Ультразвукова пробопідготовка з використанням фільтрів (FASP): удосконалення протеомних робочих процесів завдяки передовій ультразвуковій обробці

Ультразвукова пробопідготовка з використанням фільтрів (FASP) набуває поширення як високоефективний і відтворюваний метод у сучасній протеоміці. Інтегруючи контрольовану ультразвукову обробку в усталені робочі процеси FASP, дослідники можуть значно покращити екстракцію білків, ефективність їх розщеплення та загальну якість даних. Зі зростанням попиту на високопродуктивну й відтворювану пробопідготовку апарати для фокусованої ультразвукової обробки, зокрема ультразвуковий апарат для мікропланшетів UIP400MTP, набувають дедалі більшого наукового та практичного значення.

Науковий контекст: чому FASP важлива для протеоміки

Пробопідготовка з використанням фільтрів (FASP) стала золотим стандартом у протеоміці «знизу вгору» завдяки здатності видаляти детергенти, солі та інші забруднювальні речовини й водночас забезпечувати ефективне ферментативне розщеплення. Однак класичні протоколи FASP часто мають обмеження, пов’язані з неповним лізисом, нерівномірним розщепленням і варіабельністю зразків – особливо під час роботи зі складними або стійкими до руйнування біологічними клітинами чи тканинами.
Саме тут сфокусована ультразвукова енергія (ультразвукова обробка) забезпечує вирішальну перевагу. Створюючи механічні зсувні сили та кавітацію, ультразвукова обробка покращує низку критично важливих етапів робочого процесу FASP без порушення цілісності білків.

Позитивний вплив ультразвукової обробки в ультразвуковій FASP

Ультразвукова обробка спричиняє контрольовану акустичну кавітацію – утворення та колапс мікроскопічних бульбашок, що породжує локальні зсувні сили й мікропотоки.
Ультразвукова обробка покращує як етап алкілування, так і етап розщеплення в ультразвуковій FASP завдяки поліпшенню масоперенесення та прискоренню кінетики реакцій. Застосування ультразвукової енергії спричиняє кавітацію, що призводить до виникнення локальних мікропотоків і короткочасних зсувних сил, які сприяють швидкому перемішуванню та ефективному проникненню реагентів у білкову матрицю або середовище фільтра. Під час алкілування це забезпечує рівномірнішу та швидшу модифікацію залишків цистеїну йодацетамідом. На етапі розщеплення ультразвукова обробка підвищує доступність ділянок протеолітичного розщеплення та покращує взаємодії між ферментом і субстратом, тим самим прискорюючи дію трипсину та підвищуючи ефективність розщеплення. Загалом ультразвукова обробка скорочує час обробки, зберігаючи або покращуючи повноту перебігу реакцій та їхню відтворюваність.

У пробопідготовці для протеоміки ультразвукова FASP забезпечує:

• Ефективніше руйнування клітин та екстракцію білків навіть у щільних тканинах або мікробних зразках
• Покращену солюбілізацію білків
• Покращену доступність субстратів для ферментів під час розщеплення
• Скорочення часу обробки та підвищення відтворюваності

На відміну від традиційних механічних або хімічних методів лізису, ультразвукова обробка добре піддається контролю та масштабуванню, що робить її особливо придатною для стандартизованих робочих процесів у протеоміці.

Переваги ультразвукової FASP порівняно з традиційними підходами

Інтеграція ультразвукової обробки в протоколи FASP забезпечує вимірювані переваги, які безпосередньо впливають на результати подальшого мас-спектрометричного аналізу.
Ультразвукова FASP забезпечує повніше вилучення білків, особливо зі складних зразків, таких як волокнисті тканини або біоплівки. Рівномірний розподіл енергії забезпечує однакову обробку повторних зразків, зменшуючи варіабельність – це ключова вимога кількісної протеоміки.
Крім того, ультразвукова обробка прискорює кінетику розщеплення завдяки покращенню взаємодії між ферментом і субстратом. Це часто скорочує час розщеплення та підвищує вихід пептидів зі збереженням покриття амінокислотних послідовностей.
З погляду організації робочого процесу ультразвукові системи зменшують потребу в ручних операціях та усувають необхідність в агресивній хімічній обробці, зберігаючи цілісність зразків і спрощуючи стандартизацію протоколів.

Діаграма Венна, що показує збільшення кількості ідентифікованих білків за допомогою ультразвукової FASP порівняно з FASP із нічною інкубацією
Зображення та дослідження: ©Carvalho et al., 2020

Протокол: високопродуктивна ультразвукова FASP із UIP400MTP

Для лабораторій, що обробляють великі серії зразків, ультразвуковий пристрій UIP400MTP для мікропланшетів забезпечує одночасну ультразвукову обробку стандартних багатолункових планшетів (наприклад, 96-лункових), значно підвищуючи продуктивність і відтворюваність.
У цьому форматі зразки (зазвичай 50–200 µL на лунку) готують безпосередньо в мікропланшетах, сумісних з ультрафільтрацією або подальшою обробкою. Буфери для лізису подібні до тих, що використовуються у стандартних протоколах FASP.

UIP400MTP рівномірно подає ультразвукову енергію до всіх лунок. Ультразвукову обробку зазвичай проводять за амплітуди 60–80% протягом 2–4 хвилин залежно від типу зразка. Контролюйте температуру за допомогою під’єднуваного датчика температури. Використовуйте імпульсну ультразвукову обробку та, за потреби, лабораторний чилер.

Приклад протоколу:

1. На етапі алкілування зразки піддають ультразвуковій обробці за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів (UIP400MTP) за амплітуди 40% протягом 7 циклів (30 s увімкнено, 15 s вимкнено; загальний час ультразвукової обробки: 5 min 45 s).
2. Після ультразвукової обробки розчин йодацетаміду (IAA) видаляють центрифугуванням. Перед розщепленням трипсином зразки необхідно промити, щоб видалити залишкову сечовину – сильний хаотропний агент, який пригнічує ферментативну активність. Тому зразки двічі промивають 200 μL розчину гідрокарбонату амонію (AmBic) концентрацією 25 mM.
3. Потім додають 100 μL розчину трипсину (співвідношення ферменту до білка 1:30), приготованого в розчині гідрокарбонату амонію концентрацією 12,5 mM. Далі розщеплення білків проводять за допомогою UIP400MTP за тих самих умов ультразвукової обробки (амплітуда 40%, 7 циклів, 30 s увімкнено / 15 s вимкнено; загальний час: 5 min 45 s).
4. Після ультразвукової обробки зразки переносять у фільтрувальні планшети або обробляють за допомогою планшетних систем FASP. Етапи відновлення й алкілування виконують безпосередньо в планшеті, зберігаючи раціональну організацію робочого процесу.
5. Розщеплення трипсином проводять у контрольованих умовах (наприклад, 37°C, 4–16 годин) із можливістю короткочасної ультразвукової стимуляції для прискорення ферментативної активності та підвищення виходу пептидів.
6. Пептиди виділяють центрифугуванням, після чого вони готові до аналізу LC-MS/MS.

Ключова перевага цієї системи полягає в її здатності забезпечувати ідентичні умови обробки в усіх лунках, мінімізуючи ефекти партій і уможливлюючи надійні кількісні порівняння в масштабних протеомних дослідженнях.

Проєктування, виробництво та консультування – якість із Німеччини

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі найвищими стандартами якості та конструкції. Міцність і простота експлуатації дають змогу безперешкодно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові установки. Ультразвукові апарати Hielscher легко справляються із суворими умовами та вимогливими середовищами.

Hielscher Ultrasonics – компанія, сертифікована за ISO, яка приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам із найсучаснішими технологіями та зручністю користування. Звісно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE, а також вимогам UL, CSA та RoHs.

Література / Джерела

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).