Ультразвукова обробка мікропланшетів у протеоміці методом «шотган» – Рекомендації щодо застосування

Протеоміка методом «Shotgun» залежить від ефективної та відтворюваної підготовки зразків, яка дозволяє перетворити складний біологічний матеріал на пептиди, готові до аналізу методом LC-MS/MS. Ультразвуковий апарат для мікропланшетів UIP400MTP підтримує цей процес, забезпечуючи стандартизовану паралельну обробку ультразвуком зразків малого об’єму, що допомагає лабораторіям покращити розбивання, екстракцію та повторне розчинення в робочих процесах на основі мікропланшетів. У цій примітці щодо застосування описано, як прилад UIP400MTP можна інтегрувати в процес підготовки проб для протеоміки, використовуючи опублікований робочий процес з позаклітинними везикулами, розроблений на основі досліджень PLA2G12A/Th17, як приклад, перевірений у лабораторних умовах.

Ультразвукова обробка мікропланшетів для підвищення відтворюваності методу «шотган»-протеоміки

Для дослідників у галузі протеоміки відтворюваність процесу підготовки зразків має вирішальне значення для отримання високоякісних даних LC-MS/MS. Ультразвуковий апарат для мікропланшетів UIP400MTP забезпечує стандартизовану паралельну обробку ультразвуком у робочих процесах із використанням мікропланшетів та у робочих процесах з малими об’ємами та високою пропускною здатністю.

Це особливо корисно для лабораторій, які працюють з:

• Великі набори зразків, які потребують однакової обробки у багатьох лунках
• Матеріал з обмеженим обсягом вхідних даних, у якому необхідно мінімізувати втрати зразків та варіативність
• Зразки з високим вмістом ліпідів, такі як позаклітинні везикули
• Складні біологічні препарати, які потребують ефективного руйнування, екстракції або повторного розчинення
• Порівняльна протеоміка методом «шотган», де відтворюваність результатів у різних умовах та повторах має вирішальне значення

Завдяки впровадженню ультразвукової обробки мікропланшетів перед розщепленням дослідники можуть покращити підготовку зразків до:

• Вилучення та повторна розчинення білків
• Розщеплення трипсином/Lys-C
• Збір даних методом нано-LC/MS/MS
• Кількісний аналіз протеоміки на наступних етапах

 

Без побоювань збільшуйте обсяги підготовки зразків для протеоміки!
Дізнайтеся, як ультразвукова обробка мікропланшетів допомагає зменшити варіабельність ручних операцій, покращити руйнування зразків та підготувати складні біологічні зразки до надійного аналізу методом LC-MS/MS.

Інформаційний запит


Адреса електронної пошти (обов'язково)


Продукт або сфера інтересів



Я згоден з Політикою конфіденційності









Зробити запит інформації

Ультразвукова обробка мікропланшетів може бути корисною для:

• Базові лабораторії з протеоміки
• Дослідницькі лабораторії з електромобілів
• Лабораторії імунології та клітинної біології
• Групи, що займаються трансляційними дослідженнями
• Команди, що працюють у галузі наук про життя, які переходять від підготовки окремих зразків до робочих процесів із вищою пропускною здатністю

Підготовка зразків з високою пропускною здатністю для аналізу протеому позаклітинних везикул

Що таке «протеоміка методом Shotgun»?

Протеоміка методом «шотган» стала основною аналітичною стратегією для характеристики складних біологічних зразків — від лізатів цілих клітин і тканинних екстрактів до очищених органел, позаклітинних везикул та клінічних зразків з низькою концентрацією. Її головна перевага полягає в поєднанні розщеплення білків, рідинної хроматографії з високою роздільною здатністю в поєднанні з тандемною мас-спектрометрією та обчислювального визначення білків на основі пептидів. Однак якість кінцевого набору даних про протеом визначається задовго до того, як зразок потрапляє до мас-спектрометра. Ефективне руйнування зразка, розчинення білків, видалення речовин, що створюють перешкоди, відтворюване ферментативне розщеплення та надійне вилучення пептидів — все це має вирішальне значення для глибини охоплення та надійності кількісних результатів.
Для дослідників у галузі протеоміки та лабораторій біологічних наук, які працюють з обмеженою кількістю або цінними зразками, підготовка зразків часто стає «вузьким місцем».

Проблеми, пов’язані з позаклітинними везикулами в протеоміці

Наприклад, позаклітинні везикули (EV) становлять особливо складний клас зразків. Це мембранні нанорозмірні частинки з високим вмістом ліпідів, що характеризуються відносно низьким виходом білка та високим ризиком перенесення ліпідів, солей, детергентів, сироваткових білків та інших компонентів матриці. Ці особливості можуть негативно впливати на ефективність гідролізу, хроматографічні показники, стабільність під час електроспреювання та ідентифікацію пептидів. Тому робочий процес підготовки зразків для протеоміки EV повинен бути достатньо інтенсивним, щоб руйнувати структури везикул і розчиняти білковий вміст, залишаючись при цьому сумісним з подальшим ферментативним гідролізом та аналізом методом LC-MS/MS.
У цьому контексті ультразвукова обробка, сумісна з мікропланшетами, пропонує практичний підхід до відтворюваної та паралельної обробки зразків. Моделі ультразвукових апаратів Hielscher для мікропланшетів UIP400MTP (400 Вт) та UIP550MTP (550 Вт) призначені для обробки зразків у багатолункових планшетах та посудинах малого об’єму, забезпечуючи більш високу пропускну здатність, ніж традиційні ультразвукові апарати з одним датчиком. Для лабораторій протеоміки цей формат є привабливим, оскільки він дозволяє зменшити варіативність, пов’язану з ручною обробкою, покращити паралельну обробку декількох зразків та більш органічно інтегруватися в конвеєри підготовки зразків на основі мікропланшетів.

Приклад робочого процесу

Нещодавно розроблений протокол протеомічного аналізу позаклітинних везикул у дослідженні біології клітин Th17, індукованих PLA2G12A, є корисним, перевіреним у лабораторних умовах прикладом того, як ультразвуковий розбивач для мікропланшетів UIP400MTP можна використовувати під час підготовки зразків для протеомічного аналізу методом «шотган». У цій серії досліджень зразки екстраклітинних везикул (EV) обробляли для протеомного аналізу за допомогою обробки метанолом, ультразвукової обробки на UIP400MTP, центрифугування, сушіння, перетравлення трипсином/Lys-C та нанопотокової рідинної хроматографії (LC) з тандемною масс-спектрометрією високої роздільної здатності. Про цю біологічну роботу спочатку було повідомлено у вигляді препринта на bioRxiv, а згодом опубліковано в журналі «Cell Reports», де протеомний аналіз допоміг охарактеризувати, як PLA2G12A змінює білки-вантаж екзосоми в контексті патогенних Т-клітинних реакцій.

Багатолунковий пластинчастий сонник UIP400MTP

Чому саме ультразвукова обробка мікропланшетів?
Прилад UIP400MTP дозволяє проводити стандартизовану паралельну обробку ультразвуком зразків невеликого об’єму. Це корисно в тих випадках, коли важливими є відтворюваність результатів, невеликий об’єм вхідного зразка та пропускна здатність для обробки великої кількості зразків.

Перелік питань для контролю якості

• Переконайтеся, що кількість білкового еквівалента EV у всіх зразках однакова.
• Використовуйте схеми обробки вибірки, що базуються на рандомізації або збалансованості.
• Об’єм метанолу, час обробки ультразвуком, час сушіння та об’єм розчинення повинні залишатися незмінними.
• Відстежуйте вихід пептидів та ідентифікацію загального білка.
• Перевірте рівень пропущених розщеплень та розподіл пептидів за довжиною.
• Перевірте форму хроматографічного піку та відтворюваність часу утримання.
• Включіть порожні рядки для контролю перенесення даних.
• У великих дослідженнях використовуйте об’єднані зразки для контролю якості.
• Оцініть коефіцієнт варіації для повторних вимірювань.
• Використовуйте PCA або подібні методи для виявлення ефектів партії або відхилень у зразках.

Рекомендації щодо ведення протоколів

Під час публікації або документування цього робочого процесу вказуйте кількість вхідного ЕВ, формат пластин, об’єм метанолу, амплітуду та час ультразвукової обробки на апараті UIP400MTP, умови центрифугування, метод сушіння, буфер для розщеплення, концентрацію ферменту, час розщеплення, умови підкислення, платформу LC-MS/MS, режим збору даних, версію програмного забезпечення, базу даних, поріг FDR, метод нормалізації та статистичний робочий процес.
Усі ультразвукові апарати для мікропланшетів компанії Hielscher автоматично записують важливі параметри процесу, такі як амплітуда, тривалість обробки ультразвуком та температура, із зазначенням дати та часу у вигляді файлу у форматі CSV на вбудовану SD-карту. Ведення протоколів даних для забезпечення відтворюваності та контролю якості ще ніколи не було таким простим!

Детальний аналіз дослідження: протеоміка EV-шотганів у дослідженні PLA2G12A

Дослідження PLA2G12A є конкретним прикладом використання UIP400MTP у робочому процесі «шотган-протеоміки». Біологічне питання полягало в тому, як секретована фосфоліпаза PLA2G12A модифікує позаклітинні везикули, що походять від клітин Th17, і тим самим впливає на диференціацію патогенних Т-клітин. Автори продемонстрували, що PLA2G12A діє на мембрани екстраклітинних везикул (EV), утворюючи лізофосфоліпіди, зокрема 1-олеоїл-лізофосфатидилетаноламін, і що подальша передача сигналів лізофосфатидної кислоти через LPA2 сприяє диференціації Th17. Окрім ліпідної сигналізації, у ході досліджень також вивчався вміст екстрацелюлярних везикул, зокрема РНК та білків, що зробило протеоміку методом «шотган» важливою складовою стратегії характеристики.
У процесі підготовки EV клітини Th17 культивували в середовищі, що містило фетальну бичачу сироватку, з якої було видалено екзосоми. Супернатанти культивування спочатку центрифугували для видалення клітин, фільтрували через фільтр 0,22 мкм, концентрували методом ультрафільтрації/ультрацентрифугування, промивали, ресуспендували в PBS та кількісно визначали за допомогою білкового аналізу BCA. Така попередня підготовка ЕВ гарантувала, що в робочий процес протеоміки можна було перенести визначену кількість матеріалу ЕВ, еквівалентну певному об’єму білка.
Для протеомного аналізу методом «шотган» автори використовували зразки EV, що відповідали 5 мкг еквівалентів білка. Ці зразки висушували в ПЛР-пробірках, після чого додавали 25 мкл метанолу. Потім зразки піддавали ультразвуковій обробці протягом 3 хвилин за допомогою ультразвукового апарату для мікропланшетів UIP400MTP. Після ультразвукової обробки зразки центрифугували при 4 °C протягом 20 хвилин при 19 000 × g. Після видалення 20 мкл супернатанту зразки центрифугували до повного висушування. Потім білки розчиняли ультразвуковим обробленням у 4 мкл розчину трипсину/Lys-C з концентрацією 100 нг/мкл у 50 мМ розчині бікарбонату амонію. Розщеплення проводили протягом 2 годин при 37 °C з перемішуванням зі швидкістю 300 об/хв. Продукт розщеплення підкислювали 1 мкл 1,25 % трифтороцтової кислоти та піддавали аналізу методом нанопотокової рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією високої роздільної здатності.
Цей робочий процес висвітлює кілька корисних принципів для протеоміки екзосоми з невеликим обсягом вихідного матеріалу. По-перше, вихідний матеріал було нормалізовано за еквівалентом білка, що є важливим при порівнянні екзосом різних генотипів або з різних груп лікування. По-друге, перед ультразвуковим розбиванням використовували метанол, що сприяло руйнуванню та екстракції, дозволяючи уникнути застосування детергентних систем, які можуть ускладнити LC-MS/MS. По-третє, етап ультразвукової обробки був коротким і стандартизованим, що дозволяє проводити паралельну обробку зразків. По-четверте, розщеплення трипсином/Lys-C здійснювалося в дуже малому об’ємі, що зменшило розведення та сприяло відновленню пептидів при малій кількості вихідного матеріалу. Нарешті, прямий перехід від розщеплення до підкислення та LC-MS/MS мінімізував зайві етапи обробки.
У подальшому етапі методу LC-MS/MS використовувалося нанопотокове розділення на оборотній фазі в поєднанні з мас-спектрометром Q-Exactive HF Orbitrap. Зразки утримувалися на попередній колонці C18, а потім розділялися на аналітичній колонці з внутрішнім діаметром 50 мкм при швидкості потоку 200 нл/хв і температурі 40 °C. Градієнт змінювався від низького вмісту органічного розчинника до 35 % розчинника B протягом 60 хвилин, після чого проводилося промивання розчином з високим вмістом органіки та повторне встановлення рівноваги. Збір даних MS здійснювався в режимі позитивних іонів із використанням незалежного від даних збору даних із колізійною дисоціацією з вищою енергією. Сирі файли DIA аналізували за допомогою програми DIA-NN 1.8 з використанням бібліотеки спектрів, передбачених in silico.