Протокол використання ультразвукових апаратів Hielscher для одночасної обробки кількох зразків у дослідженні біоплівок і протеомному аналізі

Використання ультразвукових апаратів для одночасної обробки кількох зразків, таких як апарат VialTweeter для кількох пробірок та апарат UIP400MTP для мікропланшетів, оптимізує лабораторні робочі процеси для високопродуктивних застосувань. Обидва пристрої забезпечують точну й рівномірну ультразвукову обробку кількох зразків, мінімізуючи варіабельність і підвищуючи відтворюваність. Це особливо корисно в експериментах, які потребують однакового лізису зразків, відокремлення біоплівок, екстракції білків або протеолітичного розщеплення, де ручні методи або методи обробки одного зразка є менш ефективними та схильними до нестабільності результатів.

Оптимізуйте робочі процеси за допомогою ультразвукових апаратів для одночасної обробки кількох зразків

Наприклад, UIP400MTP дає змогу одночасно проводити ультразвукову обробку лунок мікропланшета, забезпечуючи рівномірне відокремлення біоплівок або клітинного матеріалу. Водночас VialTweeter забезпечує точний лізис і гомогенізацію кількох зразків у пробірках без перехресного забруднення. Ці ультразвукові апарати значно скорочують час обробки, покращують відтворюваність експериментів і зберігають високий ступінь цілісності зразків, що робить їх незамінними інструментами в дослідженнях із мікробіології, протеоміки та молекулярної біології.
Нижче наведено докладний протокол, який ілюструє використання моделей ультразвукових апаратів Hielscher для одночасної обробки кількох зразків – апарата VialTweeter для кількох пробірок та апарата UIP400MTP для мікропланшетів – у дослідженні утворення біоплівки E. coli та подальшого протеомного аналізу.

Протокол: утворення біоплівок, їх відокремлення та протеомний аналіз із використанням ультразвукових апаратів Hielscher для одночасної обробки кількох зразків

1. Підготовка бактеріальної культури

• Культивуйте бактерії E. coli (штам W3110) за температури 30°C, сприятливої для утворення біоплівок E. coli, у середовищі триптонового бульйону (TB), що містить:
  – 10 g/L триптону
  – 5 g/L NaCl
• За потреби додавайте антибіотики для забезпечення збереження плазмід.
• Для мікроскопії та досліджень активності промоторів використовуйте штам E. coli W3110 із вбудованим у геном репортером на основі посиленого GFP (eGFP) під контролем промотора rplL.
• Використовуйте плазміди з GFP-репортерами для різних промоторів (наприклад, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) для вимірювання активності промоторів.

2. Вирощування та відокремлення біоплівок

• Внесіть по 1,5 mL розведеної бактеріальної культури в кожну лунку 12-лункового планшета (12-лункові планшети CellStar, Greiner Bio-One).
• Інкубуйте для утворення біоплівки.
• Обережно видаліть планктонну (неприкріплену) культуру.

– Промийте кожну лунку 500 µL PBS.
– Відокремте прикріплені клітини шляхом ультразвукової обробки 12-лункового планшета в ультразвуковому апараті UIP400MTP для мікропланшетів. UIP400MTP забезпечує рівномірне відокремлення, передаючи однакову ультразвукову енергію в усі лунки.
– Налаштування ультразвукової обробки: амплітуда 60%, циклічний режим: 60 sec УВІМК. / 30 sec ВИМК.

3. Збирання та лізис клітин

• Центрифугуйте відокремлені клітини біоплівки при 4 500 g протягом 5 хвилин.
• Промийте осаджені клітини PBS.
• Ресуспендуйте клітини в 100 µL 2% розчину лауроїлсаркозинату натрію (SLS) та інкубуйте за температури 95°C протягом 15 хвилин.
• Проведіть ультразвукову обробку за допомогою апарата VialTweeter для кількох пробірок, щоб забезпечити повний лізис клітин.
  – Налаштування ультразвукової обробки: амплітуда 100%, 50 s УВІМК. / 10 s ВИМК. за загальної тривалості роботи 10 min; тримайте зразки на льоду.

4. Відновлення та алкілування

• Додайте 5 mM трис(2-карбоксіетил)фосфіну (TCEP) для відновлення дисульфідних зв’язків та інкубуйте за температури 95°C протягом 15 хвилин.
• Алкілуйте білки 10 mM йодацетамідом протягом 30 хвилин за температури 25°C.

5. Кількісне визначення та розщеплення білків

• Центрифугуйте лізати для видалення клітинних уламків.
• Визначте загальний вміст білка за допомогою набору Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Розщепіть 50 µg загального білка за допомогою 1 µg трипсину в розчині, що містить 2% SLS і 100 mM гідрокарбонату амонію.
• Інкубуйте реакційну суміш для розщеплення протягом ночі за температури 30°C.

6. Очищення пептидів

• Осадіть SLS, додавши 1,5% трифтороцтову кислоту (TFA), потім центрифугуйте.
• Очистіть пептиди за допомогою мікроколонок C18 для центрифугування.
• Висушіть очищені пептиди та ресуспендуйте їх у 0,1% TFA.

7. Рідинна хроматографія – мас-спектрометрія (LC-MS/MS)

• Проаналізуйте пептиди на мас-спектрометрі Q-Exactive Plus, з’єднаному із системою Ultimate 3000 RSLC nano.
• Розділіть пептиди за допомогою обернено-фазової колонки для ВЕРХ (75 µm × 42 cm), заповненої сорбентом C18 (2,4 µm).
• Застосуйте градієнт від 2% до 35% розчинника B (ацетонітрил із 0,15% мурашиної кислоти) протягом 140 хвилин.
• Зберіть дані за допомогою сканувань MS із високою роздільною здатністю з подальшими тандемними скануваннями MS/MS 10 іонів із найвищою інтенсивністю.

8. Аналіз даних

• Обробіть первинні дані LC-MS за допомогою програмного забезпечення Progenesis.
• Експортуйте файли .mgf та проаналізуйте їх за допомогою MASCOT.
• Виконайте кількісне визначення пептидів за допомогою SafeQuant для контролю якості та коригування частки хибних відкриттів.
• Проводьте всі експерименти у двох або трьох повторах для забезпечення відтворюваності.

Ультразвукові апарати для одночасної обробки кількох зразків і високопродуктивної підготовки зразків

Моделі ультразвукових апаратів VialTweeter та UIP400MTP для одночасної обробки кількох зразків значно підвищують точність і ефективність експериментальних робочих процесів, особливо в дослідженнях біоплівок і протеоміці. Їхня здатність рівномірно обробляти кілька зразків забезпечує високу пропускну здатність без погіршення якості даних. Ці переваги в поєднанні з описаними вище оптимізованими робочими процесами роблять ультразвукові апарати Hielscher для одночасної обробки кількох зразків необхідними інструментами сучасних біологічних досліджень.

Проєктування, виробництво та консультування – якість, створена в Німеччині

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та проєктування. Міцність і простота експлуатації забезпечують безперешкодну інтеграцію наших ультразвукових апаратів у промислові об’єкти. Ультразвукові апарати Hielscher легко справляються із суворими умовами та вимогливими середовищами.

Hielscher Ultrasonics – компанія, сертифікована за ISO, яка приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам із найсучаснішими технологіями та зручністю використання. Звісно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та вимогам UL, CSA і RoHs.