Протокол визначення мінімальної інгібувальної концентрації (MIC)

Визначення мінімальної інгібувальної концентрації (MIC) для біоплівок є важливим методом оцінювання ефективності антимікробних засобів проти мікроорганізмів, пов’язаних із біоплівками, які виявляють підвищену стійкість завдяки захисному позаклітинному матриксу. Ключовим етапом цього аналізу є відокремлення структур біоплівки для вивільнення вбудованих у неї клітин і точного оцінювання їхньої життєздатності. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів полегшує цей процес, використовуючи сфокусований ультразвук для створення контрольованої кавітації, ефективного відокремлення клітин біоплівки та їх диспергування в однорідну суспензію. Таке точне й відтворюване руйнування біоплівки підвищує надійність і продуктивність аналізів MIC, роблячи UIP400MTP незамінним інструментом для розвитку досліджень біоплівок.

Чому варто застосовувати ультразвукову обробку під час визначення MIC?

• Точні, відтворювані дані: Отримуйте однорідні клітинні суспензії, у яких усунуто захисну дію матриксу, щоб результати підрахунку колоній і вимірювання оптичної густини справді відображали ефективність антимікробних засобів.
• Висока продуктивність: Обробляйте весь 96-лунковий планшет одночасно лише за 1–3 хвилини, замінюючи повільне ручне зішкрібання з нестабільними результатами оптимізованим робочим процесом.
• Збереження життєздатності клітин: Делікатно відокремлюйте вбудовані в біоплівку клітини без фізичних пошкоджень, спричинюваних зішкрібанням, підтримуючи вищий рівень виживання для надійних розрахунків MIC/MBEC.
• Нульовий ризик перехресного забруднення: Скористайтеся перевагами безконтактної конструкції з чашоподібним сонотродом, яка забезпечує рівномірну обробку всіх лунок без дотику зондів до окремих зразків або лунок.
• Відповідність стандартам: Узгодьте свою методику з валідованими галузевими протоколами, як-от ASTM E2799-22, щоб підвищити довіру до ваших даних для регуляторних цілей або публікації.
• Надійний скринінг лікарських засобів і методів лікування: Покладайтеся на результати визначення чутливості, щоб ухвалювати більш обґрунтовані рішення щодо ефективності антимікробних засобів, визначення профілю резистентності або розроблення терапії.

Ультразвукова обробка для відокремлення біоплівок

Аналіз MIC для біоплівок зазвичай передбачає визначення життєздатності бактерій або пригнічення їхнього росту за допомогою таких методів, як висівання, підрахунок колоній або вимірювання оптичної густини. Ультразвукова обробка є ключовим етапом аналізів MIC для біоплівок під час оцінювання чутливості пов’язаних із біоплівками мікроорганізмів до антимікробних засобів. Її основна функція полягає у відокремленні клітин, вбудованих у матрикс біоплівки, та їх диспергуванні в однорідну суспензію для точного аналізу.
Біоплівки значно стійкіші до антимікробних засобів порівняно з планктонними клітинами, тому належне відокремлення є критично важливим для точного аналізу. Під час цього процесу ультразвукові хвилі створюють контрольовану кавітацію, руйнуючи матрикс біоплівки та вивільняючи вбудовані клітини з утворенням однорідної суспензії в середовищі для відновлення клітин. Цей етап дає змогу точно оцінювати життєздатність клітин, диспергованих із біоплівки, за допомогою таких методів, як висівання, розведення та підрахунок колоній. Належне руйнування біоплівки за допомогою ультразвукової обробки запобігає захисту клітин залишковими компонентами матриксу, який інакше міг би призвести до недооцінювання антимікробної активності. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів особливо добре підходить для цієї мети, забезпечуючи точні й відтворювані умови ультразвукової обробки для надійної та високопродуктивної підготовки планшетів для аналізу.

Чому ультразвукова обробка необхідна під час визначення мінімальної інгібувальної концентрації для біоплівок

Для вимірювання життєздатності та підрахунку клітин потрібні повне й надійне відокремлення та диспергування окремих клітин. UIP400MTP сприяє рівномірному відокремленню біоплівок і диспергуванню клітин без пошкоджень для отримання надійних результатів аналізу.

• Складність біоплівок: Біоплівки – це структуровані мікробні угруповання, оточені матриксом із позаклітинної полімерної речовини (EPS), який захищає мікроорганізми та робить їх стійкішими до антимікробних засобів.
• Рівномірне диспергування: Щоб точно виміряти життєздатність клітин, вбудованих у біоплівку, або їхню чутливість до антимікробних засобів, біоплівку спочатку необхідно відокремити й зруйнувати до утворення однорідної суспензії.

Протокол визначення мінімальної інгібувальної концентрації для біоплівок

Аналіз мінімальної інгібувальної концентрації (MIC) визначає найнижчу концентрацію антимікробного засобу, необхідну для пригнічення видимого росту мікроорганізмів. Цей протокол призначений для мікроорганізмів, асоційованих із біоплівками, і передбачає використання ультразвукового пристрою для багатолункових планшетів UIP400MTP для руйнування біоплівок.

Крок 1: Підготовка бактеріального інокуляту

1. Приготуйте бактеріальну суспензію:
   Вирощуйте бактерії у відповідних поживних середовищах до середини логарифмічної фази росту.
   Розведіть культуру до стандартизованої щільності клітин (наприклад, стандарту 0,5 за Мак-Фарландом або OD600 ~0,1).
2. Приготуйте розчини антимікробного засобу:
   Розведіть антимікробний засіб у відповідному середовищі, щоб отримати низку концентрацій (наприклад, шляхом послідовних двократних розведень).
3. Внесіть розчини у 96-лунковий планшет:
   Внесіть розчини антимікробного засобу в лунки стандартного 96-лункового планшета так, щоб кінцевий об’єм у кожній лунці становив ~150–200 µL.
   Передбачте контролі росту (без антимікробного засобу) та контролі стерильності (без бактеріального інокуляту).

Крок 2: Формування біоплівки на кришці зі штифтами

• Установіть кришку зі штифтами:
  Установіть спеціальну кришку зі штифтами на інокульовані лунки, переконавшись, що штифти повністю занурені в бактеріальну суспензію.
• Інкубуйте планшет:
  Інкубуйте за відповідної температури (наприклад, 37°C) протягом визначеного часу (наприклад, 24 годин) у статичних умовах, щоб забезпечити формування біоплівки на штифтах.

Крок 3: Вплив антимікробних засобів

• Промийте штифти:
  Вийміть кришку зі штифтами з бактеріальної суспензії та обережно промийте у стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити слабко прикріплені планктонні клітини.
• Піддайте впливу антимікробних засобів:
  Перенесіть кришку зі штифтами в новий 96-лунковий планшет, що містить попередньо підготовлені розведення антимікробного засобу.
  Інкубуйте протягом визначеного часу (наприклад, 24 годин) у статичних умовах, щоб антимікробний засіб міг подіяти на біоплівки.

Крок 4: Ультразвукова обробка за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів UIP400MTP

Етап ультразвукової обробки має вирішальне значення для відокремлення біоплівок від кришок зі штифтами з метою оцінювання життєздатності. Виконайте наведені нижче дії для ультразвукового пристрою UIP400MTP:

1. Підготуйте обладнання:
   Заповніть кожну лунку нового 96-лункового планшета середовищем для відновлення (наприклад, нейтралізувальним бульйоном або стерильним поживним середовищем).
2. Перенесіть кришку зі штифтами:
   Зніміть кришку зі штифтами з планшета для обробки антимікробним засобом.
   Промийте кришку зі штифтами у стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити залишки антимікробних засобів.
3. Розмістіть планшет в ультразвуковому пристрої:
   Установіть кришку зі штифтами на планшет із середовищем для відновлення.
   Помістіть планшет із середовищем для відновлення в ультразвуковий пристрій UIP400MTP, переконавшись, що планшет розташований по центру та стоїть стійко, як описано в інструкції.
4. Налаштуйте параметри ультразвукової обробки:
   Установіть параметри ультразвукової обробки на UIP400MTP (налаштування можна адаптувати до біоплівки):
   Амплітуда: 70–100%.
   Час ультразвукової обробки: 1–3 хвилини (коригуйте залежно від структури біоплівки) у циклічному режимі.
5. Проведіть ультразвукову обробку:
   Запустіть процес ультразвукової обробки. Ультразвукові хвилі зруйнують матрикс біоплівки та відокремлять клітини, вивільнивши їх у середовище для відновлення.
6. Контролюйте процес:
   Використовуйте під’єднуваний датчик температури для контролю температури зразків у лунках. Для охолодження UIP400MTP можна під’єднати до лабораторного чилера.
7. Дії після ультразвукової обробки:
   Негайно перенесіть середовище для відновлення, що містить відокремлені біоплівки, у новий стерильний планшет для подальшого аналізу.

(A) Планшет із TSB з 2% глюкози, використаний для формування біоплівки, відновлення клітин і визначення MIC та MBEC; (B) Кришка зі штифтами для формування стафілококових біоплівок.
Клітини біоплівки, що утворилася на штифтах, відокремлювали за допомогою ультразвукової обробки (Hielscher Ultrasound Technology) протягом 5 min у 96-лункових планшетах зі свіжим поживним середовищем для відновлення клітин.
(Зображення та дослідження: ©de Oliveira et al., 2016)

Крок 4: Оцінювання життєздатності

Висійте та культивуйте відокремлені біоплівки:

1. Виконайте серійні розведення середовища для відновлення та висійте на агар для підрахунку колонієутворювальних одиниць (CFU).
2. Визначте MIC:
   Визначте MIC як найнижчу концентрацію антимікробного засобу, що повністю пригнічує видимий ріст мікроорганізмів у середовищі для відновлення.

Мінімальна інгібувальна концентрація MIC: приклад мікротитрувального планшета та інтерпретація результатів мікророзведень.
(Дослідження та зображення: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Кому корисна ультразвукова обробка під час визначення MIC?

• Виробникам медичних виробів: Для перевірки ефективності поверхневих покриттів і валідації протоколів очищення виробів, схильних до утворення біоплівок.
• Клінічним мікробіологам: Для точної діагностики інфекцій, пов’язаних з імплантатами (наприклад, PJI), шляхом виділення бактерій із медичних конструкцій.
• Розробникам фармацевтичних препаратів: Для оцінювання ефективності нових антимікробних засобів проти стійких патогенів, вбудованих у біоплівку.
• Науковим дослідникам: Для проведення високопродуктивних, відтворюваних досліджень біології біоплівок і механізмів антимікробної резистентності.
• Промисловим підрозділам контролю якості: Для оцінювання біообростання та ефективності дезінфекційних засобів у промислових умовах (наприклад, із використанням стандартів ASTM E2799-22).

Проєктування, виробництво та консультування – якість із Німеччини

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своєю найвищою якістю та найвищими стандартами проєктування. Міцність і простота експлуатації забезпечують безперешкодну інтеграцію наших ультразвукових апаратів у промислові установки. Ультразвукові апарати Hielscher легко витримують суворі умови експлуатації та складне робоче середовище.

Hielscher Ultrasonics – компанія, сертифікована за ISO, яка приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, що поєднують найсучасніші технології та зручність користування. Звісно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE, а також вимогам UL, CSA та RoHs.

Прочитайте тут, як UIP400MTP використовують для відокремлення біоплівки за протоколом ASTM E2799 – перевірка ефективності дезінфекційних засобів проти біоплівки Pseudomonas aeruginosa за допомогою аналізу MBEC.