Препарування плазмід за допомогою ультразвуку

Ультразвук є надійним методом фрагментації плазмідної ДНК. Точно контрольована амплітуда, режим пульсації та контроль температури є найважливішими характеристиками ультразвукового апарату для непошкоджуючої фрагментації плазміди. Крім того, використання деяких засобів допомагає захиститися від деградації плазмід. Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для контрольованої фрагментації плазміди з окремих флаконів, одночасно ультразвукового дослідження численних зразків, а також багатолункових пластин. Дізнайтеся більше про успішну ультразвукову фрагментацію плазміди!

Плазмідний зсув за допомогою ультразвуку

Коли зразки ДНК піддаються впливу ультразвукових хвиль, ультразвукові вібрації створюють акустичну кавітацію в рідині, яка зрізає або розриває високомолекулярні молекули ДНК за допомогою механічних сил. Ультразвук є найбільш широко використовуваним методом для експериментів з масовим зрізом ДНК, включаючи такі програми, як імунопреципітація хроматину (ChIP), для якого невеликі розміри фрагментів є абсолютно важливими для отримання високої роздільної здатності. (пор. Ценг та ін., 2012)
ДНК плазміди (пДНК) є специфічною формою ДНК, що характеризується кільцевою формою і зустрічається у бактерій і деяких еукаріотів.
Суперспіральна пДНК є бажаною формою плазмідної ДНК, оскільки вона показує найкращі результати в подальших процесах, таких як автоматизоване секвенування та трансфекція. Ультразвук підходить для успішного фрагментування пДНК, включаючи суперспіральну пДНК.
Thompson et al. (2008) продемонстрували, що ультразвукова діагностика плазміди, яка, як відомо, фрагментує суперспіральну ДНК, є ефективним способом покращення довжини зчитування послідовності phred20 до такої міри, що вони суттєво не відрізняються від контрольного шаблону Бекмана Колтера або ферментативно лінеаризованих плазмід.

Використання плазмідних векторів

Плазміди часто використовуються як інструменти для клонування, перенесення та маніпулювання генами. Коли плазміди використовуються експериментально для цих цілей, їх називають векторами. Фрагменти ДНК або гени можуть бути вставлені в плазмідний вектор, створюючи так звану рекомбінантну плазміду. Плазмідні вектори використовуються як транспортні засоби для введення рекомбінантної ДНК у клітину-хазяїна та є ключовим компонентом молекулярного клонування.
“Невірусні вектори широко вивчаються на предмет їх потенційного використання в генній терапії для лікування різних складних захворювань. Невірусні вектори захищають плазмідну ДНК від фізичної, хімічної та ферментативної деградації та доставляють молекулу ДНК до цільового місця. Наприклад, катіонні ліпосоми, хітозан та інші позитивно заряджені наночастинки утворюють комплекси з плазмідною ДНК за допомогою електростатичних взаємодій. Однак легко утворені комплекси катіонних ліпосом/плазмідних ДНК є відносно великими (тобто 300–400 нм) і неоднорідними за своєю природою, що ускладнює їх використання у фармацевтичних цілях. Великі та гетерогенні плазмідні ДНК/ліпосоми, плазмідна ДНК/аерозолі та комплекси плазмідної ДНК/пептидів можуть бути відновлені до менших та однорідніших частинок за допомогою ультразвуку.” (Sarker et al., 2019)
Яскравим прикладом використання плазмідних векторів є CRISPR–Cas9. Система CRISPR–Cas9 зазвичай доставляється до клітин у вигляді однієї великої плазміди або кількох менших плазмід, які кодують цільову послідовність, провідник CRISPR та Cas9.

Ультразвукова підготовка ДНК-наночастинок PLGA методом наноосадження

Jo et al. (2020) використовували полі(молочно-ко-гліколеву кислоту) (PLGA) для формування носія наночастинок для доставки модельної плазміди CRISPR–Cas9 у макрофаги, отримані з первинного кісткового мозку. Для наноосадження наночастинок PLGA використовувалися PLGA з двома різними кінцевими групами (ефірні та амінні групи) з метою, що позитивно заряджені кінцеві кришки амінів підвищують ефективність інкапсуляції та навантаження за рахунок взаємодії зарядів між нею та негативно зарядженим кістяком ДНК. У поліпропіленовій конічній центрифужній трубці об'ємом 50 мл 100 мг Pluronic F127 розчиняли в 20 мл автоклавної DI води шляхом вихрового змішування з подальшим 30 хв м'якої ультразвукової діагностики за допомогою ультразвукової ванни (дивись CupHorn). Була додана автоклавна магнітна мішалка, і розчин перемішувався при 600 об/хв протягом 30 хв, поки виготовлялися інші розчини. Замість скляного посуду всюди використовувався пластиковий лабораторний посуд, щоб мінімізувати неспецифічну адсорбцію ДНК. Окремо виготовляли розчини ПЛГА, розчиненого в ДМФ (44,48 мг/мл), та пентацену ТІПС, розчиненого в ПТГС (0,667 мг/мл). PLGA залишали спокійно мочити в DMF протягом 30 хвилин, а потім проводили ультразвукове дослідження протягом 30 хв (повний протокол див. Jo et al., 2020)

Захист плазмідної ДНК під час ультразвукового дослідження

ДНК, включаючи плазміди та суперспіральні плазміди, мають високу чутливість до деградації. Всі наявні методи фрагментації відомі певними недоліками. Ультразвукова фрагментація ДНК є одним з кращих методів, оскільки контрольована ультразвукова обробка в поєднанні із захисними заходами дозволяє зменшити зсувне та термічне пошкодження ланцюгів ДНК.
Крім налаштувань низької амплітуди, режиму пульсації та контролю температури під час ультразвукового зрізу ДНК, використання деяких агентів показало значний захисний ефект проти деградації ДНК. Наприклад, різні полімери, пептиди та ліпіди захищають плазмідну ДНК під час ультразвуку.

Стабільність плазмідної ДНК та нанокомплексів плазмідної ДНК/IL проти ультразвукового стресу зсуву досліджували за допомогою електрофорезного аналізу агарозного гелю. Як плазмідна ДНК, так і нанокомплекси плазмідної ДНК/IL були піддані ультразвуковому стресу зсуву протягом різних моментів часу. ДНК плазміди піддавалася впливу ультразвукового стресу зсуву протягом 0, 10, 20, 30 і 40 хвилин. Однак нанокомплекси плазмідної ДНК/IL піддавалися ультразвуковому напрузі зсуву протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 та 120 хвилин.
(дослідження та ілюстрація: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрували, що коли наноструктури плазмідної ДНК / іонної рідини (pDNA/IL) піддавалися ультразвуковому напрузі зсуву протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 і 120 хв і комплексувалися з комерційно доступним агентом доставки катіонних генів ліпофектаміном, відсоток флуоресцентних позитивних клітин становив 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% і 50% відповідно (див. діаграму нижче). Відсоток флуоресцентних позитивних клітин збільшувався, коли наноструктури піддавалися ультразвуковому напрузі зсуву протягом 10, 20 хв, і після цього повільно знижувався.

Вплив іонної рідини [Bmim][PF6] на доставку плазмідної ДНК до клітин COS7. Нанокомплекси плазмідної ДНК/IL (іонна рідина) піддавалися ультразвуковому зсуву протягом 120 хвилин і комплексувалися з ЛА перед доставкою в клітини COS7. Дані показують середню кількість (%) GFP-позитивних клітин HeLa, підрахованих у 10 різних мікроскопічних полях, і експеримент проводився кілька разів у три різні дні. (Дослідження та діаграма: ©Sarker et al., 2019)

Приготування ультразвукового лізату

Протокол лізису ультразвукових клітин
Почніть зі збагаченого зразка клітин, який був підготовлений за допомогою методу клітинного поділу (наприклад, імуномагнітне виділення клітин, сортування клітин, активоване флуоресценцією (FACS), центрифугування з градієнтом щільності, виділення клітин з імунощільністю).
Зразки клітин повинні показувати об'єм лізисного буфера, що відповідає експериментальній меті, і ультразвукового апарату зондового типу.
Перевага віддається гіпотонічним буферам, оскільки вони підсилюють лізис ультразвукових клітин. Важливо, щоб добавки та концентрація солі використовувалися відповідним чином.
Виберіть свій ультразвуковий лізисний пристрій: Для непрямого ультразвукового випромінювання флаконів рекомендується VialTweeter або CupHorn. Для багатолункових пластин UIP400MTP є ідеальним ультразвуковим апаратом. А для класичного зондового типу найбільше підходить ультразвуковий гомогенізатор на кшталт UP100H або UP200Ht з мікронаконечником.
Протокол проведення УЗД зондового типу: Помістіть ультразвуковий зонд в об'єм зразка в мікроцентрифужну пробірку і проведіть ультразвукове дослідження протягом приблизно 10 секунд. Залежно від зразка ДНК, ультразвукове дослідження може повторюватися ще один або два рази. Необхідний вхідний ультразвуковий сигнал енергії (Вт/мл) залежить від в'язкості зразка та типу ДНК. Охолодження за допомогою крижаної ванни та режиму пульсації ультразвукового апарату допомагає запобігти термічній деградації зразка.
Після ультразвукового лізису зразок центрифугують для відділення залишків гранул (що містять нелізовані клітини, ядра та нелізовані органели)
Якщо зразок не піддається негайній подальшій обробці, його можна зберігати при відповідній температурі, щоб зберегти його життєздатність.

Ультразвукові апарати для фрагментації ДНК

Hielscher Ultrasonics пропонує різні платформи на основі ультразвуку для фрагментації ДНК, РНК і хроматину. Ці різні платформи включають ультразвукові зонди (сонотроди), непрямі ультразвукові розчини для одночасної підготовки зразків кількох трубок або багатолункових пластин (наприклад, 96-лункові пластини, мікротитрові пластини), сонореактори та ультразвукові чашоги. Всі платформи для стрижки ДНК працюють на основі високопродуктивних ультразвукових процесорів з частотним налаштуванням, які точно контролюються і забезпечують відтворювані результати.

Ультразвукові процесори для будь-якого числа та розміру зразка

За допомогою багатозразкових ультразвукових апаратів Hielscher VialTweeter (для 10 пробірок) і UIP400MTP (для мікропланшетів / багатолункових пластин) стає легко можливим скоротити час обробки зразків завдяки інтенсивному і точно контрольованому ультразвуку, отримуючи при цьому бажаний розмір фрагментів ДНК, розподіл і вихід. Ультразвукова фрагментація ДНК робить етапи підготовки плазмід ефективними, надійними та масштабованими. Протоколи можуть бути лінійно масштабовані від одного до декількох зразків шляхом застосування постійних параметрів ультразвуку.
Зондові ультразвукові апарати з одним до п'яти пальців ідеально підходять для приготування менших номерів зразків. Лабораторні ультразвукові апарати Hielscher доступні з різними рівнями потужності, щоб ви могли вибрати ідеальний ультразвуковий руйнівник для вашого застосування, пов'язаного з ДНК.