Протокол протеоміки: безконтактна ультразвукова обробка покращує підготовку пептидних зразків для MS

Протеоміка «знизу вгору» стала наріжним каменем сучасного пошуку біомаркерів, структурної біології та клінічної діагностики. Розщеплюючи білки до пептидів перед аналізом методом мас-спектрометрії (MS), дослідники можуть досягти повнішого покриття амінокислотних послідовностей і надійнішого кількісного визначення. Однак підготовка біологічних зразків високої складності для MS залишається технічно складним завданням. Останні методологічні досягнення показують, як контрольована ультразвукова обробка – зокрема за допомогою безконтактного ультразвукового обробника для кількох пробірок VialTweeter та ультразвукового обробника для мікропланшетів UIP400MTP – може значно спростити цей робочий процес, покращити відтворюваність і запобігти поширеним обмеженням пропускної здатності приладів.
Ознайомтеся з детальним протоколом підготовки зразків для отримання пептидів відповідного розміру для аналізу методом MS.

Хто повинен використовувати безконтактну ультразвукову обробку для підготовки пептидних зразків?

• Лабораторії низько-верхньої протеоміки та відкриттів: Дослідники, які готують зразки високої складності для робочих процесів LC-MS або MALDI та потребують стабільного вилучення пептидів із високим виходом із різноманітних біологічних матриць.
• Користувачі S-Trap™ та Suspension Trapping: Команди, які покладаються на очищення за допомогою мікроколонок і потребують контрольованого подрібнення ДНК, щоб запобігти засміченню колонки та забезпечити плавне завантаження зразка та перетравлення.
• Клінічні та трансляційні дослідницькі групи: Лабораторії, які обробляють тканини, клітини, плазму, сироватку або спинномозкову рідину, де критично важливі відтворюваність між партіями та цілісність зразків.
• Групи кількісної та цільової MS: Лабораторії, які проводять суворі порівняльні дослідження, де зондові ультразвукові обробники створюють ризики перехресного забруднення, які можуть порушити кількісну оцінку пептидів з низькою абундантністю.
• Центральні установи та високоефективні операції: Групи, які одночасно обробляють кілька біологічних реплікатів і вигідно використовують ультразвукову обробку в закритих трубках у багатотрубному блоці за допомогою VialTweeter, що усуває необхідність очищення зонда, скорочує час ручної роботи та підтримує асептичні умови.
• Дослідники ПТМ та структурних білків: Дослідники, яким потрібна м’яка обробка з контрольованою температурою для збереження лабільних модифікацій та максимізації покриття послідовності під час лізису та гомогенізації клітин.

Огляд протоколу: від тканин і клітин до пептидів, готових для MS

Широко застосовуваний робочий процес протеоміки «знизу вгору», описаний Wojtkiewicz et al., забезпечує надійний, масштабований метод підготовки пептидних зразків із різноманітних біологічних матриць. Як вихідний матеріал використовують 50–100 mg швидкозамороженої тканини або 1–20 мільйонів клітин; протокол передбачає застосування технології захоплення суспензії (S-Trap™) для ефективного видалення детергентів, солей і забруднювачів перед ферментативним розщепленням.
Після лізису, кількісного визначення білків, відновлення та алкілування зразок підкислюють і завантажують на центрифужну колонку S-Trap™, де відбувається розщеплення трипсином/lysC. Отримані пептиди елююють, висушують і піддають аналізу методом LC-MS. У разі застосування до 50 mg тканини серця людини цей робочий процес стабільно забезпечує достатню кількість пептидів для 30–40 ін’єкцій, даючи змогу ідентифікувати понад 4 000 унікальних білків за один запуск. Хоча хімічні етапи та очищення на колонках чітко визначені, успіх усієї послідовності процедур значною мірою залежить від початкових етапів фізичного руйнування та обробки ДНК.
Протокол рекомендує використовувати ультразвуковий обробник для кількох пробірок VialTweeter для ультразвукового лізису клітин і фрагментації ДНК під дією зсувних сил – обидва етапи критично важливі для аналізу пептидів.

Ультразвуковий лізис клітин і тканин для екстракції білків

У протоколі протеоміки «знизу вгору» ультразвукова обробка є ключовим етапом лізису зразків клітин для екстракції білків для подальшого аналізу методом мас-спектрометрії. Після додавання буфера для лізису клітин із SDS до клітинного осаду зразки піддають ультразвуковій обробці за допомогою багатотрубного ультразвукового обробника VialTweeter. Протокол використовує мікроцентрифужні пробірки об’ємом 1,5 mL і передбачає роботу ультразвукового обробника при потужності 30% протягом 10 секунд увімкнено та 10 секунд вимкнено, повторюючи це 3 рази. Після очікування 1 хвилини цикл повторюють ще два рази. Зразки постійно охолоджують льодом.
Цей процес не лише сприяє руйнуванню клітин, а й є спеціально необхідним для подрібнення геномної ДНК, що вивільняється під час лізису. Ефективне подрібнення ДНК є критично важливим для зниження в’язкості зразка та запобігання засміченню колонок S-Trap™, що забезпечує оптимальне відновлення білків і надійне подальше травлення пептидів.

Критична роль ультразвукового подрібнення ДНК

Однією з найчастіших відмов у робочих процесах на основі S-Trap™ є засмічення колонки, яке майже виключно спричинене високомолекулярною геномною ДНК, що вивільняється під час гомогенізації клітин або тканин. Цілісна ДНК різко підвищує в’язкість зразка, захоплює пептиди та блокує мікропористий сорбентний шар S-Trap™.
Ультразвукова обробка вирішує цю проблему, механічно подрібнюючи ДНК на малі розчинні фрагменти. Застосовуючи контрольовану акустичну енергію, VialTweeter ефективно подрібнює нуклеїнові кислоти, не генеруючи надмірного тепла та не вносячи сторонніх забруднювачів. Це зниження в’язкості забезпечує плавне завантаження зразка, стабільну швидкість потоку та безперебійну кінетику травлення.

Оптимізовані параметри ультразвукової обробки VialTweeter

Протокол визначає високовідтворюваний режим ультразвукової обробки, оптимізований для збереження цілісності біологічних зразків і сумісності з подальшим аналізом методом MS. Для зразків у мікроцентрифужних пробірках об’ємом 1,5mL, які обробляють за допомогою безконтактного блокового ультразвукового обробника Hielscher VialTweeter, наведені нижче параметри забезпечують лізис і оптимальну фрагментацію ДНК під дією зсувних сил зі збереженням структури білків:

• Амплітуда: потужність 30%
• Циклічний режим: 10 секунд УВІМК / 10 секунд ВИМК
• Тривалість: 3 цикли (10 сек УВІМК/10 сек ВИМК) → 1-хвилинний відпочинок на льоду → повторити ще 2 рази
• Керування температурою: зразки розміщують на льоду під час обробки для запобігання термічній денатурації та передчасній ферментативній активності

Такий імпульсний підхід до ультразвукової обробки запобігає локальному перегріванню, мінімізує окиснення пептидів і забезпечує однорідне акустичне опромінення всіх пробірок. Закрита пробіркова установка також усуває потребу в очищенні зонда між зразками, різко скорочуючи час ручної роботи та варіабельність оператора.

Ключові переваги для сучасних робочих процесів протеоміки

Інтеграція VialTweeter у ваш конвеєр протеоміки «знизу вгору» пропонує кілька операційних і наукових переваг:

1. Стабільне подрібнення ДНК: Однорідна подача акустичної енергії до всіх пробірок забезпечує відтворюване зниження в’язкості та запобігає варіабельності між партіями при завантаженні S-Trap™.
2. Збереження лабільних модифікацій: Низькотемпературна обробка в крижаній ванні захищає посттрансляційні модифікації (PTM) і запобігає термічно індукованій агрегації білків під час лізису клітин.
3. Оптимізація подальшої обробки: Лізати, оброблені VialTweeter, можна безпосередньо освітлити центрифугуванням і кількісно визначити без додаткових етапів очищення, прискорюючи перехід до травлення S-Trap™.
4. Масштабованість і гнучкість: Ті самі налаштування ультразвукової обробки застосовуються як до зразків тканин із високою складністю, так і до суспензій клітин, підтримуючи робочі процеси протеоміки відкриття, цільового кількісного аналізу та глікопротеоміки. Ультразвукові обробники мікропланшетів Hielscher дозволяють легко масштабувати процес до великої кількості зразків у багатолункових планшетах.

Література / Посилання

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.