Ультразвук є надійною технікою фрагментації плазмідної ДНК. Точно контрольована амплітуда, пульсаційний режим і контроль температури є найважливішими особливостями ультразвукового пристрою для неушкоджуючої фрагментації плазміди. Крім того, використання певних агентів допомагає захиститися від деградації плазміди. Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для контрольованої фрагментації плазміди з одиночних флаконів, одночасно ультразвукової обробки численних зразків, а також багатоквартирних пластин. Дізнайтеся більше про успішну фрагментацію ультразвукової плазміди!

Стрижка плазміди за допомогою ультразвуку

Коли зразки ДНК піддаються ультразвуковим хвилям, ультразвуково створювані коливання створюють акустичну кавітацію в рідині, яка зсуває або розриває високомолекулярні молекули ДНК за допомогою механічних сил. Ультразвукова обробка є найбільш широко використовуваним методом для експериментів з об'ємного зсуву ДНК, включаючи застосування, такі як імунопреципітація хроматину (CHIP), для якого невеликі розміри фрагментів мають абсолютно вирішальне значення для отримання високої роздільної здатності. (пор. Ценг та ін., 2012)
Плазмідна ДНК (pDNA) є специфічною формою ДНК, характеризується формою кільця і зустрічається у бактерій і деяких еукаріотів.
Суперспіралізована pDNA є бажаною формою плазмідної ДНК, оскільки вона показує найкращі результати в процесах, таких як автоматизоване секвенування та трансфекція. Ультразвук підходить для фрагментації pDNA, включаючи суперспіралізований pDNA, успішно.
Thompson et al. (2008) продемонстрував, що плазмідна ультразвукова обробка, яка, як відомо, фрагментує суперспіралізовану ДНК, є ефективним способом покращити довжину читання послідовності phred20 до такої міри, що вони суттєво не відрізняються від шаблону управління Бекмана Коултера або ферментативно лінеаризованих плазмід.

Використання плазмідних векторів

Плазміди часто використовуються як інструменти для клонування, передачі та маніпулювання генами. Коли плазміди використовуються експериментально для цих цілей, їх називають векторами. Фрагменти ДНК або гени можуть бути вставлені в плазмідний вектор, створюючи так звану рекомбінантну плазміду. Плазмідні вектори використовуються як транспортні засоби для загону рекомбінантної ДНК в клітину-хазяїн і є ключовим компонентом молекулярного клонування.
“Невірусні вектори широко вивчаються на предмет їх потенційного використання в генній терапії для лікування різних складних захворювань. Невірусні вектори захищають плазмідну ДНК від фізичної, хімічної та ферментативної деградації і доставляють молекулу ДНК до цільового місця. Наприклад, катіонні ліпосоми, хітозан та інші позитивно заряджені наночастинки утворюють комплекси з плазмідною ДНК за допомогою електростатичних взаємодій. Однак легко сформовані катіонні ліпосоми/плазмідні комплекси ДНК відносно великі (тобто 300–400 нм) і неоднорідні за своєю природою, що ускладнює їх використання у фармацевтичних цілях. Великі та гетерогенні плазмідні ДНК / ліпосоми, плазмідні ДНК / аерозолі та плазмідні комплекси ДНК / пептидів можуть бути зменшені до менших та однорідних частинок за допомогою ультразвуку.” (Саркер та ін., 2019)
Яскравим прикладом використання плазмідних векторів є CRISPR–Cas9. Система CRISPR–Cas9 зазвичай доставляється до комірок у вигляді однієї великої плазміди або декількох менших плазмід, які кодують цільову послідовність, напрямну CRISPR та Cas9.

Ультразвукова підготовка наночастинок PLGA, завантажених ДНК, шляхом нанопреципітації

Jo et al. (2020) використовував полі(молочно-ко-гліколева кислота) (PLGA) для того, щоб сформувати носій наночастинок для доставки моделі плазміди CRISPR–Cas9 у макрофаги первинного кісткового мозку. Для нанопреципітації наночастинок PLGA використовували PLGA з двома різними кінцевими групами (ефір і амінні групи) з метою, щоб позитивно заряджені кінцеві ковпачки аміну збільшували ефективність інкапсуляції і навантаження за рахунок взаємодії заряду між ним і негативно зарядженим кістяком ДНК. У поліпропіленовій конічній центрифужній трубці об'ємом 50 мл 100 мг Pluronic F127 був розчинений у 20 мл автоклавної DI-води шляхом вихрового змішування з подальшою 30 хв щадної ультразвукової обробки за допомогою ультразвукової ванни (подивитися Кубок Хорн). Була додана автоклавна магнітна смуга перемішування і розчин змішувався при 600 об / хв протягом 30 хв, поки виготовлялися інші розчини. Пластиковий лабораторний посуд використовувався замість скляного посуду, щоб мінімізувати неспецифічну адсорбцію ДНК. Окремо виготовляли розчини ПЛГА, розчинені в ДМФ (44,48 мг/мл) та пентацену TIPS, розчиненого в ТГФ (0,667 мг/мл). PLGA був залишений спокійним для змочування в DMF протягом 30 хвилин, перш ніж його ультразвукову обробку протягом 30 хв (повний протокол див. Jo et al., 2020)

Захист плазмідної ДНК під час ультразвукової обробки

ДНК, включаючи плазміди та суперспіралізовані плазміди, є високочутливою деградацією. Всі доступні методи фрагментації відомі певними недоліками. Ультразвукова фрагментація ДНК є одним з бажаних методів, оскільки контрольована ультразвукова обробка в поєднанні із захисними заходами дозволяє зменшити зсувне та теплове індуковане пошкодження ниток ДНК.
Крім низьких амплітудних налаштувань, пульсаційного режиму і контролю температури під час ультразвукового зсуву ДНК, використання деяких агентів показало значний захисний ефект від деградації ДНК. Наприклад, різні полімери, пептиди та ліпіди захищають плазмідну ДНК під час ультразвуку.

Стабільність плазмідної ДНК та нанокомплексів плазмідної ДНК/ІЛ проти ультразвукового зсувного стресу була досліджена за допомогою аналізу електрофорезу агарозного гелю. Як плазмідна ДНК, так і плазмідні ДНК / нанокомплекси IL піддавалися ультразвуковому зсуву протягом різних часових точок. Плазмідна ДНК піддавалася ультразвуковому зсуву протягом 0, 10, 20, 30 і 40 хвилин. Однак плазмідні нанокомплекси ДНК / ІЛ піддавалися ультразвуковому зсуву протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 і 120 хвилин.
(дослідження і фото: ©Саркер та ін., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрували, що коли плазмідні ДНК / іонні рідкі (pDNA / IL) наноструктури піддавалися ультразвуковому зсуву протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 і 120 хв і комплексувалися з комерційно доступним агентом доставки катіонних генів ліпофектаміном, відсоток флуоресцентних позитивних клітин становив 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% і 50% відповідно (див. графік нижче). Відсоток флуоресцентних позитивних клітин збільшувався, коли наноструктури піддавалися ультразвуковому зсувному стресу протягом 10 і 20 хв, а після цього знижувалися повільно.

Вплив іонної рідини [Bmim][PF6] на доставку плазмідної ДНК до клітин COS7. Плазмідні нанокомплекси ДНК / ІЛ (іонна рідина) піддавалися ультразвуковому зсувному стресу до 120 хвилин і комплексувалися з LA перед доставкою в клітини COS7. Дані показують середню кількість (%) GFP позитивних клітин HeLa, підрахованих у 10 різних мікроскопічних полях, і експеримент проводився кілька разів у три різні дні. (Дослідження та діаграма: ©Саркер та ін., 2019)

Ультразвукова підготовка лізату

Протокол ультразвукового лізису клітин
Почніть зі збагаченого зразка клітин, який був підготовлений за допомогою методу поділу клітин (наприклад, імуномагнітне розділення клітин, сортування клітин, активованих флуоресценцією (FACS), центрифугування градієнтом щільності, виділення клітин з імуноденситетом).
Зразки клітин повинні показувати об'єм лізисного буфера, який відповідає експериментальній меті, та ультразвукового типу зонда.
Перевага надається гіпотонічним буферам, оскільки вони посилюють лізис ультразвукових клітин. Важливо, щоб добавки і концентрація солі використовувалися відповідним чином.
Виберіть свій ультразвуковий пристрій лізису: Для непрямої ультразвукової обробки флаконів рекомендується VialTweeter або CupHorn. Для мультиплощинних пластин UIP400MTP є ідеальним ультразвуковим апаратом. І класична ультразвукова обробка типу зонда, ультразвуковий гомогенізатор як UP100H або UP200Ht з мікронаконечником найбільш підходящі.
Протокол ультразвукової обробки типу зонда: Помістіть зонд ультразвукового пристрою в об'єм зразка в мікроцентрифужну трубку і ультразвукову обробку приблизно 10 секунд. Залежно від зразка ДНК, ультразвукова обробка може повторюватися ще один або два рази. Необхідний вхід ультразвукової енергії (Ws / мл) залежить від в'язкості зразка та типу ДНК. Охолодження через крижану ванну та пульсаційний режим ультразвукового пристрою допомагає запобігти термічній деградації зразка.
Після ультразвукового лізису зразок центрифугують для відділення залишків гранул (що містять нелізовані клітини, ядра та нелізовані органели)
Якщо зразок відразу не обробити далі, його можна зберігати при відповідній температурі для збереження його життєздатності.

Ультразвукові пристрої для фрагментації ДНК

Hielscher Ультразвук пропонує різні ультразвукові платформи для фрагментації ДНК, РНК та хроматину. Ці різні платформи включають ультразвукові зонди (сонотроди), рішення непрямої ультразвукової обробки для одночасного зразка приготування декількох трубок або багатофункціональних пластин (наприклад, 96-лужні пластини, пластини мікротітерів), сонореактори та ультразвукові чашки. Всі платформи для зсуву ДНК живляться від частотно налаштованих, високопродуктивних ультразвукових процесорів, які точно контролюються і забезпечують відтворювані результати.

Ультразвукові процесори для будь-якого зразка номер і розмір

З мульти-зразковими ультразвуковими пристроями Hielscher VialTweeter (до 10 пробірок) і UIP400MTP (для мікропластин / мультиплощинних пластин) стає легко можливим скоротити час обробки зразка завдяки інтенсивному і точно контрольованому ультразвуку, отримуючи бажаний розподіл і вихід фрагмента ДНК. Ультразвукова фрагментація ДНК робить етапи підготовки плазміди ефективними, надійними та масштабованими. Протоколи можуть бути лінійно масштабовані від однієї до численних вибірок шляхом застосування постійних ультразвукових параметрів.
Зондові ультразвукові апарати з одним-п'ятьма пальцями ідеально підходять для підготовки менших чисел зразків. Лабораторні ультразвукові апарати Hielscher доступні з різними рівнями потужності, щоб ви могли вибрати ідеальний ультразвуковий руйнівник для вашого застосування, пов'язаного з ДНК.