштування ультразвуку для надійних і відтворюваних результатів. Зрозумілий і простий у використанні інтерфейс меню перетворює ультразвукові апарати Hielscher в зручні і ефективні пристрої.
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших лабораторних ультразвукових апаратів для лізису клітин і фрагментації ДНК:

Об'єм партії Витрата Рекомендовані пристрої
Багатолункові плити Н/Д UIP400MTP
флакони, маленька мензурка Н/Д Ультразвуковий CupHorn
до 10 флаконів Н/Д VialTweeter
Від 1 до 500 мл Від 10 до 200 мл/хв UP100H
Від 10 до 2000 мл Від 20 до 400 мл/хв UP200Ht, UP400St

Зв'яжіться з нами! / Запитайте нас!

Запитайте більше інформації

Будь ласка, скористайтеся формою нижче, щоб запросити додаткову інформацію про ультразвукові гомогенізатори для екстракції та фрагментації ДНК, протоколи застосування та ціни. Ми будемо раді обговорити з Вами Ваш процес і запропонувати Вам ультразвукову систему, що відповідає Вашим вимогам!









Будь ласка, зверніть увагу на наші Політика конфіденційності.






Література / Список літератури

Факти, які варто знати

Що таке плазміди?
Плазміда — це невелика кільцева молекула ДНК, яка фізично відокремлена від хромосомної ДНК і реплікується незалежно. Плазміди часто пов'язані з генами, які сприяють виживанню організму і надають специфічні переваги, наприклад, стійкість до антибіотиків. Плазміди найчастіше зустрічаються у вигляді невеликих круглих дволанцюгових молекул ДНК у бактерій; Однак плазміди іноді присутні в архей і еукаріотичних організмах. Плазміди є важливими інструментами в молекулярній біології, генетиці, біохімії та науках про життя. Відомі як вектори в генній інженерії, плазміди використовуються для реплікації або експресії певних генів. Цілеспрямована зміна вектора називається векторним конструюванням.

Аналіз GFP у дослідженні клітин
Зелений флуоресцентний білок (GFP) є універсальним біологічним маркером для моніторингу фізіологічних процесів, візуалізації локалізації білків та виявлення трансгенної експресії in vivo. GFP може збуджуватися лазерною лінією 488 нм і оптимально визначається при 510 нм.


High performance ultrasonics! Hielscher's product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.

Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори з Лабораторії до промислові розміри.

Будемо раді обговорити Ваш процес.

Let's get in contact.