Ультразвукова дезагрегація клітин бактеріальних зразків
Зразки бактерій рідко надходять у вигляді справжніх одноклітинних суспензій. Культури ростуть ланцюжками та згустками, ізоляти з навколишнього середовища утворюють агрегати, зв’язані позаклітинними полімерними речовинами, а відцентрифуговані осади часто не піддаються ресуспендуванню навіть після ретельного перемішування на вортексі. Підрахунок життєздатних клітин, вимірювання оптичної щільності, проточна цитометрія та профілювання мікробіому ґрунтуються на припущенні, що одна частинка дорівнює одній клітині. Ультразвукова дезагрегація клітин вирішує цю суперечність: короткі, контрольовані імпульси ультразвуку розбивають агрегати на окремі клітини, не руйнуючи їх.
Чому агрегація клітин впливає на результати досліджень
Агрегація є біологічною особливістю, а не помилкою під час підготовки зразка. Стафілококи, стрептококи, лактобацили, актиноміцети та багато інших видів мікроорганізмів, що зустрічаються в навколишньому середовищі, ростуть у вигляді ланцюжків, скупчень або фрагментів біоплівки, а позаклітинна ДНК та полісахариди з’єднують клітини між собою у осадах та елюатах мазків. Це має систематичні наслідки для аналізу:
- Кількість колоній оцінюється занижено, оскільки один скупчення утворює одну колонію незалежно від того, скільки клітин воно містить.
- Прилади для вимірювання оптичної щільності та лічильники частинок фіксують агрегати замість клітин, що спотворює криві росту.
- При проведенні проточної цитометрії та сортування клітин скупчення клітин не враховуються і виключаються з аналізу.
- Вилучення ДНК та білків охоплює лише клітини, що знаходяться на поверхні агрегату, що спотворює дані щодо мікробіому та омічних досліджень.
Традиційні методи є повільними, неповними або призводять до хімічних змін. Інтенсивне піпетування та перемішування на вортексі залишають після себе мікроагрегати. Ферментативна дисперсія або дисперсія на основі хелаторів змінює поверхню клітин, яку ви, можливо, плануєте аналізувати. Механічна дезагрегація за допомогою контрольованої кавітації відбувається за лічені секунди і не вимагає додавання жодних добавок.
Один агрегат дорівнює одній колонії – та один неправильний результат. Переконайтеся, як ультразвукова дезагрегація дозволяє отримати справжні одноклітинні суспензії без лізису, утворення аерозолів та використання зондів. Запитайте додаткову інформацію!
Багатотрубний сокатор VialTweeter для безконтактної підготовки зразків: розбийте скупчення клітин у герметичних пробірках
Як ультразвукова обробка роз'єднує клітини, не руйнуючи їх
Ультразвукова дезагрегація клітин ґрунтується на різниці в механічній міцності. Бактеріальні агрегати утримуються разом завдяки відносно слабким міжклітинним зв’язкам та позаклітинній матриці, тоді як неушкоджена клітинна оболонка витримує значно більші зсувні навантаження. Коли відкалібровані ультразвукові хвилі потрапляють у суспензію, акустична кавітація генерує мікропотоки, імпульси тиску та зсувні сили, які спочатку діють на межі розділу агрегатів. Скупчення, ланцюжки та фрагменти біоплівки розриваються (деагломерація) ще до того, як буде досягнуто рівня енергії, при якому відбувається розрив мембран (лізис).
Ультразвукова дезагрегація скупчень бактеріальних клітин
Дезагрегація або лізис – Чому параметри ультразвукової обробки мають значення
Практичним наслідком цього є те, що дезагрегація та лізис — це один і той самий прилад, що працює з різними параметрами. При помірній амплітуді, коротких імпульсних циклах та контрольованій температурі ви отримуєте життєздатну суспензію окремих клітин. Збільшення амплітуди, часу впливу або температури зразка зміщує процес у бік повного руйнування клітин для досягнення внутрішньоклітинних цілей. Генератори Hielscher дозволяють точно налаштовувати амплітуду, потужність, імпульс та енерговитрати, а також зберігати налаштування методу, завдяки чому етап дезагрегації є відтворюваним для різних зразків, операторів та циклів обробки.
Ефективна безконтактна ультразвукова обробка
Ультразвукова обробка у ванні не може забезпечити такого контролю. Ультразвукові очисні ванни та резервуари забезпечують лише низький рівень ультразвукової енергії, що призводить до неповної обробки, а кавітація відбувається нерівномірно, тому кожна пробірка обробляється відповідно до її положення у ванні. VialTweeter передає інтенсивні, сфокусовані ультразвукові хвилі безпосередньо крізь стінку посудини одночасно до 10 герметичних зразків. Процедури, що вимагають тривалого, змінного впливу у ванні, виконуються за стандартизованою імпульсною схемою.
Безконтактні ультразвукові апарати компанії Hielscher застосовують інтенсивний, сфокусований ультразвук, проникаючи крізь стінки закритих флаконів. Пристрій VialTweeter обробляє до 10 флаконів одночасно з однаковою інтенсивністю, без занурення зонда у зразок, без перехресного забруднення та без утворення аерозолю. У випадках, коли це вимагає високої пропускної здатності, ультразвукові пристрої для мікропланшетів UIP400MTP та UIP550MTP забезпечують такий самий контрольований перенос енергії на багатолункові планшети.
Твітер VialTweeter одночасно обробляє до 10 менших пробірок і до 5 більших пробірок.
Переваги безконтактного ультразвукового роздрібнення
- Повна відсутність перехресного забруднення: Оскільки пробірки залишаються постійно закритими, а зонд не занурюється у зразок, вдається повністю уникнути перехресного забруднення та втрати зразка. Між аналізами не потрібно стерилізувати жодних предметів, а результати одного аналізу не впливають на наступний.
- Захист від аерозолів: Ультразвукова обробка з відкритим зондом призводить до утворення інфекційних аерозолів та забруднення поверхонь обладнання. Ультразвукова обробка у герметичній пробірці утримує зразок усередині самої пробірки, що має важливе значення під час роботи з патогенними бактеріями, такими як Mycobacterium tuberculosis, та іншими агентами рівня біологічної безпеки 2 (BSL-2) або 3 (BSL-3).
- Відсутність втрати чайових: Під час роботи титанові зонди можуть виділяти в зразок невелику кількість мікрочастинок. Ці частинки впливають на оптичну густину та кількість частинок у подальшому потоці. Непряме ультразвукове оброблення через стінку ємності повністю усуває це джерело твердих речовин.
- Рівномірна пропускна здатність: VialTweeter забезпечує однакову інтенсивність ультразвуку для кожної з до 10 пробірок, завдяки чому результати ультразвукової обробки є рівномірними та відтворюваними. Зникають ефекти, пов’язані з розташуванням, які є проблемою для ультразвукових ванн та обробки окремих зразків, а ваші базові показники залишаються порівнянними у всіх повтореннях.
- Цілісність зразка: Пробірки залишаються закритими протягом усього процесу обробки, тому зразок не може бути забруднений, зіпсований або випаруватися. Невеликі об’єми можна обробляти без розведення, зокрема цінні клінічні осади, для яких не можна допускати додаткового етапу перенесення.
- Управління процесом: Амплітуду можна регулювати в діапазоні від 20 до 100 %, імпульсний режим — від 0 до 100 %, а системи підтримують контроль температури, завдяки чому термочутливі штами та білки не перевищують порогові значення, що можуть спричинити пошкодження.
Типові застосування
- Аналіз мікробіома та вмісту кишечника: розчинення лактобактерій, біфідобактерій та зразків фекалій перед висіванням на чашки або секвенуванням, щоб скупчення бактерій не призвели до заниження їх кількості.
- Мікробіологія харчових продуктів та води: роздрібнення флокул у мазках, промивних рідинах та збагачувальних бульйонах для точного визначення кількості колоній та життєздатності.
- Дослідження біоплівок: виділення клітин з носіїв та поверхонь у вигляді суспензій окремих клітин без застосування ферментативної обробки, яка призвела б до видалення поверхневих білків.
- Клінічна діагностика: ресуспендування мокротиння, гною та елюатів мазків у умовах ізоляції.
- Культура клітин: розділення згустків ссавців, комах та CHO перед підрахунком та пасажуванням.
- Підготовка всього робочого процесу: той самий прилад, який здійснює дезагрегацію при низькій амплітуді, при вищих налаштуваннях забезпечує повне руйнування клітин, завдяки чому лізис, екстракція білків та фрагментація ДНК відбуваються без переливання з однієї пробірки в іншу.
Багатолунковий пластинчастий ультразвуковий аналізатор UIP400MTP для високопродуктивної деагломерації скупчень клітин
Моделі ультразвукових апаратів для мікропланшетів UIP400MTP та UIP550MTP призначені не лише для багатолункових планшетів, а й для обробки штативів з пробірками.
Підберіть відповідний ультразвуковий апарат для вашого технологічного процесу дезагрегації
VialTweeter Багатотрубний звуковий апарат
Найкращий метод дезагрегації в стерильних, герметично закритих флаконах. Завдяки процесору UP200St потужністю 200 Вт, що працює на частоті 26 кГц з автоматичним налаштуванням, VialTweeter передає ультразвук опосередковано через стінки до 10 закритих флаконів одночасно, з потужністю до 10 Вт на флакон, забезпечуючи рівномірні та відтворювані результати без перехресного забруднення та втрати зразка. Титановий сонотрод VialTweeter можна стерилізувати в автоклаві, а амплітуду та імпульс можна регулювати та зберігати в пам’яті, що відповідає діапазону регулювання, необхідному для протоколу деагломерації. Стандартний 10-позиційний сонотрод сумісний з пробірками для автопробовідбору, пробірками для мікроцентрифуги та пробірками Eppendorf або Nunc об’ємом від 1 до 5 мл. Затискний пристрій VialPress дозволяє обробляти до 5 більших ємностей діаметром до 20 мм.
Доступні спеціальні однотрубні моделі VialTweeter, призначені для трубок Falcon, а також для окремих пробірок, виготовлених відповідно до розмірів посудини. Після розбирання блокового сонотрода основний блок UP200St працює як звичайний зондовий ультразвуковий апарат для безпосередньої обробки зразків малого та середнього розміру.
Ультразвукові апарати для мікропланшетів
Перехід до високопродуктивної підготовки зразків за допомогою ультразвукової обробки багатолункових планшетів: для робочих процесів на основі планшетів ультразвукові апарати для мікропланшетів UIP400MTP та UIP550MTP дозволяють розширити сферу застосування безконтактної, рівномірної ультразвукової обробки з десяти пробірок до всього планшета.
400-ватний прилад UIP400MTP призначений для обробки стандартних мікротитровальних та багатолункових пластин, зокрема 96-лункових, і забезпечує точне регулювання амплітуди, потужності та імпульсів, а також оснащений таймером, датчиком температури та системою охолодження у водяній бані. Видалення біоплівки та обробка бактеріальних культур є загальновизнаними сферами застосування ультразвукового процесора для мікропластинок UIP400MTP.
Модель UIP550MTP потужністю 550 Вт є більш потужним варіантом – ідеально підходить для більш вимогливих завдань.
Обидві безконтактні ультразвукові системи надійно обробляють 6-, 12-, 24-, 48-, 96- та 384-лункові планшети, а також стійки для пробірок і чашки Петрі. Ультразвукові апарати для мікропланшетів Hielscher сумісні з будь-якими стандартними планшетами, що дозволяє уникнути використання дорогих фірмових витратних матеріалів. Завдяки програмованим температурним обмеженням ультразвукова обробка автоматично призупиняється при досягненні максимальної температури зразка та відновлюється після охолодження, забезпечуючи збереження життєздатності клітин під час багаторазових циклів. Інтелектуальна та надійна високопродуктивна підготовка зразків для отримання відтворюваних результатів.
У таблиці нижче наведено огляд приблизної продуктивності наших лабораторних ультразвукових апаратів, що використовуються в біологічних науках, геноміці, протеоміці та діагностиці:
| Рекомендовані пристрої | Об'єм партії | Витрата |
|---|---|---|
| VialTweeter Багатотрубний звуковий апарат | 0флакони об'ємом від 0,5 до 1,5 мл | Н.А. |
| Ультразвуковий апарат для багатолункових планшетів UIP400MTP (440 Вт) | Багатолункові / мікротитрові пластини | Н.А. |
| Ультразвуковий апарат для багатолункових планшетів UIP550MTP (550 Вт) | Багатолункові / мікротитрові пластини | Н.А. |
| Ультразвуковий CupHorn | CupHorn для флаконів або мензурки | Н.А. |
| UP100H — ультразвуковий апарат з зондовим наконечником потужністю 100 Вт | Від 1 до 500 мл | Від 10 до 200 мл/хв |
| UP200Ht, UP200St Моделі ультразвукових апаратів з датчиком потужністю 200 Вт | Від 10 до 1000 мл | Від 20 до 200 мл/хв |
| UP400St — ультразвуковий прилад з зондовим наконечником потужністю 400 Вт | Від 10 до 2000 мл | Від 20 до 400 мл/хв |
| GDmini2 | стерильний ультразвуковий мікропотоковий реактор | Н.А. |
| Ультразвуковий шейкер для сита | Н.А. | Н.А. |
Поширені запитання щодо ультразвукової дезагрегації клітин
У чому полягає різниця між дезагрегацією клітин та лізисом клітин?
Дезагрегація, яку також називають деагломерацією, дозволяє розділити згруповані клітини на суспензію окремих клітин, при цьому клітини залишаються цілими та життєздатними. Лізис руйнує клітинну оболонку та вивільняє внутрішньоклітинний вміст. Обидва процеси відбуваються під дією кавітаційного зсуву, а різниця полягає в кількості енергії, що подається. Завдяки оптимізованим налаштуванням амплітуди, імпульсів та температури ультразвукова обробка забезпечує дезагрегацію нижче порогу лізису.
Чому ультразвукові ванни не підходять для стандартизованого роздрібнення?
Ванни забезпечують лише низький рівень ультразвукової енергії, що призводить до неповної обробки, а кавітація розвивається дуже нерівномірно по всій поверхні резервуара, тому кожен зразок піддається різній обробці залежно від свого розташування. Мікробіологічні аналізи та порівняльні дослідження залежать від можливості порівняння результатів. Безконтактні ультразвукові апарати, такі як багатотрубний ультразвуковий апарат VialTweeter, а також моделі ультразвукових апаратів для мікропланшетів UIP400MTP та UIP550MTP обробляють усі ємності за налаштованих ультразвукових умов, що покращує відтворюваність результатів у різних повторах.
Чи може ультразвукова обробка пошкодити клітини?
Так, якщо параметри не контролюються. Надмірна обробка ультразвуком або неконтрольоване нагрівання можуть пошкодити клітини, а вивільнена ДНК робить зразки в’язкими та сприяє повторній агрегації. Саме тому процес слід розробляти ретельно: помірна амплітуда, імпульсні цикли, охолодження та прилади з обмеженням температури дозволяють утримувати обробку в ділянці кривої, що відповідає дезагрегації.
Усі цифрові ультразвукові апарати компанії Hielscher оснащені функціями точного регулювання параметрів, знімними датчиками температури, програмованими налаштуваннями та автоматичним записом даних, що забезпечує надійну підготовку зразків.
Чи потрібно перелити зразок в іншу посудину?
Ні. Флакони та планшети обробляються у своїх оригінальних, закритих контейнерах. Непряма ультразвукова обробка дозволяє уникнути як втрат під час перенесення, так і перенесення речовин, пов’язаного з маніпуляціями зі зондом.
Які типи флаконів може обробляти система VialTweeter?
Стандартний 10-позиційний сонотрод сумісний з пробірками для автопробовідбору, мікроцентрифужними пробірками та пробірками Eppendorf або Nunc об’ємом від 1 до 5 мл. Аксесуар VialPress дозволяє розміщувати до 5 більших ємностей діаметром до 20 мм. Для пробірок Falcon, а також для індивідуальних пробірок одинарного використання або пробірок більшого розміру доступні спеціальні моделі VialTweeter для роботи з однією пробіркою.
Чи можна провести дезагрегацію та лізис за допомогою одного приладу?
Так. Та сама установка, яка здійснює деагрегацію при помірній амплітуді, забезпечує повне руйнування клітин при вищій амплітуді та тривалішому впливі, тому підготовку суспензії окремих клітин та подальшу екстракцію можна проводити послідовно без зміни платформ.
Чи застосовується ультразвукова обробка в аналізах MBEC?
Ультразвукова обробка є загальновизнаною і, здебільшого, стандартною складовою. У тесті MBEC із використанням кілочків із кришками після вирощування біоплівок на полістирольних кілочках та їх впливу антибіотиком кілочки переносять у свіже середовище та піддають віхревому перемішуванню та ультразвуковій обробці для відриву та деагрегації прикріплених клітин біоплівки у планктонну суспензію перед послідовним розведенням та підрахунком життєздатних клітин (MBEC визначається як найнижча концентрація, що зменшує отримані показники на ≥3 log10 порівняно з необробленою біоплівкою). Ультразвукова обробка значно покращує якість диспергування: неповне вивільнення вбудованих клітин із матриці EPS призводить до недооцінки ступеня знищення та завищення значень MBEC. Цільове ультразвукове оброблення лунок з тримачами ПЕГ на аналітичних планшетах за допомогою ультразвукового апарату для мікропланшетів UIP400MTP дозволяє подолати традиційні недоліки ультразвукової обробки у ванні – а саме: нерівномірний розподіл енергії, нагрівання та ризик аерозольного та перехресного забруднення.
Дізнайтеся, як безконтактний ультразвуковий апарат для мікропланшетів UIP400MTP полегшує проведення аналізів методом MBEC!
Чи застосовується ультразвукова обробка в аналізах на визначення мінімальної інгібуючої концентрації (МІК)?
Ультразвукову обробку застосовують на різних етапах робочих процесів, пов’язаних із визначенням МІК, для підвищення ефективності та відтворюваності результатів:
- мікобактеріологія, де мокроту та інші в’язкі зразки зазвичай деконтамінують та гомогенізують, іноді за допомогою ультразвукової обробки, перед проведенням тестування на чутливість, а для отримання точних значень МІК інкубаційні культури мікобактерій, що утворюють скупчення, потребують короткочасної дисперсії;
- організми, схильні до утворення агрегатів (наприклад, стрептококи, стафілококи у вигляді гранул), у яких мікроагрегати спотворюють щільність інокуляту; та
- комплексна діагностика, така як ультразвукове дослідження імплантату та культуральне дослідження рідини з подальшим визначенням чутливості до антибіотиків при інфекції протезованого суглоба (застосування за принципом MBEC, а не класичного методу визначення МІК).
Література / Список літератури
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Оберіть свою тарілку! Ультразвуковий апарат для мікропланшетів UIP550MTP розподіляє бактеріальні зразки у будь-якій стандартній багатолунковій планшеті.
Моделі Hielscher Multi-Sample Sonicator UIP400MTP для мікропланшетів, VialTweeter і КугорнВисокошвидкісна та високопродуктивна підготовка зразків