Приготування плазмід за допомогою ультразвукової обробки

Ультразвукова обробка є надійною технікою для фрагментації плазмідної ДНК. Точно контрольовані амплітуда, режим імпульсної дії та контроль температури є найважливішими характеристиками ультразвукового апарату для фрагментації плазмід без пошкоджень. Крім того, використання певних агентів допомагає захистити від деградації плазмід. Hielscher Ultrasonics пропонує різні рішення для контрольованої фрагментації плазмід від окремих флаконів, одночасної ультразвукової обробки численних зразків, а також багатолуночних планшетів. Дізнайтеся більше про успішну ультразвукову фрагментацію плазмід!

Зрізання плазмід за допомогою ультразвукової обробки

Коли зразки ДНК піддаються дії ультразвукових хвиль, вібрації, створені ультразвуком, створюють акустичну кавітацію в рідині, яка зрізає або руйнує молекули ДНК з високою молекулярною масою за допомогою механічних сил. Ультразвукова обробка є найбільш поширеним методом для експериментів зі зрізання ДНК у великих обсягах, включаючи такі застосування, як імунопреципітація хроматину (ChIP), для яких малі розміри фрагментів є абсолютно критичними для отримання високої роздільної здатності. (пор. Tseng et al., 2012)
Плазмідна ДНК (pDNA) є специфічною формою ДНК, що характеризується кільцевою формою, і зустрічається у бактерій та деяких еукаріотів.
Суперскручена pDNA є бажаною формою плазмідної ДНК, оскільки вона демонструє найкращі результати у наступних процесах, таких як автоматизоване секвенування та трансформація. Ультразвукова обробка підходить для успішної фрагментації pDNA, включаючи суперскручену pDNA.
Thompson et al. (2008) продемонстрували, що ультразвукова обробка плазмід, яка, як відомо, фрагментує суперскручену ДНК, є ефективним способом покращити довжину прочитаного послідовності phred20 до такого рівня, що вони не відрізняються значно від контрольних шаблонів Beckman Coulter або ферментативно лінеаризованих плазмід.

Використання плазмідних векторів

Плазміди часто використовуються як інструменти для клонування, перенесення та маніпулювання генами. Коли плазміди використовуються експериментально для цих цілей, їх називають векторами. Фрагменти ДНК або гени можуть бути вставлені в плазмідний вектор, створюючи так звану рекомбінантну плазміду. Плазмідні вектори використовуються як транспортні засоби для доставки рекомбінантної ДНК у клітину-хазяїна та є ключовим компонентом молекулярного клонування.
“Невірусні вектори активно вивчаються щодо їх потенційного використання у генній терапії для лікування різних складних захворювань. Невірусні вектори захищають плазмідну ДНК від фізичної, хімічної та ферментативної деградації та доставляють молекулу ДНК у цільове місце. Наприклад, катіонні ліпосоми, хітозан та інші позитивно заряджені наночастинки утворюють комплекси з плазмідною ДНК через електростатичні взаємодії. Однак легко утворені комплекси катіонних ліпосом/плазмідної ДНК є відносно великими (тобто 300–400 nm) та гетерогенними за природою, що ускладнює їх використання у фармацевтичних застосуваннях. Великі та гетерогенні комплекси плазмідної ДНК/ліпосом, плазмідної ДНК/аерозолів та плазмідної ДНК/пептидів можуть бути зменшені до менших та однорідних частинок за допомогою ультразвукової обробки.” (Sarker et al., 2019)
Яскравим прикладом використання плазмідних векторів є CRISPR–Cas9. Система CRISPR–Cas9 зазвичай доставляється у клітини у вигляді однієї великої плазміди або кількох менших плазмід, які кодують цільову послідовність, гід CRISPR та Cas9.

Ультразвукове приготування наночастинок PLGA, навантажених ДНК, методом нанопреципітації

Jo et al. (2020) використовували полі(лактид-ко-гліколід) (PLGA) для формування наночастинкового носія для доставки модельної CRISPR–Cas9 плазміди в первинні макрофаги, отримані з кісткового мозку. Для нанопреципітації наночастинок PLGA використовували PLGA з двома різними кінцевими групами (естерні та аміногрупи) з метою, щоб позитивно заряджені амінові кінцеві групи збільшували ефективність інкапсуляції та навантаження завдяки зарядовим взаємодіям між ними та негативно зарядженою основою ДНК. У 50 mL поліпропіленовій конічній центрифужній пробірці 100 mg Pluronic F127 розчиняли в 20 mL автоклавованої діонізованої води шляхом вібраційного змішування, після чого проводили 30 min м’якої ультразвукової обробки за допомогою ультразвукової ванни (див. CupHorn). Додавали автоклавовану магнітну мішалку, і розчин змішували при 600 об/хв протягом 30 хв, поки готували інші розчини. Натомість скляного посуду використовували пластиковий лабораторний посуд, щоб мінімізувати неспецифічну адсорбцію ДНК. Розчини PLGA, розчиненого в ДМФА (44,48 мг/мл), та TIPS-пентацену, розчиненого в ТГФ (0,667 мг/мл), готували окремо. PLGA залишали в спокої для змочування в ДМФА протягом 30 хв перед ультразвуковою обробкою протягом 30 хв. (для повного протоколу див. Jo et al., 2020)

Захист плазмідної ДНК під час ультразвукової обробки

ДНК, включаючи плазміди та суперскручені плазміди, дуже чутлива до деградації. Усі доступні методи фрагментації відомі певними недоліками. Ультразвукова фрагментація ДНК є одним із переважних методів, оскільки контрольована ультразвукова обробка в поєднанні із захисними заходами дозволяє зменшити пошкодження ланцюгів ДНК, спричинені зсувом та нагріванням.
Крім налаштувань низької амплітуди, режиму імпульсної дії та контролю температури під час ультразвукового зсуву ДНК, використання певних агентів показало значний захисний ефект проти деградації ДНК. Наприклад, різні полімери, пептиди та ліпіди захищають плазмідну ДНК під час ультразвукової обробки.

Стабільність плазмідної ДНК та наноконкомплексів плазмідної ДНК/ІЛ проти ультразвукового зсувного напруження досліджували за допомогою аналізу агарозного гель-електрофорезу. Як плазмідну ДНК, так і наноконкомплекси плазмідної ДНК/ІЛ піддавали ультразвуковому зсувному напруженню протягом різних проміжків часу. Плазмідну ДНК експонували до ультразвукового зсувного напруження протягом 0, 10, 20, 30 та 40 хвилин. Однак наноконкомплекси плазмідної ДНК/ІЛ експонували до ультразвукового зсувного напруження протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 та 120 хвилин.
(дослідження та зображення: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) продемонстрували, що коли наноструктури плазмідної ДНК / іонної рідини (pDNA/IL) піддавали ультразвуковому зсувному напруженню протягом 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 та 120 хв і комплексували з комерційно доступним катіонним агентом доставки генів ліпофектаміном, відсоток флуоресцентно позитивних клітин становив 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% та 50% відповідно (див. діаграму нижче). Відсоток флуоресцентно позитивних клітин зростав, коли наноструктури піддавали ультразвуковому зсувному напруженню протягом 10 та 20 хв, а потім повільно зменшувався.

Вплив іонної рідини [Bmim][PF6] на доставку плазмідної ДНК у клітини COS7. Наноконкомплекси плазмідної ДНК/ІЛ (іонна рідина) піддавали ультразвуковому зсувному напруженню до 120 хвилин і комплексували з LA перед доставкою в клітини COS7. Дані показують середню кількість (%) GFP-позитивних клітин HeLa, підрахованих у 10 різних мікроскопічних полях, і експеримент проводили багато разів у три різні дні. (Дослідження та діаграма: ©Sarker et al., 2019)

Приготування лізату за допомогою ультразвуку

Протокол ультразвукового руйнування клітин
Почніть з збагаченого зразка клітин, підготовленого методом розділення клітин (наприклад, імуномагнітне розділення клітин, сортування клітин, активоване флуоресценцією (FACS), центрифугування в градієнті щільності, імунощільне виділення клітин).
Зразки клітин повинні мати об’єм лізисного буфера, що відповідає експериментальній меті та ультразвуковому апарату з зондом.
Перевагу надають гіпотонічним буферам, оскільки вони посилюють ультразвукове руйнування клітин. Важливо, щоб добавки та концентрація солі використовувалися належним чином.
Виберіть пристрій для ультразвукового лізису: Для непрямої ультразвукової обробки флаконів рекомендовані VialTweeter або CupHorn. Для мікропланшетів ідеальним ультразвуковим апаратом є UIP400MTP. А для класичної ультразвукової обробки з зондом найбільш підходять ультразвукові гомогенізатори, такі як UP100H або UP200Ht з мікротипом.
Протокол для ультразвукової обробки з зондом: Помістіть зонд ультразвукового апарату в об’єм зразка в мікроцентрифужній пробірці та піддайте ультразвуковій обробці приблизно 10 секунд. Залежно від зразка ДНК, ультразвукову обробку можна повторити ще один або два рази. Необхідний вхід ультразвукової енергії (Ws/mL) залежить від в’язкості зразка та типу ДНК. Охолодження через крижану ванну та імпульсний режим ультразвукового апарату допомагають запобігти термічній деградації зразка.
Після ультразвукового лізису зразок центрифугують для відокремлення осаду (що містить неруйновані клітини, ядра та неруйновані органели)
Якщо зразок не обробляється негайно далі, його можна зберігати при відповідній температурі для збереження його життєздатності.

Ультразвукові апарати для фрагментації ДНК

Hielscher Ultrasonics пропонує різноманітні платформи на основі ультразвуку для фрагментації ДНК, РНК і хроматину. Ці платформи включають ультразвукові зонди (сонотроди), рішення для непрямої ультразвукової обробки для одночасної підготовки зразків у кількох пробірках або багатолуночних планшетах (наприклад, 96-луночних планшетах, мікротитраційних планшетах), сонореактори та ультразвукові чашкові сонотроди (cuphorns). Усі платформи для зсувної фрагментації ДНК працюють від високопродуктивних ультразвукових процесорів із налаштованою частотою, які забезпечують точне керування та відтворювані результати.

Ультразвукові процесори для будь-якої кількості та розміру зразків

Завдяки багатозразковим ультразвуковим апаратам Hielscher VialTweeter (для до 10 пробірок) та UIP400MTP (для мікропланшетів/багатолункових планшетів) стає легко можливим скоротити час обробки зразків завдяки інтенсивній та точно контрольованій ультразвуковій обробці, отримуючи бажаний розподіл розмірів фрагментів ДНК та вихід. Ультразвокова фрагментація ДНК робить етапи підготовки плазмід ефективними, надійними та масштабованими. Протоколи можна лінійно масштабувати від одного до численних зразків, застосовуючи постійні параметри ультразвуку.
Зондові ультразвукові апарати з одним-п’ятьма пальцями ідеально підходять для підготовки меншої кількості зразків. Лабораторні ультразвукові апарати Hielscher доступні з різними рівнями потужності, тому ви можете вибрати ідеальний ультразвуковий руйнівник для вашого застосування, пов’язаного з ДНК.