Ультразвукова дезагрегація клітин у бактеріальних зразках
Бактеріальні зразки рідко надходять у вигляді справжніх суспензій поодиноких клітин. Культури ростуть у вигляді ланцюжків і флокул, ізоляти з довкілля утворюють агрегати, зв’язані позаклітинними полімерними речовинами, а осади після центрифугування часто важко ресуспендувати навіть після ретельного перемішування на вортексі. Підрахунок життєздатних клітин, вимірювання оптичної густини, проточна цитометрія та профілювання мікробіому ґрунтуються на припущенні, що одна частинка відповідає одній клітині. Ультразвукова дезагрегація клітин усуває цю суперечність: короткі, контрольовані імпульси ультразвукової обробки розділяють агрегати на поодинокі клітини, не спричиняючи їх лізису.
Чому агрегація клітин спотворює ваші результати
Агрегація – це біологічна особливість, а не помилка підготовки. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces та багато видів із довкілля ростуть у вигляді ланцюжків, скупчень або фрагментів біоплівки, а позаклітинна ДНК і полісахариди склеюють клітини в осадах та елюатах із тампонів. Наслідки для аналізу мають систематичний характер:
- Кількість колоній занижується, оскільки одне скупчення утворює одну колонію незалежно від того, скільки клітин воно містить.
- Вимірювання оптичної густини та лічильники частинок реєструють агрегати замість клітин, спотворюючи криві росту.
- Проточна цитометрія та сортування клітин неправильно підраховують події, пов’язані зі скупченнями клітин, і виключають їх з аналізу.
- Екстракція ДНК і білків відображає лише клітини на поверхні агрегату, спотворюючи дані мікробіомних та оміксних досліджень.
Традиційні способи усунення цієї проблеми діють повільно, дають неповний результат або спричиняють хімічні зміни. Навіть інтенсивне піпетування та перемішування на вортексі залишають мікроагрегати. Ферментативне диспергування або диспергування із застосуванням хелаторів змінює поверхню клітин, яку ви, можливо, плануєте аналізувати. Механічна дезагрегація за допомогою контрольованої кавітації діє за лічені секунди й не потребує добавок.
Один агрегат – це одна колонія й один хибний результат. Дізнайтеся, як ультразвукова дезагрегація забезпечує отримання справжніх суспензій поодиноких клітин без лізису, утворення аерозолів або маніпуляцій із зондом. Запитайте додаткову інформацію!
Багатопробірковий ультразвуковий пристрій VialTweeter для безконтактної підготовки зразків: розділяйте скупчення клітин у герметично закритих пробірках
Як ультразвукова обробка дезагрегує клітини, не спричиняючи їх лізису
Ультразвукова дезагрегація клітин використовує різницю в механічній міцності. Бактеріальні агрегати утримуються разом відносно слабкими міжклітинними зв’язками та позаклітинним матриксом, тоді як неушкоджена клітинна оболонка витримує значно вищі зсувні навантаження. Коли калібрований ультразвук надходить у суспензію, акустична кавітація створює мікропотоки, імпульси тиску та зсувні сили, які спочатку діють на межах поділу агрегатів. Скупчення, ланцюжки та фрагменти біоплівки розділяються під дією зсувних сил (деагломерація) ще до досягнення рівня енергії, за якого розриваються мембрани (лізис).
Ультразвукова дезагрегація скупчень бактеріальних клітин
Дезагрегація чи лізис – значення параметрів ультразвукової обробки
Практичний висновок полягає в тому, що дезагрегацію та лізис виконують одним і тим самим приладом за різних параметрів роботи. За помірної амплітуди, коротких імпульсних циклів і контрольованої температури ви отримуєте суспензію життєздатних поодиноких клітин. Підвищення амплітуди, тривалості впливу або температури зразка зміщує процес у бік повного руйнування клітин для отримання цільових внутрішньоклітинних компонентів. Генератори Hielscher дають змогу точно задавати амплітуду, потужність, імпульсний режим і введену енергію та зберігати методику, завдяки чому етап дезагрегації відтворюється для різних зразків, операторів і циклів обробки.
Ефективна безконтактна ультразвукова обробка
Ультразвукова обробка у ванні не забезпечує такого рівня контролю. Ультразвукові очисні ванни та резервуари забезпечують лише низьку ультразвукову енергію, що призводить до неповної підготовки, а кавітація виникає нерівномірно, тому обробка кожної пробірки залежить від її положення у ванні. VialTweeter передає інтенсивні, сфокусовані ультразвукові сили безпосередньо крізь стінку посудини одночасно до 10 герметично закритих зразків. Обробку, яка у ванні потребує тривалого впливу зі змінною тривалістю, виконують за стандартизованою послідовністю імпульсів.
Безконтактні ультразвукові пристрої Hielscher подають інтенсивний, сфокусований ультразвук крізь стінки закритих флаконів. VialTweeter обробляє до 10 флаконів одночасно з однаковою інтенсивністю, без занурення зонда у зразок, без перехресного забруднення та без виділення аерозолів. Якщо цього потребує продуктивність обробки зразків, ультразвукові пристрої для мікропланшетів UIP400MTP і UIP550MTP забезпечують таке саме контрольоване передавання енергії багатолунковим планшетам.
VialTweeter одночасно обробляє ультразвуком до 10 менших флаконів і до 5 більших пробірок.
Переваги безконтактної ультразвукової дезагрегації
- Повна відсутність перехресного забруднення: Оскільки флакони постійно залишаються закритими й жоден зонд не занурюється у зразок, перехресне забруднення та втрати зразка повністю виключені. Між обробками зразків нічого не потрібно стерилізувати, а один цикл обробки не може вплинути на наступний.
- Захист від аерозолів: Ультразвукова обробка зондом у відкритій посудині утворює інфекційні аерозолі та забруднює поверхні приладу. Ультразвукова обробка в герметично закритому флаконі утримує зразок усередині його власної пробірки, що має значення під час роботи з патогенними бактеріями, такими як Mycobacterium tuberculosis, та іншими агентами рівнів BSL-2 або BSL-3.
- Відсутність ерозії наконечника: Під час роботи титанові зонди можуть виділяти у зразок невелику кількість мікрочастинок. Ці частинки змінюють оптичну густину та результати подальшого підрахунку частинок. Непряма ультразвукова обробка крізь стінку посудини повністю усуває це джерело твердих частинок.
- Рівномірна продуктивність обробки зразків: VialTweeter забезпечує однакову інтенсивність ультразвуку в кожному з максимум 10 флаконів, тому результати ультразвукової обробки є рівномірними та відтворюваними. Вплив положення зразка, характерний для ванн та обробки окремих зразків зондом, зникає, а базові показники залишаються порівнянними між повторностями.
- Збереження цілісності зразка: Пробірки залишаються закритими протягом усієї обробки, тому зразок не може забруднитися, зіпсуватися або випаруватися. Малі об’єми можна обробляти без розведення, зокрема цінні осади клінічних зразків, для яких додатковий етап перенесення є неприйнятним.
- Контроль процесу: Амплітуда регулюється від 20 до 100%, імпульсний режим – від 0 до 100%, а системи підтримують моніторинг температури, завдяки чому термочутливі штами та білки залишаються за температур нижче порогів пошкодження.
Типові застосування
- Аналіз мікробіому та вмісту кишківника: диспергування Lactobacillus, Bifidobacterium і зразків калу перед висіванням на поживне середовище або секвенуванням, щоб скупчення клітин не занижували результати підрахунку.
- Мікробіологія харчових продуктів і води: дезагрегація флокул у зразках, відібраних тампонами, змивах і бульйонах збагачення для точного визначення кількості колоній та життєздатності.
- Дослідження біоплівок: вилучення клітин із носіїв і поверхонь у вигляді одноклітинних суспензій без ферментативної обробки, яка видаляла б поверхневі білки.
- Клінічна діагностика: ресуспендування мокротиння, гною та елюатів із тампонів в умовах біологічної ізоляції.
- Культивування клітин: розділення злиплих агрегатів клітин ссавців, комах і CHO перед підрахунком та пасажуванням.
- Підготовка в межах усього робочого процесу: той самий прилад, який виконує дезагрегацію за низької амплітуди, забезпечує повне руйнування клітин за вищих налаштувань, тому лізис, екстракція білків і фрагментація ДНК відбуваються послідовно без перенесення зразків між пробірками.
Ультразвуковий пристрій для багатолункових планшетів UIP400MTP для високопродуктивної деагломерації скупчень клітин
Ультразвукові пристрої для мікропланшетів моделей UIP400MTP і UIP550MTP обробляють не лише багатолункові планшети, а й штативи з пробірками.
Знайдіть відповідний ультразвуковий пристрій для свого робочого процесу дезагрегації
Ультразвуковий пристрій VialTweeter для одночасної обробки кількох пробірок
Метод вибору для стерильної дезагрегації в герметично закритих флаконах. Завдяки процесору UP200St потужністю 200 Вт, що працює на частоті 26 kHz з автоматичним налаштуванням, VialTweeter передає ультразвук опосередковано крізь стінки до 10 закритих флаконів одночасно, забезпечуючи потужність до 10 W на пробірку для рівномірних і відтворюваних результатів без перехресного забруднення та втрат зразка. Титановий сонотрод VialTweeter можна автоклавувати, а налаштування амплітуди й імпульсів можна регулювати та зберігати, що забезпечує діапазон керування, необхідний для протоколу деагломерації. Стандартний сонотрод на 10 позицій вміщує флакони для автоматичних пробовідбірників, мікроцентрифужні пробірки та пробірки Eppendorf або Nunc об’ємом від 1 до 5 mL. Затискний пристрій VialPress вміщує до 5 більших посудин діаметром до 20 mm.
Доступні спеціалізовані моделі VialTweeter для однієї пробірки Falcon, а також моделі для окремих флаконів, адаптовані до розміру посудини. Демонтуйте блоковий сонотрод, і базовий модуль UP200St працюватиме як звичайний зондовий ультразвуковий апарат для безпосередньої обробки зразків малого та середнього об’єму.
Ультразвукові апарати для мікропланшетів
Перехід до високопродуктивної підготовки зразків за допомогою ультразвукової обробки багатолункових планшетів: у робочих процесах із використанням планшетів ультразвукові апарати для мікропланшетів UIP400MTP та UIP550MTP розширюють масштаб безконтактної рівномірної ультразвукової обробки з десяти пробірок до цілого планшета.
UIP400MTP потужністю 400 Вт обробляє стандартні мікротитраційні та багатолункові планшети, зокрема 96-лункові, забезпечуючи точне керування амплітудою, потужністю та імпульсним режимом, а також оснащений таймером, температурним зондом і системою охолодження у водяній бані. Відокремлення біоплівок від поверхонь і обробка бактеріальних культур є усталеними сферами застосування ультразвукового апарата для мікропланшетів UIP400MTP.
UIP550MTP потужністю 550 Вт є потужнішим варіантом – ідеальним для складніших завдань.
Обидві системи безконтактної ультразвукової обробки надійно обробляють 6-, 12-, 24-, 48-, 96- та 384-лункові планшети, а також штативи з пробірками й чашки Петрі. Ультразвукові апарати Hielscher для мікропланшетів працюють із будь-якими стандартними планшетами, що дає змогу уникнути використання дорогих фірмових витратних матеріалів. Завдяки програмованим температурним межам ультразвукова обробка автоматично призупиняється за досягнення максимальної температури зразка та відновлюється після охолодження, зберігаючи життєздатність клітин у повторних циклах. Інтелектуальна та надійна високопродуктивна підготовка зразків для відтворюваних результатів.
У таблиці нижче наведено огляд приблизної продуктивності наших лабораторних ультразвукових апаратів для обробки зразків, які використовують у науках про життя, геноміці, протеоміці та діагностиці:
| Рекомендовані пристрої | Об’єм партії | Об’ємна витрата |
|---|---|---|
| Ультразвуковий апарат VialTweeter для кількох пробірок | флакони об’ємом від 0,5 до 1,5mL | n.a. |
| Ультразвуковий апарат UIP400MTP для багатолункових планшетів (440 Вт) | багатолункові / мікротитраційні планшети | n.a. |
| Ультразвуковий апарат UIP550MTP для багатолункових планшетів (550 Вт) | багатолункові / мікротитраційні планшети | n.a. |
| Ультразвуковий CupHorn | CupHorn для флаконів або лабораторного стакана | n.a. |
| Зондовий ультразвуковий апарат UP100H потужністю 100 Вт | від 1 до 500mL | від 10 до 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St моделі зондових ультразвукових апаратів потужністю 200 Вт | від 10 до 1000mL | від 20 до 200mL/min |
| Зондовий ультразвуковий апарат UP400St потужністю 400 Вт | від 10 до 2000mL | від 20 до 400mL/min |
| GDmini2 | стерильний ультразвуковий мікропроточний реактор | n.a. |
| Ультразвуковий ситовий струшувач | n.a. | n.a. |
Поширені запитання про ультразвукову дезагрегацію клітин
У чому різниця між дезагрегацією та лізисом клітин?
Дезагрегація, яку також називають деагломерацією, розділяє злиплі клітини з утворенням суспензії окремих клітин, зберігаючи їхню цілісність і життєздатність. Лізис розриває клітинну оболонку та вивільняє внутрішньоклітинний вміст. Обидва процеси зумовлені зсувними силами, що виникають унаслідок кавітації, а відмінність полягає в кількості підведеної енергії. За оптимізованих налаштувань амплітуди, імпульсного режиму та температури ультразвукова обробка забезпечує дезагрегацію за рівня енергії нижче порога лізису.
Чому ультразвукові ванни не підходять для стандартизованої дезагрегації?
Ванни забезпечують лише низьку ультразвукову енергію, що призводить до неповної пробопідготовки, а кавітація розвивається вкрай нерівномірно по всьому резервуару, тому кожен зразок зазнає різної обробки залежно від свого розташування. Мікробіологічні підрахунки та порівняльні дослідження залежать від зіставності результатів. Безконтактні ультразвукові пристрої, як-от пристрій для одночасної обробки кількох пробірок VialTweeter, а також моделі ультразвукових пристроїв для мікропланшетів UIP400MTP і UIP550MTP, обробляють усі посудини за налаштованих умов ультразвукової обробки, що покращує відтворюваність між повторностями.
Чи може ультразвукова обробка пошкодити клітини?
Так, якщо параметри не контролюються. Надмірна ультразвукова обробка або неконтрольоване нагрівання можуть пошкодити клітини, а вивільнена ДНК робить зразки в’язкими та сприяє повторній агрегації. Саме тому процес слід розробляти продумано: помірна амплітуда, імпульсні цикли, охолодження та прилади з обмеженням температури утримують обробку в ділянці кривої, що відповідає дезагрегації.
Усі цифрові ультразвукові пристрої Hielscher мають точно контрольовані параметри, під’єднувані датчики температури, програмовані налаштування та автоматизовану реєстрацію даних для надійної пробопідготовки.
Чи потрібно переносити зразок в іншу посудину?
Ні. Флакони та планшети обробляють у їхніх початкових закритих ємностях. Непряма ультразвукова обробка дає змогу уникнути як втрат під час перенесення, так і перехресного перенесення матеріалу, пов’язаного з маніпуляціями із зондом.
Які формати флаконів може обробляти VialTweeter?
Стандартний сонотрод на 10 позицій вміщує флакони для автосамплера, мікроцентрифужні пробірки та пробірки Eppendorf або Nunc об’ємом від 1 до 5 mL. Додаткове пристосування VialPress вміщує до 5 більших посудин діаметром до 20 mm. Доступні спеціалізовані моделі VialTweeter для однієї пробірки Falcon, а також для індивідуально адаптованих форматів одного флакона або більших посудин.
Чи можна виконувати дезагрегацію та лізис одним приладом?
Так. Та сама установка, яка виконує дезагрегацію за помірної амплітуди, забезпечує повне руйнування клітин за вищої амплітуди та тривалішого впливу, тож отримання одноклітинної суспензії та подальшу екстракцію можна виконувати послідовно без зміни платформи.
Чи застосовують ультразвукову обробку в аналізах MBEC?
Ультразвукова обробка є усталеним і значною мірою стандартним компонентом. В аналізі MBEC із кришкою зі штифтами після вирощування біоплівок на полістирольних штифтах і впливу антибіотика штифти переносять у свіже середовище та піддають вортексуванню й ультразвуковій обробці, щоб відокремити прикріплені клітини біоплівки та дезагрегувати їх у планктонну суспензію перед серійним розведенням і підрахунком життєздатних клітин (MBEC визначають як найнижчу концентрацію, що знижує кількість виділених життєздатних клітин на ≥3 log10 порівняно з необробленою біоплівкою). Ультразвукова обробка значно покращує якість диспергування: неповне вивільнення клітин, вбудованих у матрицю EPS, призводить до недооцінювання ерадикації та завищення значень MBEC. Цілеспрямована ультразвукова обробка лунок для штифтів по всіх планшетах для аналізу за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів UIP400MTP долає традиційні недоліки ультразвукової обробки у ванні – а саме нерівномірний розподіл енергії, нагрівання та ризик утворення аерозолів / перехресної контамінації.
Дізнайтеся, як безконтактний ультразвуковий пристрій для мікропланшетів UIP400MTP полегшує проведення аналізів MBEC!
Чи застосовують ультразвукову обробку в аналізах MIC?
Ультразвукову обробку застосовують у різних робочих процесах, пов’язаних із MIC, для підвищення ефективності та відтворюваності:
- у мікобактеріології, де мокротиння та інші в’язкі зразки регулярно деконтамінують і гомогенізують, іноді з використанням ультразвукової обробки, перед тестуванням чутливості, а короткочасне диспергування інокулятів мікобактерій, що утворюють скупчення, сприяє точному визначенню MIC;
- для організмів, схильних до утворення агрегатів (наприклад, стрептококів, стафілококів в осадах), у яких мікроагрегати спотворюють щільність інокуляту; та
- у комбінованій діагностиці, наприклад, під час культурального дослідження рідини після ультразвукової обробки імплантата з подальшим тестуванням чутливості при перипротезній інфекції суглоба (застосування, подібне до MBEC, а не класичне визначення MIC).
Дізнайтеся про застосування ультразвукової обробки в аналізах MIC!
Література / Джерела
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Виберіть власний планшет! Ультразвуковий пристрій для мікропланшетів UIP550MTP дезагрегує бактеріальні зразки в будь-якому стандартному багатолунковому планшеті.
Моделі ультразвукових пристроїв Hielscher для одночасної обробки кількох зразків UIP400MTP для мікропланшетів, VialTweeter та CupHorn: швидка підготовка зразків із високою продуктивністю