Екстракція білка за допомогою ультразвуку для фосфопротеоміки

У сучасних науках про життя фосфопротеоміка стала наріжним каменем технології для розшифрування клітинних сигнальних шляхів і розуміння механізмів захворювань на системному рівні. Оскільки фосфорилювання регулює найважливіші біологічні функції – від активності ферментів до білок-білкових взаємодій – Його точне вимірювання має важливе значення як для фундаментальних досліджень, так і для трансляційної медицини. Останні досягнення в мас-спектрометрії дозволили ідентифікувати десятки тисяч подій фосфорилювання в одному експерименті, що підкреслює потребу в надійних, масштабованих і відтворюваних робочих процесах підготовки зразків.
Серед найвпливовіших розробок у цій галузі є впровадження екстракції білків за допомогою ультразвуку, що значно покращує якість зразків, пропускну здатність і відтворюваність. Ультразвукові технології, такі як VialTweeter і UIP400MTP, тепер переосмислюють те, як лабораторії працюють з великими групами зразків, особливо у високопродуктивній фосфопротеоміці.

Наукове значення ефективної пробопідготовки у фосфопротеоміці

Фосфорилювання білків - це високодинамічна та оборотна посттрансляційна модифікація, що впливає на більшість білків у клітинах людини. Він регулює структуру, локалізацію та мережі взаємодії білків, а його порушення пов'язане з такими захворюваннями, як рак та нейродегенерація.
Однак фосфопротеомний аналіз пов'язаний з унікальними технічними проблемами. Фосфорильовані пептиди часто мають низьку концентрацію і потребують ретельного збагачення та високоефективної попередньої підготовки зразків. Будь-яка неефективність під час екстракції або перетравлення білка може призвести до втрати сигналу, поганої відтворюваності та неповного покриття фосфозитом.
Саме тут ультразвукова обробка стає критично важливою.

Чому ультразвукова обробка змінює екстракцію білка

Ультразвукова обробка використовує ультразвукові хвилі високої інтенсивності для механічного руйнування клітин і тканин, що дозволяє ефективно вивільняти білки з клітин, тканин, біологічних рідин і позаклітинних везикул. Порівняно зі звичайними методами лізису, ультразвукова обробка має кілька явних переваг:

• По-перше, він забезпечує швидке і рівномірне руйнування клітин, що особливо важливо для збереження перехідних станів фосфорилювання. У фосфопротеоміці навіть незначні затримки або неповний лізис можуть змінити сигнальні профілі, що робить швидку і відтворювану екстракцію дуже важливою.
• По-друге, ультразвукова обробка покращує вихід білка та солюбілізацію, особливо для зразків, які важко піддаються розщепленню, таких як щільні тканини або клітини, багаті на мембрани. Це безпосередньо призводить до кращого перетравлення та відновлення фосфопептидів.
• По-третє, ультразвукова обробка за своєю суттю є масштабованою. Такі пристрої, як VialTweeter, дозволяють одночасно обробляти ультразвуком кілька герметичних пробірок, забезпечуючи ідентичні умови обробки для всіх зразків. Це усуває варіабельність, введену ручною обробкою.
• Для ще більш високих вимог до пропускної здатності, UIP400MTP являє собою великий технологічний стрибок. Він дозволяє обробляти ультразвуком цілі мікропланшети або штативи з пробірками, включаючи віали автосамплерів, що робить його ідеальним для паралельної обробки сотень зразків. Ця можливість особливо цінна в системній біології та клінічних дослідженнях, де великі когорти зразків є стандартними.

Високопродуктивна ультразвукова обробка: VialTweeter та UIP400MTP у фокусі

Інтеграція передових ультразвукових пристроїв у фосфопротеомні робочі процеси - це не просто зручність – це методологічне вдосконалення.
VialTweeter призначений для синхронізованої ультразвукової обробки декількох закритих флаконів, мінімізуючи перехресне забруднення і забезпечуючи відтворюваність. Він особливо підходить для застосувань із середньою пропускною здатністю і стандартизованими робочими процесами.
 

На відміну від нього, UIP400MTP оптимізований для високопродуктивних середовищ, що дозволяє:

• Рівномірна ультразвукова обробка для всіх стандартних мікропланшетів, наприклад, 96-лункових або 384-лункових планшетів
• Безпосередня обробка штативів для пробірок і віал для автосамплерів
• Значне скорочення практичного часу
• Покращена відтворюваність великих наборів даних

Така масштабованість ідеально узгоджується з сучасними підходами фосфопротеоміки, де робочі процеси зазвичай обробляють від десятків до сотень зразків паралельно.

Загальний протокол підготовки фосфопротеомних зразків за допомогою ультразвукової обробки

Надійний фосфопротеомний робочий процес інтегрує ефективне вилучення білка, ферментативне травлення та збагачення фосфопептидів. Наступний конспект відображає встановлені найкращі практики, адаптовані до підготовки на основі ультразвукової обробки:

1. Швидке гасіння та збір зразків
   Клітини або тканини швидко гасяться – зазвичай за допомогою швидкого заморожування – для збереження станів фосфорилювання. Цей крок є дуже важливим через швидкоплинність процесів фосфорилювання.
2. Ультразвуковий лізис клітин і видобуток білка
   Зразки розморожують і піддають обробці ультразвуком, як правило, в коротких циклах. Ультразвукова енергія руйнує клітинні мембрани і ефективно вивільняє білки. У перевірених робочих процесах ультразвукова обробка виконується в декількох циклах для забезпечення повного лізису.
   Приклад: Після розморожування зразків на льоду, лізис клітин досягався за допомогою ультразвукової обробки, наприклад, приладом Vialtweeter протягом 2 циклів, кожен цикл 1 хв.
3. Очищення та кількісне визначення білка
   Після лізису зразки центрифугують для видалення залишків. Надосадову рідину, що містить розчинні білки, збирають і кількісно визначають, щоб забезпечити однаковість вхідних даних для всіх зразків.
4. Відновлення та алкілування
   Дисульфідні зв'язки відновлюються (наприклад, за допомогою ДТТ) і алкілуються (наприклад, за допомогою ІАА) для стабілізації білків і підвищення ефективності травлення.
5. протеолітичне травлення
   Білки ферментативно перетравлюються, зазвичай трипсином, утворюючи пептиди, придатні для мас-спектрометричного аналізу. Дізнайтеся більше про ультразвукове прискорення перетравлення білка!
6. Очищення та знесолення пептидів
   Пептиди очищують за допомогою методів на основі C18 для видалення домішок, які можуть заважати аналізу методом ЖХ-МС.
7. збагачення фосфопептидами
   З огляду на низьку поширеність фосфорильованих пептидів, для селективного виділення фосфопептидів застосовують методи збагачення, такі як афінні методи Fe-NTA або TiO₂.
8. Аналіз та обробка даних за допомогою ЖХ-МС/МС
   Збагачені зразки аналізують за допомогою мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю, часто з використанням методу незалежного збору даних (DIA) для покращення кількісного визначення та відтворюваності.

Зокрема, великомасштабні робочі процеси можуть бути адаптовані до 96-лункових планшетів, що дозволяє паралельно обробляти до сотень зразків. – підхід, повністю сумісний з ультразвуковою обробкою на основі UIP400MTP.
 

Оптимізовано протокол для швидкого гасіння фосфопротеомів, збагачення фосфопептидів та Phos-DIA-MS.
Протокол та зображення: ©Die та ін. 2023

Підвищення відтворюваності та якості даних за допомогою ультразвукової обробки

Однією з головних проблем фосфопротеоміки є досягнення послідовного кількісного визначення у великих наборах даних. Варіабельність, внесена під час підготовки зразків, може приховати біологічно значущі відмінності.

Ультразвукова обробка вирішує це шляхом надання:

1. Стандартизоване споживання енергії в зразках
2. Зменшення варіативності ручної роботи
3. Покращена відтворюваність при екстракції та перетравленні білка

У поєднанні з високопродуктивними платформами, такими як UIP400MTP, лабораторії можуть досягти рівня узгодженості, необхідного для досліджень системної біології та виявлення клінічних біомаркерів.

Майбутнє фосфопротеоміки: Автоматизація та масштабованість

Оскільки фосфопротеоміка продовжує розширюватися в широкомасштабних і клінічних застосуваннях, попит на автоматизацію і пропускну здатність буде тільки зростати. Підготовка зразків за допомогою ультразвуку, особливо в поєднанні з системами, сумісними з мікропланшетами, є ключовою технологією, що дозволяє це зробити.
Поєднуючи ефективний ультразвуковий лізис, паралельну обробку і сумісність з автоматизованими робочими процесами, такі пристрої, як VialTweeter і UIP400MTP, встановлюють нові стандарти в підготовці зразків для протеоміки.
Дізнайтеся більше про інтеграцію UIP400MTP в автоматизовані робочі процеси лабораторії!

Скористайтеся перевагами ультразвукової підготовки зразків у фосфопротеоміці!

Екстракція білка за допомогою ультразвукової обробки стала найважливішим компонентом сучасної фосфопротеоміки, пропонуючи неперевершену ефективність, масштабованість та відтворюваність. Зі зростаючою потребою в аналізі складних біологічних систем у великих когортах зразків, ультразвукові технології не просто вигідні – вони необхідні.
Забезпечуючи високопродуктивні стандартизовані робочі процеси, такі рішення, як VialTweeter і UIP400MTP, прискорюють відкриття в галузі клітинної сигналізації, механізмів розвитку захворювань і точної медицини.

Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.

Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.

Hielscher Multi-Sample Sonicator моделі UIP400MTP для мікропланшетів, VialTweeter і CupHorn: високошвидкісна і високопродуктивна підготовка зразків