Підготовка зразків за допомогою ультразвукового фільтра (FASP): покращення робочих процесів протеоміки за допомогою вдосконаленої ультразвукової обробки
Підготовка зразків за допомогою ультразвукового фільтра (FASP) стає високоефективним і відтворюваним методом у сучасній протеоміці. Інтегруючи контрольовану ультразвукову обробку в усталені робочі процеси FASP, дослідники можуть значно покращити екстракцію білка, ефективність перетравлення та загальну якість даних. Зі збільшенням попиту на високопродуктивну та відтворювану підготовку зразків, сфокусовані ультразвукові пристрої, такі як мікропланшетний ультразвуковий пристрій UIP400MTP, набувають все більшої наукової та практичної актуальності.
Науковий контекст: Чому FASP важливий у протеоміці
Підготовка зразків за допомогою фільтрів (FASP) стала золотим стандартом у висхідній протеоміці завдяки здатності видаляти миючі засоби, солі та інші забруднювачі, забезпечуючи при цьому ефективне ферментативне розщеплення. Однак класичні протоколи FASP часто стикаються з обмеженнями, пов'язаними з неповним лізисом, непослідовним розщепленням і варіабельністю зразків. – особливо, коли маєш справу зі складними або стійкими біологічними клітинами чи тканинами.
Саме тут сфокусована ультразвукова енергія (ультразвукова обробка) забезпечує вирішальну перевагу. Впроваджуючи механічні сили зсуву та кавітацію, ультразвукова обробка покращує декілька важливих етапів робочого процесу FASP, не порушуючи цілісність білка.
Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP полегшує пробопідготовку з використанням фільтрів (FASP)
Позитивні ефекти ультразвукової обробки в ультразвуковому FASP
Ультразвукова обробка вводить контрольовану акустичну кавітацію – утворення та руйнування мікроскопічних бульбашок – що генерує локальні зсувні сили та мікропотоки.
Ультразвукова обробка покращує як етапи алкілування, так і травлення в ультразвуковому FASP, покращуючи масообмін і прискорюючи кінетику реакції. Застосування ультразвукової енергії генерує кавітацію, що призводить до локалізованого мікропотоку і перехідних зсувних сил, які сприяють швидкому змішуванню і ефективному проникненню реагентів в білкову матрицю або фільтруюче середовище. Під час алкілування це призводить до більш рівномірної та швидкої модифікації залишків цистеїну йодоацетамідом. На етапі травлення ультразвукова обробка збільшує доступність протеолітичних сайтів розщеплення та покращує взаємодію ферментів із субстратом, тим самим прискорюючи активність трипсину та підвищуючи ефективність травлення. В цілому, ультразвукова обробка скорочує час обробки, зберігаючи або покращуючи повноту і відтворюваність реакції.
У протеомічній підготовці зразків ультразвуковий FASP перекладається як:
- Більш ефективне руйнування клітин і екстракція білків навіть у твердих тканинах або мікробних зразках
- Покращена солюбілізація білків
- Покращена доступність ферментів під час травлення
- Скорочення часу обробки та підвищення відтворюваності
На відміну від звичайних механічних або хімічних методів лізису, ультразвукова обробка є високо контрольованою і масштабованою, що робить її особливо придатною для стандартизованих робочих процесів протеоміки.
Це UIP400MTP не ультразвукова ванна. Це чашковий рупор високої інтенсивності для цілеспрямованого ультразвуку. Цей потужний безконтактний звуковий апарат забезпечує рівномірне ультразвукове дослідження по всіх лунках стандартної колодязної пластини. У вас є точний контроль над амплітудою, потужністю та пульсацією. Вбудований таймер і датчик температури забезпечують стабільні результати. Пластинчастий звуковик UIP400MTP охолоджує зразки за допомогою водяної бані (зовнішній охолоджувач опціонально).
Переваги ультразвукової FASP над традиційними підходами
Інтеграція ультразвукової обробки в протоколи FASP забезпечує вимірювані переваги, які безпосередньо впливають на подальші результати мас-спектрометрії.
Ультразвукова FASP забезпечує більш повне відновлення білка, особливо зі складних зразків, таких як волокнисті тканини або біоплівки. Рівномірний розподіл енергії забезпечує послідовну обробку в усіх реплікаціях, зменшуючи варіабельність. – важлива вимога для кількісної протеоміки.
Крім того, ультразвукова обробка прискорює кінетику травлення за рахунок поліпшення взаємодії ферменту з субстратом. Це часто призводить до скорочення часу перетравлення та збільшення виходу пептидів, зберігаючи при цьому покриття послідовності.
З точки зору робочого процесу, ультразвукові системи зменшують ручне втручання і усувають необхідність агресивної хімічної обробки, зберігаючи цілісність зразків і спрощуючи стандартизацію протоколів.
Діаграма Венна показує збільшення кількості ідентифікованих білків за допомогою ультразвукового FASP порівняно з нічним FASP
Зображення та дослідження: ©Carvalho та ін., 2020
Багатолунковий планшетний ультразвуковий аналізатор UIP400MTP для фільтраційної підготовки проб (FASP)
Протокол: Високопродуктивний ультразвуковий FASP з UIP400MTP
Для лабораторій, що обробляють великі групи зразків, ультразвуковий пристрій для мікропланшетів UIP400MTP дозволяє одночасно обробляти ультразвуком стандартні багатолункові планшети (наприклад, 96-лункові), значно підвищуючи пропускну здатність і відтворюваність.
У цьому форматі зразки (зазвичай 50-200 мкл на лунку) готують безпосередньо в мікропланшетах, сумісних з ультрафільтрацією або подальшою обробкою. Буфери для лізису подібні до тих, що використовуються в стандартних протоколах FASP.
UIP400MTP застосовує рівномірну ультразвукову енергію у всіх лунках. Ультразвукова обробка зазвичай виконується при амплітуді 60-80% протягом 2-4 хвилин, в залежності від типу зразка. Контролюйте температуру за допомогою підключеного датчика температури. Використовуючи імпульсну ультразвукову обробку і, за бажанням, до лабораторного холодильника.
Зразковий протокол:
- Для етапу алкілування зразки обробляють ультразвуком за допомогою мікропланшетного ультразвукового пристрою (UIP400MTP) при 40% амплітуді протягом 7 циклів (30 с увімкнено, 15 с вимкнено; загальний час ультразвукової обробки: 5 хв 45 с).
- Після обробки ультразвуком розчин йодоацетаміду (IAA) видаляють центрифугуванням. Перед розщепленням трипсином зразки необхідно промити, щоб видалити залишкову сечовину, сильний хаотропний агент, який пригнічує ферментативну активність. Тому зразки двічі промивають 200 мкл 25 мМ бікарбонату амонію (AmBic).
- Потім додають 100 мкл розчину трипсину (співвідношення ферменту до білка 1:30), приготованого в 12,5 мМ бікарбонаті амонію. Потім розщеплення білка проводять за допомогою UIP400MTP за тих самих умов обробки ультразвуком (40% амплітуда, 7 циклів, 30 с увімкнено / 15 с вимкнено; загальний час: 5 хв 45 с).
- Після обробки ультразвуком зразки переносять на фільтрувальні пластини або обробляють за допомогою пластинчастих систем FASP. Етапи відновлення та алкілування виконуються на пластинах, що забезпечує оптимізацію робочого процесу.
- Розщеплення трипсину проводиться в контрольованих умовах (наприклад, 37°C, 4-16 годин), з можливістю короткої ультразвукової стимуляції для прискорення ферментативної активності та покращення виходу пептидів.
- Пептиди відновлюються центрифугуванням і готові до аналізу методом ЖХ-МС/МС.
Ключова перевага цієї системи полягає в її здатності забезпечувати ідентичні умови обробки в усіх лунках, мінімізуючи ефект партії і дозволяючи проводити надійні кількісні порівняння у великомасштабних протеомних дослідженнях.
Багатокамерний багатотрубний сокатор VialTweeter прискорює та покращує фільтраційну підготовку зразків (FASP) у протеоміці
Наукова актуальність
Інтеграція ультразвукової обробки в робочі процеси FASP - це не просто технічне вдосконалення – Він являє собою методологічний прогрес у підготовці зразків для протеоміки. Оскільки ця галузь рухається до вищої пропускної здатності, автоматизації та відтворюваності, ультразвукові технології вирішують фундаментальні проблеми в обробці зразків.
Останні дослідження все частіше підкреслюють важливість послідовної підготовки зразків для надійного виявлення біомаркерів та кількісної протеоміки. Ультразвукова FASP безпосередньо сприяє досягненню цієї мети, покращуючи ефективність екстракції, послідовність розщеплення і загальну надійність робочого процесу.
Крім того, масштабованість ультразвукових систем – від окремих віал з VialTweeter до повних мікропланшетів з UIP400MTP – відповідає зростаючому попиту як на дослідницькі, так і на великі когортні протеомні дослідження.
Отримайте сонікатор, щоб полегшити робочий процес FASP!
Підготовка зразків за допомогою ультразвукового фільтрування поєднує в собі перевірені переваги FASP з фізичними перевагами ультразвукової обробки. Посилюючи лізис, покращуючи перетравлення і стандартизуючи робочі процеси, ультразвукові системи пропонують потужне рішення для сучасної протеоміки.
Багатопробірковий сокатор VialTweeter і мікропланшетний сокатор UIP400MTP є прикладом того, як сфокусована ультразвукова енергія може перетворити рутинну підготовку зразків на більш ефективний, відтворюваний і науково обґрунтований процес. – що в кінцевому підсумку призводить до отримання більш якісних протеомних даних та глибшого біологічного розуміння.
Виберіть найбільш підходящий сокатор для підготовки зразків з фільтрацією
| Модель сонікатора | Переваги для FASP | Найкраще використання |
| UIP400MTP мікропланшетний ультразвуковий апарат | Рівномірна ультразвукова обробка всіх мікропланшетів; високо відтворювана енергія; прискорює алкілування і ферментативне розщеплення у високопродуктивних робочих процесах; сумісний з автоматизованою підготовкою зразків. | Високопродуктивні робочі процеси FASP в 96-лункових або аналогічних форматах планшетів, включаючи програми протеомного скринінгу. |
| VialTweeter Багатотрубний звуковий апарат | Одночасна, рівномірна ультразвукова обробка декількох закритих пробірок; мінімізує перехресне забруднення і втрату зразків; покращує проникнення і змішування реагентів, підвищуючи ефективність алкілування і розщеплення. | Паралельна обробка декількох зразків FASP з помірною пропускною здатністю і високою відтворюваністю. |
| Кугорн (непряма ультразвукова обробка “високоінтенсивна ванна” для герметичних пробірок) | Високоінтенсивна непряма ультразвукова обробка для герметичних посудин; відмінний контроль температури і обробка без забруднення; сприяє ефективному масообміну без прямого контакту з зондом. | Обробка зразків у різних контейнерах для зразків / чутливих або небезпечних зразків, що вимагають закритих контейнерів і рівномірного розподілу енергії. |
| Лабораторні зондові сонатори (пряма ультразвукова обробка) | Максимальна інтенсивність ультразвуку і передача енергії; швидке руйнування і прискорення реакції; ефективний для важкоперетравлюваних або дуже складних білкових зразків. | Обробка одного зразка, великих зразків або складних матриць, де потрібна максимальна потужність і швидкість. |
Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині
Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.
Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.
Поширені запитання
Для чого використовується фільтраційна пробопідготовка?
Фільтраційна пробопідготовка (FASP) використовується для підготовки зразків білків для протеомного аналізу на основі мас-спектрометрії. Він дозволяє ефективно видаляти миючі засоби, солі та інші низькомолекулярні забруднювачі, зберігаючи білки на молекулярно-масштабному фільтрі, де вони можуть бути денатуровані, відновлені, алкіловані та ферментативно перетворені в пептиди, придатні для аналізу методом ЖХ-МС/МС.
Які переваги FASP в протеоміці?
Основними перевагами FASP в протеоміці є здатність працювати зі складними і багатими на детергенти зразками, створюючи при цьому високочисті суміші пептидів, сумісні з мас-спектрометрією. Він покращує ефективність розщеплення і відтворюваність завдяки виконанню реакцій в обмеженому фільтруючому середовищі, зменшує втрати зразків порівняно з методами, що базуються на осадженні, і забезпечує ефективний буферний обмін. Загалом, FASP покращує відновлення пептидів, якість даних і покриття протеому, що робить його надійним і широко прийнятим робочим процесом у висхідній протеоміці.
Література / Список літератури
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Безконтактний сокатор UIP400MTP полегшує FASP в 96-лункових планшетах
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори з Лабораторії до промислові розміри.