Протокол протеоміки: безконтактна ультразвукова обробка покращує підготовку пептидних зразків для масс-спектрометрії
Протеоміка «знизу вгору» стала наріжним каменем сучасного пошуку біомаркерів, структурної біології та клінічної діагностики. Завдяки розщепленню білків на пептиди перед аналізом методом мас-спектрометрії (МС) дослідники можуть досягти більш глибокого охоплення послідовностей та більш надійної кількісної оцінки. Однак підготовка біологічних зразків високої складності до МС залишається технічно складною задачею. Останні методологічні досягнення підкреслюють, як контрольована ультразвукова обробка – зокрема, з безконтактним ультразвуковим апаратом VialTweeter Multi-Tube та ультразвуковим апаратом для мікропланшетів UIP400MTP – може значно оптимізувати цей робочий процес, підвищити відтворюваність результатів та запобігти типовим перешкодам у роботі приладів.
Ознайомтеся з докладним протоколом підготовки зразків для отримання пептидів відповідного розміру для аналізу методом мас-спектрометрії.
Кому слід застосовувати безконтактну ультразвукову обробку для підготовки зразків пептидів?
- Протеоміка за принципом «знизу вгору» & Discovery Labs: Дослідники, які готують зразки високої складності для методів LC-MS або MALDI та яким необхідне стабільне вилучення пептидів з високим виходом із різних біологічних матриць.
- S-Trap™ & Блокування користувачів через підвішування: Команди, які використовують метод очищення за допомогою мікроколон і яким необхідне контрольоване розщеплення ДНК для запобігання засміченню колон та забезпечення безперебійного завантаження зразків і їх розщеплення.
- Клінічних & Групи, що займаються трансляційними дослідженнями: Лабораторії, що проводять обробку тканин, клітин, плазми, сироватки або спинномозкової рідини, де відтворюваність результатів від партії до партії та цілісність зразків мають вирішальне значення.
- Кількісний & Цільові групи в MS Teams: Лабораторії, що проводять ретельні порівняльні дослідження, в яких ультразвукові апарати з багаторазовими зондами створюють ризик перехресного забруднення, що може негативно вплинути на кількісний аналіз пептидів з низькою концентрацією.
- Основні об'єкти & Операції з високою пропускною здатністю: Групи, які одночасно обробляють кілька біологічних реплікатів і яким вигідне використання пристрою VialTweeter для ультразвукової обробки в закритих пробірках у блоках з декількома пробірками, що дозволяє уникнути необхідності очищення зондів, скорочує час ручної роботи та забезпечує дотримання асептичних умов.
- Зустріч батьків з вчителями & Дослідники структурних білків: Дослідники, яким потрібна делікатна обробка з контролем температури для збереження нестійких модифікацій та забезпечення максимального охоплення послідовності під час лізису та гомогенізації клітин.
Мультисемплярний звуковий апарат “VialTweeter” для безконтактної підготовки зразків із декількох герметичних флаконів для протеоміки
Огляд протоколу: від тканин і клітин до пептидів, готових до МС-аналізу
Широко застосовуваний «знизу вгору» робочий процес у протеоміці, описаний Войткевичем та ін., забезпечує надійний та масштабований метод підготовки пептидних зразків із різноманітних біологічних матриць. Починаючи з 50–100 мг швидкозамороженої тканини або 1–20 мільйонів клітин, цей протокол використовує технологію уловлювання суспензії (S-Trap™) для ефективного видалення детергентів, солей та домішок перед ферментативним розщепленням.
Після лізису, кількісного визначення білків, відновлення та алкілування зразок підкислюють і завантажують у спін-колонку S-Trap™, де відбувається розщеплення трипсином/ліз-С. Отримані пептиди елююють, висушують і піддають аналізу методом LC-MS. При застосуванні до 50 мг тканини серця людини цей робочий процес стабільно забезпечує отримання кількості пептидів, достатньої для 30–40 ін’єкцій, що дозволяє ідентифікувати понад 4 000 унікальних білків за один цикл. Хоча хімічні процеси та очищення за допомогою колонок чітко визначені, успіх цього робочого процесу значною мірою залежить від початкових етапів фізичного руйнування та роботи з ДНК.
У протоколі рекомендується використовувати ультразвуковий лізисер VialTweeter Multi-Tube для лізису клітин та розриву ланцюгів ДНК за допомогою ультразвуку – Обидва етапи мають вирішальне значення для аналізу пептидів.
Прилад VialTweeter здійснює ультразвукову обробку герметичних пробірок Eppendorf об’ємом 1,0; 1,5 та 2,0 мл, а також різних пробірок NUNC
Ультразвуковий лізис клітин і тканин для екстракції білків
У робочому процесі протеоміки «знизу вгору» ультразвукова обробка є ключовим етапом лізису клітинних зразків для вилучення білків з метою подальшого аналізу методом мас-спектрометрії. Після додавання буферу для лізису клітин з SDS до клітинного осаду зразки піддають ультразвуковій обробці за допомогою ультразвукового апарату VialTweeter Multi-Tube Sonicator. У протоколі використовуються мікроцентрифужні пробірки об’ємом 1,5 мл, а ультразвуковий апарат налаштовується на роботу з потужністю 30 % у режимі «10 секунд увімкнено — 10 секунд вимкнено», що повторюється протягом 3 циклів. Після витримки 1 хвилини цикл повторюється ще двічі. Зразки постійно охолоджуються льодом.
Цей процес не тільки сприяє руйнуванню клітин, але й є особливо необхідним для подрібнення геномної ДНК, що вивільняється під час лізису. Ефективне подрібнення ДНК має вирішальне значення для зниження в’язкості зразка та запобігання засміченню колонок S-Trap™, що забезпечує оптимальний вихід білка та надійне подальше розщеплення пептидів.
Вирішальна роль ультразвукового розщеплення ДНК
Однією з найпоширеніших несправностей у робочих процесах на основі S-Trap™ є засмічення колонки, яке майже виключно спричиняється високомолекулярною геномною ДНК, що виділяється під час гомогенізації клітин або тканин. Непошкоджена ДНК різко підвищує в’язкість зразка, утримує пептиди та блокує мікропористе сорбентне шарове покриття S-Trap™.
Ультразвукова обробка вирішує цю проблему шляхом механічного роздроблення ДНК на дрібні розчинні фрагменти. Завдяки застосуванню контрольованої акустичної енергії пристрій VialTweeter ефективно розрізає нуклеїнові кислоти, не створюючи надмірного тепла та не вводячи сторонніх домішок. Таке зниження в’язкості забезпечує плавне завантаження зразків, стабільну швидкість протікання та безперебійну кінетику розщеплення.
Оптимізовані параметри ультразвукової обробки за допомогою VialTweeter
У протоколі визначено режим ультразвукової обробки з високим рівнем відтворюваності, оптимізований для збереження цілісності біологічних зразків та сумісності з подальшим масс-спектрометричним аналізом. Для зразків у мікроцентрифужних пробірках об’ємом 1,5 мл при використанні безконтактного блокового ультразвукового апарату Hielscher VialTweeter наступні параметри забезпечують лізис та оптимальне розщеплення ДНК із збереженням структури білків:
- Амплітуда: 30 % потужності
- Режим роботи: 10 секунд увімкнено / 10 секунд вимкнено
- Тривалість: 3 цикли (10 секунд увімкнено/10 секунд вимкнено) → 1 хвилина відпочинку на льоду → повторити ще 2 рази
- Контроль температури: під час обробки зразки поміщають на лід, щоб запобігти термічній денатурації та передчасній ферментативній активності
Такий підхід із використанням імпульсної ультразвукової обробки запобігає локальному перегріванню, мінімізує окислення пептидів та забезпечує рівномірний акустичний вплив на всі пробірки. Конструкція із закритими трубками також усуває необхідність очищення зонда між зразками, що значно скорочує час ручної роботи та зменшує вплив людського фактора.
Основні переваги для сучасних робочих процесів у протеоміці
Інтеграція VialTweeter у ваш робочий процес протеоміки за методом «знизу вгору» надає низку операційних та наукових переваг:
- Постійна фрагментація ДНК: Рівномірне розподілення акустичної енергії по всіх флаконах забезпечує відтворюване зниження в'язкості та запобігає коливанням у завантаженні S-Trap™ від партії до партії.
- Збереження лабільних модифікацій: Обробка при низькій температурі в льодяній ванні дозволяє зберегти посттрансляційні модифікації (ПТМ) та запобігає індукованій теплом агрегації білків під час лізису клітин.
- Оптимізована подальша обробка: Лізати, оброблені за допомогою VialTweeter, можна безпосередньо очищати шляхом центрифугування та визначати їхню концентрацію без додаткових етапів очищення, що прискорює процес гідролізу за допомогою S-Trap™.
- Масштабованість & Гнучкість: Одні й ті самі параметри ультразвукової обробки застосовуються як до зразків тканин високої складності, так і до клітинних суспензій, що забезпечує підтримку робочих процесів у галузі дослідницької протеоміки, цільового кількісного аналізу та глікопротеоміки. Ультразвукові апарати Hielscher для мікропланшетів дозволяють легко масштабувати обробку до великої кількості зразків у багатолункових мікропланшетах.
Безконтактний багатотрубний ультразвуковий пристрій VialTweeter можна використовувати в холодильних шафах
Ультразвукові апарати для підготовки проб до протеомного аналізу
Для підготовки високоякісних зразків пептидів до масс-спектрометрії потрібно не лише ефективний лізис – Це вимагає точного контролю над розрізанням ДНК, температурою та запобіганням забрудненню. Включивши пристрій Hielscher VialTweeter у ваш робочий процес протеоміки за методом «знизу вгору», ви зможете усунути засмічення S-Trap™, забезпечити відтворюваність вилучення білків та підтримати рівень чистоти, необхідний для чутливих аналізів методом мас-спектрометрії. Незалежно від того, чи обробляєте ви тканини людини, культивовані клітини чи складні лізати, ультразвукова обробка у блоках забезпечує надійність, масштабованість та контроль процесу, яких вимагають сучасні протеомічні лабораторії.
Щоб збільшити кількість зразків, скористайтеся моделями ультразвукових апаратів Hielscher для мікропланшетів з фокусованим безконтактним режимом роботи — UIP400MTP та UIP550MTP! Обробляйте будь-які стандартні багатолункові планшети для високопродуктивної протеоміки!
Обробка у закритих трубках порівняно з традиційними ультразвуковими апаратами з зондом
Історично склалося так, що для розриву ланцюгів ДНК дослідники використовували ультразвукові апарати з прямим контактом. Хоча такі системи є ефективними, вони мають кілька суттєвих обмежень у робочих процесах протеоміки:
- Ризик перехресного забруднення: Повторне використання зонда для аналізу кількох зразків призводить до перенесення аерозолю та потрапляння перехресних забруднень, що спотворює результати кількісного масс-спектрометричного аналізу.
- Втрата зразка: Пряме введення може призвести до розбризкування, випаровування та прилипання цінних пептидів до поверхні зонда.
- Прибирання: Ретельна деконтамінація зонда між серіями досліджень займає багато часу і часто проводиться неповно, що негативно позначається на результатах досліджень білків з низькою концентрацією.
Ультразвуковий процесор VialTweeter обробляє зразки повністю всередині герметичних мікроцентрифужних пробірок. Така конструкція із закритою системою виключає контакт зонда зі зразком, запобігає утворенню аерозолів та забезпечує дотримання суворих асептичних умов протягом усього процесу гомогенізації та лізису. Для лабораторій, що працюють із лізатами тканин високої складності або з декількома клітинними лініями, це означає отримання чистіших даних МС, вищий вихід пептидів та більш надійні біологічні реплікати.
Перехід до високопродуктивної підготовки зразків у багатолункових планшетах
З ультразвуковими апаратами для мікропланшетів моделей UIP400MTP та UIP550MTP, процес обробки пробірок можна легко масштабувати для високопродуктивної обробки зразків у будь-якій стандартній багатолунковій планшеті.
Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP для високопродуктивного виділення білків зі зразків
Поширені запитання щодо ультразвукової обробки при підготовці зразків пептидів
Чому перед обробкою пептидів за допомогою S-Trap™ необхідно провести ультразвукову обробку?
Ультразвукова обробка необхідна для розриву високомолекулярної геномної ДНК, що вивільняється під час лізису клітин або тканин. Непошкоджена ДНК різко підвищує в’язкість зразка, що може призвести до засмічення мікроколонки S-Trap™ та утримання пептидів у ній, що суттєво знижує вихід речовини та сумісність із масс-спектрометрією.
Чим ультразвуковий розбивач VialTweeter покращує підготовку зразків порівняно з традиційними ультразвуковими розбивачами з датчиком?
На відміну від ультразвукових апаратів із зондом прямого контакту, які вимагають ретельного очищення між циклами обробки та створюють ризик перенесення аерозолів, VialTweeter обробляє зразки повністю всередині герметичних флаконів та пробірок для мікроцентрифуги. Така конструкція із закритими пробірками виключає перехресне забруднення, запобігає втраті зразків та забезпечує дотримання суворих асептичних умов протягом усього процесу гомогенізації та лізису клітин.
Які параметри ультразвукової обробки є оптимальними для підготовки зразків для протеоміки?
Для біологічних зразків, таких як клітини та тканини, рекомендований протокол передбачає використання ультразвукового апарату VialTweeter на 30 % потужності з циклом «10 секунд увімкнено / 10 секунд вимкнено», який повторюється 3 рази. Під час обробки зразки слід тримати на льоду, а у разі обробки ≥5 мільйонів клітин цикл слід повторити ще двічі. (див. Wojtkiewicz et al., 2021)
Що робити, якщо колонка S-Trap™ забивається під час завантаження зразка?
Забивання колонки, як правило, спричиняється високою в’язкістю ДНК або недостатнім очищенням. Щоб вирішити цю проблему, перед піпетуванням ретельно відцентрифугуйте лізат і переконайтеся, що ДНК була належним чином розрізана за допомогою ультразвукової обробки.
Які переваги надає безконтактна ультразвукова обробка для робочих процесів у кількісній протеоміці?
У кількісних дослідженнях навіть незначне перехресне забруднення між зразками може спотворити результати вимірювання пептидів з низькою концентрацією. Технологія обробки декількох пробірок у закритих трубках, що застосовується в пристрої VialTweeter, виключає необхідність введення зонда, забезпечує відтворюваність результатів від партії до партії та зберігає цілісність зразків для проведення точних порівняльних аналізів.
Який вихід білка та глибину МС можна очікувати від цього протоколу?
Використовуючи як вихідний матеріал 50 мг тканини людського серця або 5 мільйонів клітин, технологічний процес S-Trap™ зазвичай дозволяє отримати кількість пептидів, достатню для 30–50 ін’єкцій у системі LC-MS, забезпечуючи стабільну ідентифікацію понад 4 000 унікальних білків за один цикл аналізу. (див. Wojtkiewicz et al., 2021)
Література / Список літератури
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Компанія Hielscher Ultrasonics постачає потужні безконтактні ультразвукові апарати для підготовки зразків та клінічного аналізу. Ультразвуковий апарат для багатолункових планшетів UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn та проточний ультразвуковий апарат GDmini2 обробляють зразки без фізичного контакту з ними.