Депарафінізація та екстракція білків з FFPE

Полегшіть екстракцію білків з тканинних зрізів, зафіксованих формаліном та залитих парафіном (FFPE), використовуючи оптимізовану комбінацію депарафінізації, розчинення та ультразвукової обробки з багатотрубним ультразвуковим обробником VialTweeter. Цей протокол підтримує подальшу протеоміку на основі мас-спектрометрії та сумісний з процесами очищення SP3 та ферментативного травлення.

Цей SOP призначений для лабораторного персоналу, залученого до протеомного аналізу зразків тканин FFPE з використанням високоефективної ультразвукової обробки. Він оптимізований для обробки до десяти зразків FFPE паралельно за допомогою багатотрубного ультразвукового обробника VialTweeter.

Протокол: Екстракція білків із зразків FFPE за допомогою VialTweeter

Матеріали та реагенти

Реагенти

• Ксилол (гістологічний клас)
• Етанол (абсолютний 96%)
• Буфер для лізису:

6 M Guanidine hydrochloride
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• Інгібітор протеази (необов’язково; напр., cOmplete™ mini EDTA-free)

Обладнання

• Багатотрубний ультразвуковий обробник VialTweeter
• Мікроцентрифужні пробірки з низькою адсорбцією об’ємом 1,5 mL або 2,0 mL
• Термоблок або інкубатор (налаштування 95°C та 80°C)
• Мікроцентрифуга
• Термоміксер (необов’язково, але рекомендовано)

Вхідні дані зразка

• 1–2 зрізи тканини FFPE товщиною 10 µm на зразок (тобто на пробірку)

АБО

• Загальна кількість ~100 µg тканини на зразок (тобто на пробірку)

Примітка: Використовуйте нові леза для мікротомії, щоб мінімізувати забруднення залишками парафіну.

Процедура

1. Депарафінізація
   1. Перенесіть зрізи FFPE в мікроцентрифужні пробірки з низькою адсорбцією.
   2. Додайте 1 mL ксилолу, коротко перемішайте в вортексі.
   3. Інкубуйте 10 хвилин при кімнатній температурі.
   4. Центрифугуйте при 14 000 × g протягом 2 хвилин; видаліть супернатант.
   5. Повторіть промивання ксилолом ще один раз (кроки 2–4).
   6. Промийте осад 1 mL 96% етанолу, перемішайте в вортексі, потім центрифугуйте при 14 000 × g протягом 2 хвилин. Видаліть супернатант.
   7. Повторіть промивання етанолом ще один раз (всього 2 промивання етанолом).
   8. Підсушіть осад на повітрі протягом 10 хвилин при кімнатній температурі з відкритими кришками, щоб випарувати залишковий етанол.
2. Екстракція білків та ультразвукова обробка
   1. Додайте 200 µL буфера для лізису до кожного сухого осаду.

      Примітка: Хоча ультразвуковий обробник вміщує до 1 mL, 200 µL є оптимальним для подальшої обробки.

   2. Перемішайте за допомогою вортексу або обережного піпетування.
3. Перше термічне інкубування
   1. Інкубуйте пробірки при 95 °C протягом 30 хв з перемішуванням при 400 rpm за допомогою термоміксера або термоблоку.
   2. Дайте зразкам охолонути при кімнатній температурі протягом 5 хв.
4. Перша ультразвукова обробка за допомогою VialTweeter
   1. Помістіть пробірки в VialTweeter.
   2. Встановіть значення для VialTweeter UP200St, наведені нижче, та проведіть ультразвукову обробку.
Налаштування ультразвукового обробника
• Встановіть амплітуду (A) на 100%
• Встановіть режим пульсації (C) на 100%
• Періодичний годинник: Увімкнено
• Час увімкнення: 60s
• Час вимкнення: 30s
• Обмежувальне значення: 15 min (відповідає 10 циклам)
(Примітка щодо розрахунку: (60 s On + 30 s Off) × 10 cycles = 900 s = 15 min)
5. Друге термічне інкубування
   Вийміть пробірки та інкубуйте знову при 95 °C протягом 15 хв, 400 rpm.
6. Друга ультразвукова обробка
   Повторіть ультразвукову обробку на VialTweeter, використовуючи ті самі налаштування (як вище), ще 10 циклів (всього 15 хв).
7. Освітлення лізату
   1. Центрифугуйте зразки при 13 000 × g протягом 10 хв при 23°C (кімнатна температура).
   2. Обережно зберіть супернатант у нову пробірку Eppendorf Safe-lock об’ємом 2,0 mL. Уникайте порушення осаду.
8. Подальша обробка
   Лізат тепер готовий для очищення SP3 та ферментативного травлення.

Примітки та найкращі практики

1. Ризик перегрівання під час ультразвукової обробки зменшується за допомогою програмованого циклування УВІМК/ВИМК.
2. Уникайте вортексування після ультразвукової обробки, щоб запобігти агрегації білків.

Утилізація відходів та безпека

Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність обробки наших ультразвукових обробників лабораторного розміру: