Протокол культивування та відшарування біоплівки стафілокока

Стандартизовані методи мають важливе значення для надійних результатів досліджень. Тут ви можете знайти протокол культивування та відокремлення стафілококових біоплівок. Цей протокол зосереджений на оптимізованій високопродуктивній підготовці зразків з використанням UIP400MTP багатолункового пластинчастого фонікатора для ефективного, високопродуктивного відшарування біоплівки в 96-лункових пластинах. Протокол також містить ключові кроки для культивування, промивання та візуалізації біоплівки з акцентом на мінімізацію варіабельності та забезпечення відтворюваності.

Біоплівка стафілокока та дослідження антибіотиків

Біоплівки стафілокока відіграють важливу роль у персистуючих інфекціях через їх стійкість до антибіотиків та імунні реакції. Утворення біоплівки забезпечує захисне середовище для бактерій, що ускладнює лікування інфекцій. Дослідження біоплівок часто зосереджуються на розумінні їх формування, поведінки та чутливості до антимікробних препаратів, з акцентом на високопродуктивні методи для оптимізації експериментальних робочих процесів.
Багатолунковий пластинчастий фонікатор UIP400MTP пропонує значну перевагу в дослідженні біоплівки, дозволяючи швидко та ефективно відокремлювати біоплівки від 96-лункових пластин. Цей пристрій забезпечує рівномірну ультразвукову енергію на всі свердловини, забезпечуючи стабільні результати при мінімізації варіативності.

Протокол культивування та відшарування біоплівки стафілокока

Нижче ми розповімо вам про покрокову інструкцію щодо процесу культивування та від'єднання біоплівки стафілокока. В якості зразкового аналітичного кроку ми покажемо вам, як кількісно визначити спектрофотометрично культивовану біомасу шляхом фарбування кристальним фіалкою.

Культивування біоплівки стафілокока

Необхідні матеріали:

• Стерильні планшети з плоским дном на 96 лунок з полістирольної тканини, оброблені культурою мікротитру, з кришками
• Триптичний соєвий бульйон (TSB) з 0,25% глюкози
• Кабінет біологічної безпеки

Кроки:

1. Підготуйте стерильне робоче середовище в шафі біологічної безпеки, щоб мінімізувати забруднення.
2. Додайте ТСБ, що містить 0,25% глюкози, в лунки мікротитрової пластини. ТСБ без глюкози, як правило, не сприяє утворенню біоплівки і повинен використовуватися як засіб контролю лише за необхідності.
3. Інокулюють лунки штамами бактерій, приготованими нижче:
4. Приготуйте бактеріальні суспензії, переконавшись у відсутності вже існуючих клітинних кластерів, гомогенізуючи суспензії за допомогою ультразвуку або розбиваючи скупчення голкою 23-го калібру та короткочасним завихренням.
5. Закрийте пластину кришкою та інкубуйте в умовах, оптимальних для утворення біоплівки (наприклад, при 37 °C протягом 24 годин).
6. Виконуйте експеримент у трьох примірниках для кожного бактеріального штаму (три лунки на штам), щоб переконатися в надійності.
7. Виділіть по шість свердловин на одну плиту для негативного контролю. На 96-лункову плиту можна перевірити до 30 штамів.

Візуалізація та промивання біоплівки

1. Після інкубації обережно викиньте середовище, щоб не порушити біоплівку.
2. Кожну добре промийте чотири рази фізіологічним розчином, щоб видалити планктонні бактерії.
3. Огляньте дно лунок на наявність білих плям, що свідчать про наявність біоплівки.

Відшарування біоплівки за допомогою багатолункового пластинчастого сонника UIP400MTP

Налаштування та параметри пристрою:

• UIP400MTP багатолунковий пластинчастий сонник
• Налаштування роботи: амплітуда 60%, режим циклу з 60 секундами ON / 30 секундами OFF

Кроки:

1. Помістіть вимиту пластинку мікротитру на платформу UIP400MTP.
2. Виконуйте зразки звуком при рекомендованих налаштуваннях (60% амплітуди, 60 секунд увімкнено, 30 секунд вимкнено). Налаштуйте параметри відповідно до штаму бактерій.
3. Запустіть процес ультразвуку, щоб від'єднати біоплівку. Ультразвукові хвилі порушують матрикс біоплівки, вивільняючи прилипли бактерії.
4. Цей UIP400MTP забезпечує рівномірну експозицію на всіх свердловинах для стабільних результатів відшарування.

Аналітичний етап: кількісне визначення біомаси відокремленої біоплівки стафілокока за допомогою кристалічного фіалки (CV)

Необхідні матеріали:

• 01% розчин кристалічної фіалки (CV)
• 95% етанолу або 30% оцтової кислоти (для солюбілізації)
• Зчитувач мікропланшетів, здатний зчитувати при 570 нм
• Стерильні мікротитрові пластини для фарбування

Кроки:

1. Підготовка фарбувальної пластини: перенесіть 100 мкл відокремленої суспензії біоплівки з кожної лунки ультразвукової пластини у відповідні лунки чистої, стерильної 96-лункової мікротитрної пластини. Це забезпечує чисте та однорідне середовище для фарбування.
2. Фарбування відокремленої біоплівки: додайте 150 мкл 0,1% розчину кристалічної фіалки в кожну лунку, що містить відокремлену суспензію біоплівки. Обережно піпеткою, щоб забезпечити рівномірне змішування суспензії біоплівки та кристалічного фіолетового.
3. Інкубація: Дайте пластині інкубуватися при кімнатній температурі протягом 15 хвилин, щоб кришталевий фіалковий ефективно забарвив біомасу.
4. Промивання: Після інкубації обережно викиньте розчин кристалічної фіалки з лунок, не порушуючи біомасу. Кожну лунку промийте по три рази стерильним фізіологічним розчином, щоб видалити незв'язане пляма.
5. Сушіння: Дайте пластині висохнути на повітрі при кімнатній температурі або під стерильною витяжкою повітряного потоку. Уникайте нагрівання, оскільки це може змінити результати.
6. Розчинення: додайте 200 мкл 95% етанолу (або 30% оцтової кислоти, залежно від стандартної лабораторної практики) у кожну лунку, щоб розчинити зв'язаний кристалічний фіолет. Обережно перемішайте, піпетуючи або струшуючи тарілку протягом 10 хвилин при кімнатній температурі.
7. Вимірювання: виміряйте оптичну щільність (OD) розчину розчиненого кристалічного фіолетового кольору при 570 нм за допомогою зчитувача мікропланшетів.
8. Аналіз даних: Відніміть середнє значення OD570 негативних контрольних груп (свердловини з TSB, але без бактеріального інокуляту) з експериментальних свердловин, щоб врахувати фонове фарбування. Записуйте та аналізуйте дані.

Примітка: Виконуйте експеримент у трьох примірниках для кожної умови, щоб забезпечити відтворюваність. Забезпечте належне поводження з кристалічним фіалкою та етанолом, дотримуючись протоколів безпеки та утилізації.
 

Коротко про ключові переваги UIP400MTP:

• Високопродуктивна обробка: Розроблений спеціально для багатолункових пластин, що дозволяє обробляти кілька зразків одночасно.
• Рівномірний ультразвуковий розподіл: Забезпечує однакову інтенсивність ультразвуку на всіх свердловинах, забезпечуючи стабільні результати для всіх зразків.
• Використовуйте будь-яку стандартну плиту: З UIP400MTP впорається будь-які стандартні багатолункові тарілки, чашки Петрі і стійки для труб. Дорогі фірмові пластини не потрібні!
• Зручний інтерфейс: Простий у налаштуванні та контролі, що робить його чудовим інструментом для підвищення продуктивності лабораторії. Програмовані налаштування та автоматизація полегшують стандартизацію процесів!