Ультразвукова обробка в мікропланшетах для шотган-протеоміки – прикладна довідка

Шотган-протеоміка залежить від ефективної, відтворюваної підготовки зразків для перетворення складного біологічного матеріалу на пептиди, придатні для LC-MS/MS. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для мікропланшетів підтримує цей процес, забезпечуючи стандартизовану паралельну ультразвукову обробку зразків малого об’єму та допомагаючи лабораторіям поліпшити руйнування, екстракцію й повторне розчинення в робочих процесах із використанням мікропланшетів. У цій прикладній довідці описано, як UIP400MTP можна інтегрувати в підготовку зразків для протеоміки, на основі опублікованого робочого процесу дослідження позаклітинних везикул у межах досліджень PLA2G12A/Th17 як прикладу, перевіреного в лабораторії.

Ультразвукова обробка в мікропланшетах для підвищення відтворюваності шотган-протеоміки

Для дослідників у галузі протеоміки відтворювана підготовка зразків є критично важливою для отримання високоякісних даних LC-MS/MS. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для мікропланшетів забезпечує стандартизовану паралельну ультразвукову обробку в робочих процесах із використанням планшетів, а також у високопродуктивних робочих процесах зі зразками малого об’єму.

Він особливо корисний для лабораторій, які працюють із:

• Великими наборами зразків, що потребують однакової обробки в багатьох лунках
• Матеріалом, доступним в обмеженій кількості, коли необхідно мінімізувати втрату зразків і варіабельність
• Зразками з високим вмістом ліпідів, такими як позаклітинні везикули
• Складними біологічними препаратами, які потребують ефективного руйнування, екстракції або повторного розчинення
• Порівняльною шотган-протеомікою, для якої вкрай важлива відтворюваність за різних умов і між повторами

Інтегруючи ультразвукову обробку в мікропланшетах перед протеолітичним розщепленням, дослідники можуть поліпшити готовність зразків до:

• Екстракції та повторного розчинення білків
• Розщеплення трипсином/Lys-C
• Реєстрації даних за допомогою нано-LC/MS/MS
• Подальшого кількісного протеомного аналізу

Ультразвукова обробка в мікропланшетах може бути корисною для:

• Центрів колективного користування обладнанням для протеоміки
• Лабораторій дослідження позаклітинних везикул (EV)
• Лабораторій імунології та клітинної біології
• Груп трансляційних досліджень
• Команд у галузі наук про життя, які переходять від підготовки окремих зразків до робочих процесів із вищою пропускною здатністю

Високопродуктивна підготовка зразків для аналізу протеому позаклітинних везикул

Що таке шотган-протеоміка?

Шотган-протеоміка стала однією з основних аналітичних стратегій для характеристики складних біологічних зразків – від лізатів цілих клітин і тканинних екстрактів до очищених органел, позаклітинних везикул і клінічних зразків з обмеженою кількістю вихідного матеріалу. Її основна перевага полягає в поєднанні розщеплення білків, рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією високої роздільної здатності та обчислювального визначення білків за пептидними даними. Однак якість кінцевого набору протеомних даних визначається задовго до того, як зразок потрапляє до мас-спектрометра. Ефективне руйнування зразків, солюбілізація білків, видалення речовин, що заважають аналізу, відтворюване ферментативне розщеплення та надійне вилучення пептидів мають вирішальне значення для глибини охоплення протеому й достовірності кількісних результатів.
Для дослідників у галузі протеоміки та лабораторій наук про життя, які працюють зі зразками, доступними в обмеженій кількості або особливо цінними, підготовка зразків часто є вузьким місцем.

Складнощі роботи з позаклітинними везикулами в протеоміці

Наприклад, позаклітинні везикули (EV) становлять особливо складний для обробки клас зразків. Це оточені мембраною, багаті на ліпіди нанорозмірні частинки з відносно низьким виходом білка та високою ймовірністю перенесення ліпідів, солей, детергентів, сироваткових білків та інших компонентів матриці на наступні етапи. Ці особливості можуть негативно впливати на ефективність розщеплення, якість хроматографічного розділення, стабільність електророзпилення та ідентифікацію пептидів. Тому процес підготовки зразків для протеоміки EV має забезпечувати достатньо інтенсивний вплив для руйнування везикулярних структур і солюбілізації білкового вмісту, водночас залишаючись сумісним із подальшим ферментативним розщепленням та аналізом LC-MS/MS.
У цьому контексті ультразвукова обробка, сумісна з мікропланшетами, пропонує практичний підхід до відтворюваної паралельної обробки зразків. Моделі ультразвукових приладів Hielscher для мікропланшетів UIP400MTP (400 W) і UIP550MTP (550 W) призначені для ультразвукової обробки зразків у багатолункових планшетах і посудинах малого об’єму та забезпечують вищу пропускну здатність робочих процесів порівняно зі звичайними однозондовими ультразвуковими приладами. Для протеомних лабораторій цей формат привабливий тим, що може зменшувати варіабельність, пов’язану з ручними операціями, покращувати паралельну обробку кількох зразків і природніше інтегруватися в процеси підготовки зразків у планшетах.

Приклад робочого процесу

Нещодавно опублікований робочий процес протеомного аналізу позаклітинних везикул у дослідженні біології Th17-клітин, зумовленої PLA2G12A, є корисним, перевіреним у лабораторії прикладом того, як ультразвуковий пристрій для мікропланшетів UIP400MTP можна включити в підготовку зразків для шотган-протеоміки. У цій серії досліджень зразки EV готували до аналізу протеому шляхом обробки метанолом, ультразвукової обробки за допомогою UIP400MTP, центрифугування, висушування, розщеплення трипсином/Lys-C та рідинної хроматографії (LC) з нанопотоком у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (MS) високої роздільної здатності. Результати біологічного дослідження опублікували у 2026 році Mochizuki-Ono та колеги; протеомний аналіз допоміг охарактеризувати, як PLA2G12A змінює білковий вміст EV у контексті патогенних Т-клітинних відповідей.

Ультразвуковий пристрій для багатолункових планшетів UIP400MTP

Навіщо застосовувати ультразвукову обробку в мікропланшетах?
UIP400MTP забезпечує стандартизовану паралельну ультразвукову обробку зразків малого об’єму. Це корисно, коли важливі відтворюваність, мала вихідна кількість зразка та висока пропускна здатність обробки багатьох зразків.


Контрольний список для перевірки якості

• Підтвердьте однакову вихідну кількість EV у білковому еквіваленті для всіх зразків.
• Використовуйте рандомізовані або збалансовані схеми розміщення зразків для обробки.
• Підтримуйте однакові об’єм метанолу, тривалість ультразвукової обробки, тривалість висушування та об’єм реакційної суміші для протеолізу.
• Відстежуйте вихід пептидів і загальну кількість ідентифікованих білків.
• Перевіряйте частку пропущених сайтів розщеплення та розподіл довжин пептидів.
• Перевіряйте форму хроматографічних піків і відтворюваність часу утримування.
• Включайте холості проби для контролю перенесення залишків між зразками.
• Для масштабніших досліджень використовуйте об’єднані зразки контролю якості.
• Оцінюйте коефіцієнт варіації між повторностями.
• Використовуйте PCA або споріднені методи для виявлення ефектів партії чи зразків із викидами.

Рекомендації щодо документування

Публікуючи або документуючи цей робочий процес, зазначайте вихідну кількість EV, формат планшета, об’єм метанолу, амплітуду та тривалість ультразвукової обробки за допомогою UIP400MTP, умови центрифугування, метод висушування, буфер для протеолізу, концентрацію ферментів, тривалість протеолізу, умови підкислення, платформу LC-MS/MS, режим реєстрації даних, версію програмного забезпечення, базу даних, порогове значення FDR, метод нормалізації та робочий процес статистичного аналізу.
Усі ультразвукові апарати Hielscher для мікропланшетів автоматично записують важливі параметри процесу, як-от амплітуду, тривалість ультразвукової обробки та температуру, з позначкою дати й часу у файл CVS на вбудованій SD-карті. Протоколювання даних для забезпечення відтворюваності та контролю якості ще ніколи не було таким простим!

Дослідження в деталях: шотган-протеоміка позаклітинних везикул у дослідженні PLA2G12A

Дослідження PLA2G12A є конкретним прикладом використання UIP400MTP у робочому процесі шотган-протеоміки. Біологічне питання полягало в тому, як секретована фосфоліпаза PLA2G12A модифікує позаклітинні везикули, що походять із клітин Th17, і тим самим впливає на диференціювання патогенних Т-клітин. Автори показали, що PLA2G12A діє на мембрани EV, спричиняючи утворення лізофосфоліпідів, зокрема 1-олеоїл-лізофосфатидилетаноламіну, і що подальша передача сигналів лізофосфатидної кислоти через LPA2 сприяє диференціюванню Th17. Окрім ліпідної сигналізації, у дослідженнях також вивчали вміст EV, зокрема вміст RNA і білків, що зробило шотган-протеоміку важливим компонентом стратегії визначення їхніх характеристик.
У робочому процесі підготовки EV клітини Th17 культивували в середовищі, що містило фетальну бичачу сироватку, збіднену на екзосоми. Супернатанти культур спочатку центрифугували для видалення клітин, фільтрували через фільтр 0,22 µm, концентрували шляхом ультрафільтрації/ультрацентрифугування, промивали, ресуспендували в PBS і визначали кількісний вміст білка методом BCA. Така попередня підготовка EV забезпечувала можливість введення в протеомний робочий процес визначеної кількості матеріалу EV за білковим еквівалентом.
Для шотган-протеомного аналізу автори використовували зразки EV, що відповідали 5 µg білкового еквівалента. Ці зразки висушували в пробірках для PCR і додавали 25 µL метанолу. Потім зразки обробляли ультразвуком протягом 3 хвилин за допомогою ультразвукового пристрою для мікропланшетів UIP400MTP. Після ультразвукової обробки зразки центрифугували за температури 4°C протягом 20 хвилин при 19 000 × g. Після видалення 20 µL супернатанту зразки центрифугували до повного висихання. Потім білки розчиняли за допомогою ультразвукової обробки в 4 µL розчину трипсину/Lys-C із концентрацією 100 ng/µL у 50 mM гідрогенкарбонаті амонію. Розщеплення проводили протягом 2 годин за температури 37°C зі струшуванням при 300 rpm. Гідролізат підкислювали 1 µL 1,25% трифтороцтової кислоти та піддавали аналізу методом рідинної хроматографії (LC) з нанопотоком у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією високої роздільної здатності.
Цей робочий процес ілюструє кілька корисних принципів протеомного аналізу EV за малої вихідної кількості матеріалу. По-перше, вихідну кількість нормалізували за білковим еквівалентом, що важливо для порівняння EV із різних генотипів або після різних обробок. По-друге, перед ультразвуковою обробкою використовували метанол, який сприяв руйнуванню та екстракції й давав змогу уникнути систем із детергентами, що можуть ускладнювати LC-MS/MS. По-третє, етап ультразвукової обробки був коротким і стандартизованим, що сумісно з паралельною обробкою зразків. По-четверте, розщеплення трипсином/Lys-C проводили в дуже малому об’ємі, що зменшувало розведення та сприяло вилученню пептидів за малої вихідної кількості матеріалу. Нарешті, безпосередній перехід від розщеплення до підкислення та LC-MS/MS мінімізував непотрібні маніпуляції зі зразками.
Для подальшого аналізу методом LC-MS/MS використовували обернено-фазове розділення з нанопотоком у поєднанні з мас-спектрометром Q-Exactive HF Orbitrap. Зразки утримували на передколонці C18, а потім розділяли на аналітичній колонці з внутрішнім діаметром 50 µm за об’ємної витрати 200 nL/min і температури 40°C. Упродовж 60 хвилин градієнт змінювали від низького вмісту органічного розчинника до 35% розчинника B, після чого проводили промивання за високого вмісту органічного розчинника та повторне врівноваження. Мас-спектрометричні дані (MS) реєстрували в режимі позитивних іонів із використанням незалежного від даних збору та дисоціації внаслідок зіткнень за підвищеної енергії. Файли первинних даних DIA аналізували за допомогою DIA-NN 1.8 зі спектральною бібліотекою, передбаченою in silico.