Протокол аналізу MBEC із використанням ультразвукового пристрою UIP400MTP для 96-лункових планшетів

Аналіз MBEC використовують для визначення концентрації антимікробних засобів, необхідної для усунення біоплівок, сформованих на кришках зі штифтами. Щоб оцінити життєздатність біоплівок, їх спочатку потрібно відокремити від кришок зі штифтами 96-лункового планшета. Ультразвукова обробка є найнадійнішим і найефективнішим методом такого відокремлення. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів спеціально розроблено для обробки аналітичних планшетів із максимальною ефективністю та зручністю, що спрощує та прискорює високопродуктивні аналізи MBEC.

Ультразвукова обробка для відокремлення біоплівок

Ультразвукова обробка є надзвичайно важливим етапом аналізів мінімальної концентрації ерадикації біоплівки (MBEC), забезпечуючи ефективне відокремлення клітин біоплівки від поверхні, до якої вони прикріплені. Біоплівки за своєю природою є структурованими угрупованнями мікроорганізмів, оточеними позаклітинним матриксом, що робить їх значно стійкішими до антимікробних засобів порівняно з планктонними клітинами. Під час аналізів MBEC ультразвукова обробка за допомогою ультразвукових хвиль створює контрольовану кавітацію, руйнуючи матрикс біоплівки та вивільняючи вбудовані в нього клітини в суспензію. Цей етап забезпечує рівномірне диспергування клітин біоплівки в середовищі для відновлення, сприяючи точному оцінюванню життєздатності за допомогою висівання, розведення або спектрофотометричних методів. Без належного відокремлення біоплівки залишкові компоненти матриксу можуть захищати клітини, призводячи до недооцінювання ефективності антимікробних засобів. Тому ультразвукова обробка незамінна для отримання надійних і відтворюваних значень MBEC, які відображають справжній ерадикаційний потенціал досліджуваних засобів. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів дає змогу легко виконувати високопродуктивну підготовку зразків в аналітичних планшетах.

Протокол аналізу мінімальної концентрації ерадикації біоплівки (MBEC)

Етап 1: Формування біоплівки

1. Підготуйте бактеріальну суспензію:
   Вирощуйте бактерії у відповідних середовищах до логарифмічної фази росту.
   Розведіть бактеріальну культуру до визначеної оптичної густини (наприклад, OD600 ~0,1).
2. Інокулюйте 96-лунковий планшет:
   Додайте бактеріальну суспензію (наприклад, 150–200 µL) у кожну лунку стандартного 96-лункового мікротитраційного планшета.
3. Установіть кришку зі штифтами:
   Установіть кришку зі штифтами на інокульований планшет, щоб забезпечити формування біоплівки на поверхнях штифтів.
4. Інкубуйте планшет:
   Інкубуйте систему за відповідної температури (наприклад, 37°C) протягом 24–48 годин без струшування, щоб сприяти росту біоплівки.

Етап 2: Обробка антимікробними засобами

• Підготуйте розчини антимікробних засобів:
  Приготуйте у свіжих середовищах розчини антимікробних засобів із низкою концентрацій.
  Піддайте біоплівки дії антимікробних засобів:
  Зніміть кришку зі штифтами з планшета з бактеріальною культурою та промийте її в стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити планктонні клітини.
  Помістіть кришку зі штифтами в новий 96-лунковий планшет, що містить розчини антимікробних засобів.
• Інкубуйте планшет:
  Інкубуйте протягом визначеного періоду (наприклад, 24 годин), щоб забезпечити дію антимікробних засобів.

Етап 3: Ультразвукова обробка за допомогою пристрою UIP400MTP для 96-лункових планшетів

Етап ультразвукової обробки є критично важливим для відокремлення біоплівок від кришок зі штифтами з метою оцінювання життєздатності. Виконайте наведені нижче дії для ультразвукового пристрою UIP400MTP:

1. Підготуйте систему:
   Додайте середовище для відновлення (наприклад, нейтралізувальний бульйон або свіже поживне середовище) у кожну лунку нового 96-лункового планшета.
2. Перенесіть кришку зі штифтами:
   Зніміть кришку зі штифтами з планшета для обробки антимікробними засобами.
   Промийте кришку зі штифтами в стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити залишки антимікробних засобів.
3. Розмістіть планшет і ультразвуковий пристрій:
   Установіть кришку зі штифтами на планшет із середовищем для відновлення.
   Помістіть планшет із середовищем для відновлення на платформу ультразвукового пристрою UIP400MTP, переконавшись, що планшет розташований по центру та стійко встановлений.
4. Налаштуйте параметри ультразвукової обробки:
   Установіть параметри ультразвукової обробки на UIP400MTP (налаштування можна адаптувати до біоплівки):
   Амплітуда: 70–100%.
   Час ультразвукової обробки: 1–3 хвилини (коригуйте залежно від міцності біоплівки) у циклічному режимі.
5. Виконайте ультразвукову обробку:
   Запустіть процес ультразвукової обробки. Ультразвукові коливання відокремлять біоплівки від поверхонь штифтів у середовище для відновлення.
6. Контролюйте процес:
   Використовуйте під’єднуваний датчик температури для контролю температури зразків у лунках. Для охолодження UIP400MTP можна під’єднати до лабораторного чилера.
7. Дії після ультразвукової обробки:
   Негайно перенесіть середовище для відновлення (яке тепер містить відокремлені біоплівки) у новий стерильний планшет для подальшого аналізу.

(A) Планшет, що містить TSB із 2% глюкози та використовується для формування біоплівки, відновлення клітин і
визначення MIC та MBCB; (B) Кришка зі штифтами для формування стафілококових біоплівок. визначення MIC та MBCB; (B) Кришка зі штифтами для формування стафілококових біоплівок.
Клітини біоплівки, сформованої на штифтах, відокремлювали ультразвуковою обробкою (Hielscher Ultrasound Technology) протягом 5 min у 96-лункових планшетах, що містили свіже культуральне середовище для відновлення клітин.
(Зображення та дослідження: ©de Oliveira et al., 2016)

Етап 4: Оцінювання життєздатності

Висійте та культивуйте відокремлені біоплівки:

1. Виконайте серійні розведення середовища для відновлення та висійте на агар для підрахунку колонієутворювальних одиниць (CFU).
   Як альтернативу використовуйте колориметричний або флуоресцентний аналіз життєздатності.
2. Запишіть результати:
   Визначте MBEC як найнижчу концентрацію антимікробного засобу, яка усунула життєздатність біоплівки, що піддається виявленню.

Проєктування, виробництво та консультування – якість, створена в Німеччині

Ультразвукові пристрої Hielscher добре відомі найвищими стандартами якості та проєктування. Надійність і простота експлуатації забезпечують безперешкодну інтеграцію наших ультразвукових пристроїв у промислові об’єкти. Ультразвукові пристрої Hielscher легко справляються із суворими умовами та вимогливими середовищами експлуатації.

Hielscher Ultrasonics є компанією, сертифікованою за ISO, і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим пристроям, що поєднують найсучасніші технології та зручність користування. Звісно, ультразвукові пристрої Hielscher відповідають вимогам CE та задовольняють вимоги UL, CSA і RoHs.

Читайте тут, як UIP400MTP використовують для відокремлення біоплівок на етапі підготовки зразків у межах протоколу ASTM E2799 для перевірки ефективності дезінфекційних засобів проти біоплівки Pseudomonas aeruginosa за допомогою аналізу MBEC.