Депарафінізація та екстракція білка з FFPE
Полегшіть екстракцію білка зі зрізів тканин, фіксованих парафіном (FFPE), фіксованих формаліном, за допомогою оптимізованої комбінації депарафінізації, солюбілізації та ультразвуку за допомогою багатотрубного ультразвукового апарату VialTweeter. Цей протокол підтримує протеоміку на основі мас-спектрометрії та сумісний з робочими процесами очищення SP3 та ферментативного травлення.
Цей СОП призначений для персоналу лабораторій, який займається протеомним аналізом зразків тканин FFPE за допомогою високоефективної ультразвукової діагностики. Він оптимізований для до десяти зразків FFPE, оброблених паралельно за допомогою мультилампового сонікатора VialTweeter.
Звукорежисер VialTweeter для одночасного ультразвукового дослідження 10 зразків, наприклад, для лізису та екстракції білка зі зразків FFPE
Протокол: екстракція білка зі зразків FFPE за допомогою VialTweeter
Матеріали та реактиви
Реагенти
- Ксилол (ступінь гістології)
- Етанол (абсолют 96%)
- Буфер лізису:
- Інгібітор протеази (опціонально; наприклад, cOmplete™ mini EDTA-free)
6 М гуанідину гідрохлориду
50 мМ Tris-HCl, pH 8,5
10 мМ TCEP (трис(2-карбоксиетил)фосфін)
40 мМ CAA (2-хлорацетамід)
Обладнання
- Багатотрубний ультразвуковий апарат VialTweeter
- Мікроцентрифужні пробірки об'ємом 1,5 мл або 2,0 мл з низьким зв'язуванням
- Тепловий блок або інкубатор (налаштування 95°C і 80°C)
- Мікроцентрифуга
- Термоміксер (необов'язково, але рекомендується)
Приклад вхідних даних
- 1–2 ділянки тканини FFPE товщиною 10 мкм на зразок (тобто на флакон)
- Загалом ~100 мкг тканини на зразок (тобто на флакон)
або
Примітка: Використовуйте свіжі леза для мікротомії, щоб мінімізувати забруднення залишками парафіну.
Процедура
- депарафінізація
- Перенесіть секції FFPE у мікроцентрифужні пробірки з низьким вмістом зв'язування.
- Додайте 1 мл ксилолу, ненадовго вихоріть.
- Витримувати 10 хвилин при кімнатній температурі.
- Центрифугуйте при 14 000 × г протягом 2 хвилин; Викиньте супернатанта.
- Повторіть промивання ксилолом ще один раз (кроки 2–4).
- Промийте гранули 1 мл 96% етанолу, потім центрифугуйте при 14 000 × г протягом 2 хвилин. Викиньте супернатанта.
- Повторіть промивання етанолом ще раз (всього 2 промивання етанолом).
- Сушіть гранули на повітрі протягом 10 хвилин при кімнатній температурі з відкритими кришками, щоб випаруватися залишки етанолу.
- Екстракція білка та ультразвукова діагностика
- Додайте 200 мкл буфера лізису до кожної сухої гранули.
Примітка: Хоча ультразвуковий пристрій вміщує до 1 мл, 200 мкл є оптимальним для подальшої обробки. - Перемішуйте шляхом вихрування або делікатного піпетування.
- Додайте 200 мкл буфера лізису до кожної сухої гранули.
- Перша термічна інкубація
- Інкубують пробірки при температурі 95 °С протягом 30 хв, з перемішуванням при 400 об/хв за допомогою термоміксера або термоблоку.
- Дайте зразкам охолонути при кімнатній температурі протягом 5 хв.
- Перше УЗД за допомогою VialTweeter
- Помістіть трубки у VialTweeter.
- Встановіть VialTweeter UP200St на наведені нижче значення та проведіть звуковий звук.
- Друга термічна інкубація
Виймають пробірки і знову інкубують при температурі 95 °С протягом 15 хв, 400 об/хв. - Друге УЗД
Повторіть ультразвукове дослідження на VialTweeter з тими ж налаштуваннями (що зазначено вище) протягом додаткових 10 циклів (всього 15 хвилин). - Освітлення лізату
- Центрифугуйте зразки при дозі 13 000 × г протягом 10 хв при температурі 23 ° C (кімнатна температура).
- Обережно зберіть супернатант у нову трубку Safe-lock Eppendorf об'ємом 2,0 мл. Уникайте порушення гранули.
- Подальша обробка
Тепер лізат готовий до очищення SP3 та ферментативного травлення.
• Встановіть амплітуду (А) на 100%
• Встановіть режим пульсації (C) на 100%
• Годинник для місячних: увімкнено
• Вчасно: 60-ті рр.
• Час вимкнення: 30 с
• Граничне значення: 15 хв (відповідає 10 циклам)
(Примітка до розрахунку: (60 с увімкнено + 30 с вимкнено) × 10 циклів = 900 с = 15 хв)
Hielscher VialTweeter з 10 трубками Еппендорфа
Примітки та практичні поради
- Ризик перегріву під час ультразвуку зменшується завдяки запрограмованому циклічному ввімкненню/вимкненню.
- Уникайте вихрового постсоніка, щоб запобігти агрегації білка.
Утилізація відходів та безпека
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових апаратів лабораторного розміру:
| Рекомендовані пристрої | Об'єм партії | Витрата |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96-лунковий пластинчастий звуковий апарат | Багатолункові / мікротитрові пластини | Н.А. |
| Ультразвуковий CupHorn | CupHorn для флаконів або мензурки | Н.А. |
| GDmini2 | Ультразвуковий мікропотоковий реактор | Н.А. |
| VialTweeter | 0від .5 до 1.5 мл | Н.А. |
| UP100H | Від 1 до 500 мл | Від 10 до 200 мл/хв |
| UP200Ht, UP200St | Від 10 до 1000 мл | Від 20 до 200 мл/хв |
| UP400St | Від 10 до 2000 мл | Від 20 до 400 мл/хв |
| Ультразвуковий шейкер для сита | Н.А. | Н.А. |
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори для змішування, диспергування, емульгування та екстракції в лабораторних, пілотних та промислових масштабах.
Література / Список літератури
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Поширені запитання
Чому зразки тканин фіксуються як FFPE?
Консервація з фіксованим парафіном (FFPE) стабілізує морфологію тканин і білкові структури шляхом утворення ковалентних поперечних зв'язків за допомогою формальдегіду. Вбудовування в парафін забезпечує тривале зберігання при кімнатній температурі зі збереженням гістологічної та молекулярної цілісності для ретроспективних аналізів.
Як депарафінізувати зразки FFPE?
Депарафінізація передбачає послідовні промивання розчинниками для видалення парафіну: зазвичай дві інкубації з ксилолом, а потім дві промивки з етанолом (96%). Після центрифугування і сушіння тканина готова до подальшої екстракції. Цей процес відновлює доступність зразка для лізису та ферментативного травлення.
З якою метою проводиться термічна інкубація?
Термічна інкубація відноситься до контрольованого впливу на зразок певної температури протягом певного періоду часу для індукції біохімічних або фізичних змін. У протеоміці він зазвичай використовується для денатурації білків, зворотних формальдегідних поперечних зшивок у тканинах FFPE або підвищення ефективності буфера лізису. Температура та тривалість є критичними параметрами, адаптованими до цільової реакції або типу зразка.
Що таке травлення SP3?
Одногорщикова твердофазна підсилена підготовка зразків (SP3) — це робочий процес протеоміки на основі кульок. Він використовує парамагнітні кульки для зв'язування білків, забезпечуючи ефективне очищення, концентрацію та ферментативне травлення в умовах денатурації. SP3 мінімізує втрати зразків і добре сумісний зі зразками з низьким входом і FFPE.
Hielscher Ultrasonics виробляє високоефективні ультразвукові гомогенізатори з Лабораторії до промислові розміри.