Протокол з використанням мультизразкових ультразвукових апаратів Hielscher у біоплівковому та протеомному аналізі

Використання багатопробних сонікатів, таких як VialTweeter Multi-Tube Sonicator і UIP400MTP Microplate Sonicator, оптимізує лабораторні робочі процеси для додатків з високою продуктивністю. Обидва пристрої дозволяють проводити точну та одноманітну ультразвукову обробку кількох зразків, мінімізуючи варіативність та підвищуючи відтворюваність. Це особливо вигідно в експериментах, що вимагають послідовного лізису зразків, відшарування біоплівки, екстракції білка або протеолітичного травлення, де ручні або одноразові методи менш ефективні і схильні до неузгодженості.

Оптимізуйте робочі процеси за допомогою багатовибіркових звукорежисерів

Наприклад, UIP400MTP дозволяє проводити одночасну ультразвукову обробку лунок мікропластин, забезпечуючи рівномірне відокремлення біоплівок або клітинного матеріалу. Тим часом, VialTweeter забезпечує точний лізис і гомогенізацію кількох зразків пробірок без перехресного забруднення. Ці ультразвукові апарати значно скорочують час обробки, покращують експериментальну відтворюваність і підтримують високу цілісність зразків, що робить їх незамінними інструментами в дослідженнях мікробіології, протеоміки та молекулярної біології.
Нижче наведено детальний протокол, що ілюструє використання моделей мультизразкових ультразвукових апаратів Hielscher, багатотрубного Sonicator VialTweeter та UIP400MTP Microplate Sonicator у дослідженні, що включає формування біоплівки E. coli та подальший протеомний аналіз.

Протокол: Формування, відшарування біоплівки та протеомний аналіз за допомогою мультизразкових ультразвукових апаратів Hielscher

1. Підготовка бактеріального посіву

• Культура бактерій E. coli (штам W3110) при температурі 30°С, температурі, сприятливій для утворення біоплівки E. coli, в середовищі триптонного відвару (ТБ) містить:
  – 10 г/л триптону
  – 5 г/л NaCl
• За необхідності доповнюйте антибіотики, щоб забезпечити затримку плазмід.
• Для мікроскопії та вивчення активності промотора використовують штам W3110 E. coli з геномним посиленим репортером GFP (eGFP) під контролем промотора rplL.
• Використовуйте плазміди репортерів GFP для різних промоутерів (наприклад, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) для вимірювання активності промоутерів.

2. Культивування та відшарування біоплівки

• Висівають 1,5 мл розведеної бактеріальної культури на лунку в 12-лункову пластину (CellStar 12-лункові пластини, Greiner Bio-One).
• Інкубують, щоб утворилася біоплівка.
• Видаляйте планктонну (не прилиплу) культуру обережно.

– Кожну лунку промийте 500 мкл PBS.
– Від'єднайте прикріплені клітини, пройшовши ультразвукове дослідження 12-лункової пластини в UIP400MTP мікропланшетному ультразвуковому апараті. UIP400MTP забезпечує рівномірне від'єднання, доставляючи постійну ультразвукову енергію через усі свердловини.
– Налаштування звуку: 60% амплітуди, режим циклу: 60 сек ON / 30 sec OFF.

3. Збирання та лізис клітин

• Центрифугою відокремлюють клітини біоплівки на 4500 г протягом 5 хвилин.
• Гранульовані клітини промийте ПБС.
• Ресуспендуйте клітини в 100 мкл 2% лауроілсаркозинату натрію (SLS) та інкубуйте при 95 °C протягом 15 хвилин.
• Проведіть ультразвук за допомогою багатотрубного соніка VialTweeter для забезпечення повного лізису клітин.
  – Налаштування звуку: 100% амплітуда, 50 с ON / 10 с OFF протягом 10 хв загальний час роботи; Зберігайте зразки на льоду.

4. Відновлення та алкілування

• Додайте 5 мМ трис(2-карбоксіетил)фосфіну (TCEP) для зменшення дисульфідних зв'язків і інкубуйте при 95 °C протягом 15 хвилин.
• Алкілатні білки з йодоацетамідом 10 мМ протягом 30 хвилин при 25 °C.

5. Кількісне визначення та травлення білка

• Центрифуга лізує для очищення від сміття.
• Кількісно оцініть загальний вміст білка за допомогою набору для аналізу білка Pierce BCA.
• Перетравіть 50 мкг загального білка з 1 мкг трипсину в розчині, що містить 2% SLS і 100 мМ бікарбонату амонію.
• Реакція інкубованого травлення протягом ночі при температурі 30 °C.

6. Очищення пептидами

• Осадіть SLS, додавши 1,5% трифтороцтової кислоти (TFA), а потім центрифугуючи.
• Очищають пептиди за допомогою колонок з мікроспіном С18.
• Висушують очищені пептиди і ресуспендують в 0,1% ТЖК.

7. Рідинна хроматографія-мас-спектрометрія (LC-MS/MS)

• Аналізуйте пептиди на мас-спектрометрі Q-Exactive Plus у поєднанні з наносистемою Ultimate 3000 RSLC.
• Розділяйте пептиди за допомогою колонки ВЕРХ зворотної фази (75 мкм × 42 см), упакованої смолою С18 (2,4 мкм).
• Наносити градієнт від 2% до 35% розчинника В (ацетонітрил з 0,15% мурашиної кислоти) протягом 140 хвилин.
• Отримуйте дані за допомогою сканування з високою роздільною здатністю МС з подальшим тандемним скануванням МС/МС 10 найінтенсивніших іонів.

8. Аналіз даних

• Обробляйте необроблені LC-MS дані за допомогою програмного забезпечення Progenesis.
• Експортуйте файли .mgf та аналізуйте їх за допомогою MASCOT.
• Виконайте кількісне визначення пептидів за допомогою SafeQuant для контролю якості та коригування помилкового виявлення.
• Проводьте всі експерименти в двох або трьох примірниках, щоб забезпечити відтворюваність.

Мультипробовідбірники для високопродуктивної підготовки зразків

Багатовибіркові моделі ультразвукового апарату VialTweeter і UIP400MTP значно підвищують точність і ефективність експериментальних робочих процесів, особливо в дослідженнях біоплівки і протеоміці. Їх здатність однорідно обробляти кілька зразків забезпечує високу пропускну здатність без шкоди для якості даних. Ці переваги в поєднанні з оптимізованими робочими процесами, описаними вище, роблять багатовибіркові ультразвукові апарати Hielscher важливими інструментами для сучасних біологічних досліджень.

Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.

Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.