Протокол аналізу мінімальної інгібіторної концентрації (MIC)

Аналіз мінімальної інгібіторної концентрації на основі біоплівки (MIC) є важливим методом оцінки ефективності антимікробних засобів проти мікроорганізмів, пов'язаних з біоплівкою, які виявляють підвищену резистентність завдяки своєму захисному позаклітинному матриксу. Важливим кроком у цьому аналізі є порушення структур біоплівки для вивільнення вбудованих клітин для точної оцінки життєздатності. Багатолунковий пластинчастий ультразвуковий UIP400MTP полегшує цей процес, використовуючи сфокусований ультразвук для генерації контрольованої кавітації, ефективно від'єднуючи клітини біоплівки та розсіюючи їх у однорідну суспензію. Це точне та відтворюване руйнування біоплівки підвищує надійність та пропускну здатність аналізів МІК, роблячи UIP400MTP важливим інструментом у просуванні досліджень біоплівки.

УЗД при відшаруванні біоплівки

Аналіз МІК на основі біоплівки зазвичай вимірює життєздатність бактерій або пригнічення росту за допомогою таких методів, як покриття, підрахунок колоній або вимірювання оптичної щільності. Ультразвукова діагностика є критично важливим етапом аналізу МІК на основі біоплівки при оцінці антимікробної чутливості мікроорганізмів, пов'язаних з біоплівкою. Його основна функція полягає в від'єднанні та розсіювання клітин, вбудованих у матрикс біоплівки, в однорідну суспензію для точного аналізу.
Біоплівки значно стійкіші до антимікробних агентів порівняно з планктонними клітинами, що робить правильне відшарування критично важливим для точного аналізу. Під час цього процесу ультразвукові хвилі генерують контрольовану кавітацію, розриваючи матрикс біоплівки та вивільняючи вбудовані клітини в однорідну суспензію в середовищі відновлення. Цей крок дозволяє точно оцінити життєздатність клітин, диспергованих біоплівкою, за допомогою таких методів, як покриття, розведення та підрахунок колоній. Правильне руйнування біоплівки за допомогою ультразвуку перешкоджає залишковим компонентам матриксу захищати клітини, що в іншому випадку могло б призвести до недооцінки антимікробної активності. Для цієї мети особливо добре підходить багатолунковий пластинчастий UIP400MTP, пропонуючи точні та відтворювані умови ультразвуку для забезпечення надійного та високопродуктивного приготування пробірних пластин.

Чому ультразвукова діагностика необхідна в аналізі мінімальної інгібітрорної концентрації на основі біоплівки

Для вимірювання життєздатності і підрахунку клітин потрібне повне і надійне від'єднання і розсіювання одиничних клітин. UIP400MTP сприяє рівномірному, не пошкоджуючому відшаруванню біоплівки та дисперсії клітин для отримання надійних результатів аналізу.

• Складність біоплівки: Біоплівки — це структуровані мікробні спільноти, укладені в матрикс позаклітинної полімерної речовини (EPS), яка захищає мікроорганізми та робить їх більш стійкими до антимікробних агентів.
• Рівномірна дисперсія: Щоб точно виміряти життєздатність клітин, вбудованих у біоплівку, або їх чутливість до протимікробних препаратів, біоплівку спочатку необхідно видалити та розбити на однорідну суспензію.

Протокол аналізу мінімальної інгібуючої концентрації на основі біоплівки

Аналіз мінімальної інгібуючої концентрації (MIC) визначає найнижчу концентрацію антимікробного агента, необхідного для пригнічення видимого росту мікроорганізмів. Цей протокол розроблений для мікроорганізмів, пов'язаних з біоплівкою, використовуючи UIP400MTP багатолунковий пластинчастий саунікатор для руйнування біоплівки.

Крок 1: Приготування бактеріального посівного матеріалу

1. Приготуйте бактеріальну суспензію:
   Вирощують бактерії у відповідних середовищах до середини логарифмічної фази.
   Розбавте культуру для досягнення стандартизованої щільності клітин (наприклад, 0,5 стандарту McFarland або OD600 ~ 0,1).
2. Приготуйте протимікробні розчини:
   Розведіть антимікробний засіб у відповідному середовищі для створення діапазону концентрацій (наприклад, дворазове серійне розведення).
3. Вилийте в тарілку 96well:
   Додайте антимікробні розчини в лунки стандартної 96-лункової пластини з кінцевим об'ємом свердловини ~150–200 мкл.
   Включають контроль росту (без антимікробних препаратів) і контроль стерильності (без бактеріального інокуляту).

Крок 2: Формування біоплівки на кришці Peg Lid

• Прикріпіть кришку з кілочками:
  Помістіть спеціальну кришку з кілочками на інокульовані лунки, переконавшись, що кілочки повністю занурені в бактеріальну суспензію.
• Інкубують тарілку:
  Інкубувати при відповідній температурі (наприклад, 37 ° C) протягом певного часу (наприклад, 24 години) в статичних умовах, щоб забезпечити утворення біоплівки на кілочках.

Крок 3: Антимікробний вплив

• Промийте кілочки:
  Зніміть кришку з бактеріальної суспензії та обережно промийте її в стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити нещільно прикріплені планктонні клітини.
• Піддавати впливу протимікробних препаратів:
  Перемістіть кришку з кілочками в нову пластину на 96 лунок, що містить антимікробні розведення, приготовані раніше.
  Інкубувати протягом певного періоду (наприклад, 24 години) у статичних умовах, щоб антимікробний засіб міг діяти на біоплівки.

Крок 4: Ультразвукове дослідження за допомогою мікропланшетного сонікатора UIP400MTP

Етап ультразвукової діагностики має вирішальне значення для від'єднання біоплівок від кришок для оцінки життєздатності. Дотримуйтесь цих кроків для UIP400MTP УЗД:

1. Підготуйте налаштування:
   У кожну лунку наповніть свіжу 96-лункову тарілку середовищем для відновлення (наприклад, нейтралізуючим бульйоном або стерильним середовищем для росту).
2. Перемістіть кришку з кілочками:
   Зніміть кришку з антимікробної обробної пластини.
   Промийте кришку в стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити залишки антимікробних засобів.
3. Розташуйте пластину в ультразвуковому апараті:
   Прикріпіть кришку з кілочками до пластини середовища відновлення.
   Помістіть пластину середовища відновлення в UIP400MTP ультразвуковий прилад, переконавшись, що пластина розташована по центру та стабільна, як описано в описаному посібнику.
4. Відрегулюйте параметри ультразвуку:
   Встановіть параметри УЗД на UIP400MTP (налаштування можуть бути скориговані відповідно до біоплівки):
   Амплітуда: 70–100%.
   Час ультразвуку: 1–3 хвилини (коригування залежно від структури біоплівки) в режимі циклу.
5. Зробіть звук:
   Запустіть процес ультразвукового дослідження. Ультразвукові хвилі порушать матрикс біоплівки і витіснять клітини в середовище відновлення.
6. Слідкуйте за процесом:
   Використовуйте змінний датчик температури для контролю температури зразка в лунках. Для охолодження UIP400MTP можна підключити до лабораторного чиллера.
7. Обробка після УЗД:
   Негайно перенесіть середовище відновлення, що містить відшаровані біоплівки, у свіжу стерильну пластину для подальшого аналізу.

(A) Планшет, що містить TSB з 2% глюкозою, що використовується для формування біоплівки, відновлення клітин та визначення MIC та MBEC; (B) Кришка зі штифтами для формування стафілококових біоплівок.
Клітини біоплівки, що утворилися на штифтах, витісняли методом ультразвуку (ультразвукова технологія Hielscher) протягом 5 хв у 96-лункових пластинах, що містили свіже живильне середовище для відновлення клітин.
(Малюнок і дослідження: ©de Oliveira et al., 2016)

Крок 4: Оцінка життєздатності

Відокремлені біоплівки пластин і культур:

1. Виконайте послідовні розведення відновлювального середовища та пластини на агарі для перерахування колонієутворюючих одиниць (КУО).
2. Оцініть MIC:
   Визначте МІК як найнижчу концентрацію антимікробів, яка повністю пригнічує видимий ріст мікроорганізмів у відновлювальному середовищі.

Мінімальна інгібуюча концентрація МІК: приклад мікротитрової пластини та інтерпретація результатів мікророзведення.
(Дослідження та зображення: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.

Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.

Як використовується UIP400MTP для відшарування біоплівки в протоколі ASTM E2799 читайте тут – Перевірка ефективності дезінфікуючого засобу проти біоплівки Pseudomonas aeruginosa за допомогою аналізу MBEC.