Протокол культивування та відокремлення біоплівки Staphylococcus

Стандартизовані методи мають важливе значення для отримання надійних результатів досліджень. Тут наведено протокол культивування та відокремлення стафілококових біоплівок. Цей протокол зосереджений на оптимізованій високопродуктивній підготовці зразків із використанням ультразвукового пристрою UIP400MTP для багатолункових планшетів, що забезпечує ефективне високопродуктивне відокремлення біоплівок у 96-лункових планшетах. Протокол також містить основні етапи культивування, промивання та візуалізації біоплівок з акцентом на мінімізації варіабельності та забезпеченні відтворюваності.

Біоплівки Staphylococcus і дослідження антибіотиків

Біоплівки Staphylococcus відіграють ключову роль у персистентних інфекціях через свою стійкість до антибіотиків та імунних реакцій. Утворення біоплівки створює захисне середовище для бактерій, що ускладнює лікування інфекцій. Дослідження біоплівок часто зосереджуються на вивченні їхнього утворення, поведінки та чутливості до антимікробних засобів з акцентом на високопродуктивних методах для оптимізації експериментальних робочих процесів.
Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів надає значну перевагу в дослідженні біоплівок, забезпечуючи швидке й ефективне відокремлення біоплівок від 96-лункових планшетів. Цей пристрій рівномірно подає ультразвукову енергію до всіх лунок, забезпечуючи узгоджені результати та мінімізуючи варіабельність.

Протокол культивування та відокремлення біоплівки Staphylococcus

Нижче наведено покрокову інструкцію з культивування та відокремлення біоплівки Staphylococcus. Як приклад аналітичного етапу показано, як спектрофотометрично визначити кількість вирощеної біомаси шляхом забарвлення кристалічним фіолетовим.

Культивування біоплівки Staphylococcus

Необхідні матеріали:

• Стерильні плоскодонні 96-лункові полістирольні мікротитраційні планшети з кришками, оброблені для культивування тканин
• Триптиказо-соєвий бульйон (TSB) із 0,25% глюкози
• Шафа біологічної безпеки

Етапи:

1. Підготуйте стерильне робоче середовище в шафі біологічної безпеки, щоб мінімізувати контамінацію.
2. Додайте TSB, що містить 0,25% глюкози, у лунки мікротитраційного планшета. TSB без глюкози зазвичай не сприяє утворенню біоплівки, тому його слід використовувати лише як контроль, якщо це необхідно.
3. Інокулюйте лунки бактеріальними штамами, підготовленими, як описано нижче:
4. Підготуйте бактеріальні суспензії, забезпечивши відсутність попередньо сформованих скупчень клітин шляхом гомогенізації суспензій ультразвуковою обробкою або руйнування скупчень голкою калібру 23 з подальшим короткочасним перемішуванням на вортексі.
5. Закрийте планшет його кришкою та інкубуйте за умов, оптимальних для утворення біоплівки (наприклад, за 37°C протягом 24 годин).
6. Проводьте експеримент у трьох повторностях для кожного бактеріального штаму (три лунки на штам), щоб забезпечити надійність результатів.
7. Виділіть шість лунок у кожному планшеті для негативних контролів. В одному 96-лунковому планшеті можна досліджувати до 30 штамів.

Візуалізація та промивання біоплівки

1. Після інкубації обережно видаліть середовище, щоб не порушити біоплівку.
2. Промийте кожну лунку чотири рази фізіологічним розчином, щоб видалити планктонні бактерії.
3. Огляньте дно лунок на наявність білих ділянок, що свідчать про наявність біоплівки.

Відокремлення біоплівки за допомогою ультразвукового пристрою UIP400MTP для багатолункових планшетів

Налаштування та параметри пристрою:

• Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів
• Робочі налаштування: амплітуда 60%, циклічний режим із 60 секундами роботи / 30 секундами паузи

Етапи:

1. Помістіть промитий мікротитраційний планшет на платформу UIP400MTP.
2. Обробіть зразки ультразвуком за рекомендованих налаштувань (амплітуда 60%, 60 секунд роботи, 30 секунд паузи). Скоригуйте налаштування відповідно до бактеріального штаму.
3. Запустіть ультразвукову обробку для відокремлення біоплівки. Ультразвукові хвилі руйнують матрикс біоплівки, вивільняючи прикріплені бактерії.
4. UIP400MTP забезпечує рівномірний вплив у всіх лунках для отримання узгоджених результатів відокремлення.

Аналітичний етап: кількісне визначення біомаси відокремленої біоплівки Staphylococcus за допомогою кристалічного фіолетового (CV)

Необхідні матеріали:

• 0,1% розчин кристалічного фіолетового (CV)
• 95% етанол або 30% оцтова кислота (для солюбілізації)
• Мікропланшетний рідер, здатний виконувати вимірювання за довжини хвилі 570 nm
• Стерильні мікротитрувальні планшети для фарбування

Етапи:

1. Підготовка планшета для фарбування: перенесіть 100 µL суспензії відокремленої біоплівки з кожної лунки планшета, обробленого ультразвуком, у відповідні лунки чистого стерильного 96-лункового мікротитрувального планшета. Це забезпечує чисте й однорідне середовище для фарбування.
2. Фарбування відокремленої біоплівки: додайте 150 µL 0,1% розчину кристалічного фіолетового до кожної лунки, що містить суспензію відокремленої біоплівки. Обережно перемішайте піпетуванням, щоб забезпечити рівномірне змішування суспензії біоплівки та кристалічного фіолетового.
3. Інкубація: інкубуйте планшет за кімнатної температури протягом 15 хвилин, щоб кристалічний фіолетовий ефективно забарвив біомасу.
4. Промивання: після інкубації обережно видаліть розчин кристалічного фіолетового з лунок, не порушуючи біомасу. Промийте кожну лунку тричі стерильним фізіологічним розчином, щоб видалити незв’язаний барвник.
5. Висушування: дайте планшету висохнути на повітрі за кімнатної температури або в боксі зі стерильним повітряним потоком. Уникайте нагрівання, оскільки це може змінити результати.
6. Солюбілізація: додайте до кожної лунки 200 µL 95% етанолу (або 30% оцтової кислоти, залежно від стандартних лабораторних практик), щоб солюбілізувати зв’язаний кристалічний фіолетовий. Обережно перемішуйте піпетуванням або струшуванням планшета протягом 10 хвилин за кімнатної температури.
7. Вимірювання: виміряйте оптичну густину (OD) розчину солюбілізованого кристалічного фіолетового за довжини хвилі 570 nm за допомогою мікропланшетного рідера.
8. Аналіз даних: відніміть середнє значення OD570 негативних контролів (лунок із TSB, але без бактеріального інокуляту) від значень для дослідних лунок, щоб урахувати фонове забарвлення. Запишіть і проаналізуйте дані.

Примітка: виконуйте експеримент у трьох повторностях для кожної умови, щоб забезпечити відтворюваність. Забезпечте належне поводження з кристалічним фіолетовим та етанолом, дотримуючись протоколів безпеки й утилізації.
 

Основні переваги UIP400MTP:

• Високопродуктивна обробка: Розроблений спеціально для багатолункових планшетів, що дає змогу обробляти кілька зразків одночасно.
• Рівномірний розподіл ультразвуку: Забезпечує однакову інтенсивність ультразвуку в усіх лунках, даючи узгоджені результати для всіх зразків.
• Використовуйте будь-який стандартний планшет: UIP400MTP може обробляти будь-які стандартні багатолункові планшети, чашки Петрі та штативи з пробірками. Дорогі спеціальні планшети виробника не потрібні!
• Зручний інтерфейс: Простий у налаштуванні та керуванні, що робить його чудовим інструментом для підвищення продуктивності лабораторії. Програмовані налаштування й автоматизація сприяють стандартизації процесу!