Протокол аналізу MBEC з використанням 96-лункового пластинчастого фонікатора UIP400MTP

Аналіз MBEC використовується для визначення концентрації антимікробних агентів, необхідних для усунення біоплівок, що утворюються на кришках пег. Щоб оцінити життєздатність біоплівки, біоплівки спочатку повинні бути від'єднані від кришок пег 96-лункової тарілки. Ультразвукове дослідження є найбільш надійним і ефективним методом при цьому відшаруванні. Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP спеціально розроблений для обробки пробірних пластин з максимальною ефективністю та зручністю, оптимізуючи та прискорюючи високопродуктивні аналізи MBEC.

УЗД при відшаруванні біоплівки

Ультразвукова діагностика є важливим етапом у аналізі мінімальної концентрації ерадикації біоплівки (MBEC), що дозволяє ефективно видаляти клітини біоплівки з їх поверхневого прикріплення. Біоплівки за своєю суттю є структурованими спільнотами мікроорганізмів, укладеними в позаклітинний матрикс, що робить їх значно стійкішими до антимікробних агентів порівняно з планктонними клітинами. Під час аналізів MBEC ультразвукові хвилі використовують ультразвукові хвилі для створення контрольованої кавітації, порушуючи матрикс біоплівки та вивільняючи вбудовані клітини в суспензію. Цей етап гарантує, що клітини біоплівки рівномірно розподілені в середовищі відновлення, що сприяє точній оцінці життєздатності за допомогою покриття, розведення або спектрофотометричних методів. Без належного відшарування біоплівки залишкові компоненти матриксу можуть екранувати клітини, що призводить до недооцінки антимікробної ефективності. Таким чином, ультразвукова діагностика є необхідною для отримання надійних і відтворюваних значень MBEC, що відображають справжній потенціал ерадикації тестованих засобів. Багатолунковий пластинчастий ультразвуковий UIP400MTP дозволяє легко проводити високопродуктивну підготовку зразків у пробірних пластинах.

Протокол аналізу мінімальної концентрації ерадикації біоплівки (MBEC)

Крок 1: Формування біоплівки

1. Приготуйте бактеріальну суспензію:
   Вирощуйте бактерії у відповідних середовищах для логарифмічної фази росту.
   Розбавте бактеріальну культуру до визначеної оптичної щільності (наприклад, OD600 ~ 0,1).
2. Прищеплюють 96-лункову пластину:
   Додайте бактеріальну суспензію (наприклад, 150–200 мкл) у кожну лунку стандартної 96-лункової мікротитрної пластинки.
3. Прикріпіть кришку з кілочками:
   Помістіть кришку з кілочками на інокульовану пластину, щоб забезпечити утворення біоплівки на поверхнях кілочків.
4. Інкубують тарілку:
   Інкубуйте установку при відповідній температурі (наприклад, 37 °C) протягом 24–48 годин без струшування, щоб сприяти росту біоплівки.

Крок 2: Лікування протимікробними засобами

• Приготуйте протимікробні розчини:
  Приготуйте ряд антимікробних концентрацій у свіжих середовищах.
  Піддають біоплівки впливу протимікробних агентів:
  Зніміть кришку з бактеріальної культури і промийте її в стерильному фізіологічному розчині або PBS для видалення планктонних клітин.
  Помістіть кришку з кілочками в нову пластину на 96 лунок, що містить антимікробні розчини.
• Інкубують тарілку:
  Інкубувати протягом певного періоду (наприклад, 24 години) для забезпечення антимікробного впливу.

Крок 3: Ультразвукове дослідження за допомогою 96-лункового пластинчастого сонікатора UIP400MTP

Етап ультразвукової діагностики має вирішальне значення для від'єднання біоплівок від кришок для оцінки життєздатності. Дотримуйтесь цих кроків для UIP400MTP УЗД:

1. Підготуйте налаштування:
   У кожну лунку наповніть свіжу 96-лункову тарілку середовищем для відновлення (наприклад, нейтралізуючим бульйоном або свіжим середовищем для росту).
2. Перемістіть кришку з кілочками:
   Зніміть кришку з антимікробної обробної пластини.
   Промийте кришку в стерильному фізіологічному розчині або PBS, щоб видалити залишки антимікробних засобів.
3. Розташуйте пластину та ультразвуковий прилад:
   Прикріпіть кришку з кілочками до пластини середовища відновлення.
   Помістіть пластину середовища для відновлення на платформу UIP400MTP ультразвукового апарату, переконавшись, що пластина відцентрована та стабільна.
4. Відрегулюйте параметри ультразвуку:
   Встановіть параметри УЗД на UIP400MTP (налаштування можна регулювати відповідно до біоплівки):
   Амплітуда: 70–100%.
   Час ультразвуку: 1–3 хвилини (регулюється залежно від міцності біоплівки) в режимі циклу.
5. Зробіть звук:
   Запустіть процес ультразвукового дослідження. Ультразвукова вібрація витісняє біоплівки з поверхонь PEG у середовище відновлення.
6. Слідкуйте за процесом:
   Використовуйте змінний датчик температури для контролю температури зразка в лунках. Для охолодження UIP400MTP можна підключити до лабораторного чиллера.
7. Обробка після УЗД:
   Негайно перенесіть середовище для відновлення (тепер містить відокремлені біоплівки) у свіжу стерильну тарілку для подальшого аналізу.

(A) Пластина, що містить TSB з 2% глюкозою, що використовується для формування біоплівки, відновлення клітин;
визначення ВПК і МБКБ; (B) Кришка зі штифтами для формування стафілококових біоплівок. визначення ВПК і МБКБ; (B) Кришка зі штифтами для формування стафілококових біоплівок.
Клітини біоплівки, що утворилися на штифтах, витісняли методом ультразвуку (ультразвукова технологія Hielscher) протягом 5 хв у 96-лункових пластинах, що містили свіже живильне середовище для відновлення клітин.
(Малюнок і дослідження: ©de Oliveira et al., 2016)

Крок 4: Оцінка життєздатності

Відокремлені біоплівки пластин і культур:

1. Виконайте послідовні розведення відновлювального середовища та пластини на агарі для перерахування колонієутворюючих одиниць (КУО).
   Крім того, використовуйте колориметричний аналіз або аналіз життєздатності на основі флуоресценції.
2. Результати запису:
   Визначте MBEC як найнижчу концентрацію антимікробних препаратів, які ліквідували виявлену життєздатність біоплівки.

Проектування, виробництво та консалтинг – Якість зроблено в Німеччині

Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.

Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.

Як використовується UIP400MTP для відшарування біоплівки як етап підготовки зразка під час протоколу ASTM E2799 для перевірки ефективності дезінфікуючого засобу проти біоплівки Pseudomonas aeruginosa за допомогою аналізу MBEC.